CFGS PRP Riesgos Químicos y Biológicos

Unidad 5.

DETECCIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS

CONTAMINANTES

1. IDENTIFICACCIÓN Y EVALUACIÓN DE RIESGOS POR ABC:

• NORMATIVA:

El RD 664/1997 dice “identificados uno o más riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos
durante el trabajo, se procederá, para aquellos que no hayan podido evitarse, a evaluar los mismos
determinando la naturaleza, el grado y duración de la exposición de los trabajadores”.

“Cuando se trate de trabajos que impliquen la exposición a varias categorías de agentes biológicos, los
riesgos se evaluarán basándose en el peligro que supongan todos los agentes biológicos presentes”.

 IDENTIFICACIÓN DE RIESGOS POR AGENTES BIOLÓGICOS:

*La presencia de un agente biológico puede ocurrir siempre que se produzca alguna de las siguientes
circunstancias:
- Se utiliza o manipula en el proceso laboral, del que forma parte y es objeto principal del trabajo.
- No se utiliza ni se manipula, pero puede estar infectando personas, animales o materiales y liberarse
al ambiente en el transcurso de la actividad laboral.
- Penetra desde el exterior por alguna vía (aire, agua, etc.) con colonización y proliferación del agente
en el lugar de trabajo.

*En las actividades con intención deliberada de utilizar agentes biológicos su presencia es evidente puesto
que el agente biológico forma parte esencial del proceso.

*En las actividades sin intención deliberada de utilizar agentes biológicos, para determinar su presencia
es fundamental disponer de información sobre los siguientes aspectos:
- El tipo de actividad laboral desarrollada.
- Los agentes biológicos típicamente asociados a esa actividad (presencia teórica).
- Los materiales implicados en el proceso productivo.
- Los procedimientos y los equipos de trabajo utilizados en el mismo.
- Las características de las instalaciones y del lugar de trabajo.

*Al término del proceso de análisis de esta información, se pueden dar las siguientes 3 situaciones:
1. Existe incertidumbre sobre la presencia de ABC  Evaluación atendiendo al “principio de precaución”.
2. No se identifica riesgo por ABC  Evaluación concluida de riesgos por exposición a ABC.
3. Identificada la presencia de ABC en el lugar de trabajo  Intentar eliminar este riesgo (sustitución).
Si no es posible, valorar el riesgo de exposición.

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 SUSTITUCIÓN DE AGENTES BIOLÓGICOS PELIGROSOS:

“Siempre que sea técnicamente posible y se disponga de una alternativa científica, se debe evitar la
utilización de agentes biológicos peligrosos sustituyéndolos por otros agentes que no sean peligrosos,
o lo sean en menor grado”.

- Si finalmente no se adopta esta medida preventiva de sustitución del agente biológico, se deberá
justificar la imposibilidad técnica o científica por la que no se lleva a cabo.

 EVALUACIÓN DEL RIESGO POR AGENTES BIOLÓGICOS:

*La evaluación de riesgos biológicos debe determinar la siguiente información:

- Naturaleza de la exposición: Agente biológico y grupo al que pertenece.
- Grado de exposición: Cantidad manipulada o concentración ambiental de agentes biológicos.
- Duración de la exposición: Tiempo que el trabajador está expuesto a una determinada cantidad o
concentración.

*La evaluación se efectuará teniendo en cuenta toda la información disponible y, en particular:

a) La naturaleza de los agentes biológicos a los que estén o puedan estar expuestos los trabajadores y
el grupo a que pertenecen.

b) Las recomendaciones de las autoridades sanitarias sobre la conveniencia de controlar el agente

biológico a fin de proteger la salud de los trabajadores.

c) La información sobre las enfermedades susceptibles de ser contraídas por los trabajadores como
resultado de su actividad profesional.

d) Los efectos potenciales, tanto alérgicos como tóxicos, que puedan derivarse de la actividad
profesional de los trabajadores.

e) El conocimiento de una enfermedad que se haya detectado en un trabajador y que esté

directamente ligada a su trabajo.

f) El riesgo adicional para aquellos trabajadores especialmente sensibles (patologías previas,

medicación, trastornos inmunitarios, embarazo o lactancia).

*Esta evaluación deberá repetirse periódicamente y además:

- Cada vez que se produzca un cambio en las condiciones que pueda afectar a la exposición.
- Cuando se detecte en algún trabajador una infección o enfermedad que se sospeche que sea
consecuencia de una exposición a agentes biológicos en el trabajo.

*Metodología de evaluación de riesgos biológicos:

En el RD 664/1997, y dado que no se dispone de límites de exposición profesional para estos

agentes, no se establece una metodología cuantitativa para la valoración de la exposición.

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 *Medición ambiental de agentes biológicos:

*En actividades con intención deliberada de utilizar agentes biológicos:

- La medición ambiental no suele tener excesivo interés para la valoración del nivel de riesgo.
- Sí supone una herramienta eficaz para verificar que no existen “fugas” del agente biológico.

*En actividades sin intención deliberada de utilizar agentes biológicos, la determinación ambiental
puede ser de utilidad para lo siguiente:
1) Comprobar la presencia de determinados agentes biológicos en el lugar de trabajo.
2) Identificar fuentes de contaminación.
3) Conocer la intensidad de la exposición y del riesgo de exposición por inhalación.
4) Verificar la eficacia de las medidas preventivas adoptadas en cada situación.

2. TÉCNICAS DE MUESTREO DE AMBIENTE Y SUPERFICIES PARA AGENTES

BIOLÓGICOS CONTAMINANTES:

 CRITERIOS DE TOMA DE MUESTRAS DE CONTAMINANTES BIOLÓGICOS :

La siguiente tabla es un ejemplo de criterio para la toma de muestras de contaminantes biológicos en

diferentes sectores de producción:

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 TÉCNICAS DE MUESTREO AMBIENTAL DE AGENTES BIOLÓGICOS :

*Bioaerosoles: “Contaminantes ambientales de procedencia biológica”.

- Constituidos por las partículas, las moléculas de tamaño grande, o los compuestos orgánicos volátiles
que están vivos o que proceden de un organismo vivo.
- En ellos se pueden encontrar:
Microorganismos (cultivables, contables y los microorganismos muertos).
Fragmentos, toxinas y partículas producto de los desechos, cuyo origen es la materia viva.

- Los aerosoles son captados al producirse la separación de las partículas que lo forman por la acción de
distintas fuerzas físicas.

- Podemos diferenciar 2 técnicas de muestreo ambiental de agentes biológicos: Impactación inercial.

Filtración.

*Impactación inercial: La inercia de las partículas está determinada por su masa y su velocidad.

*El fundamento de los equipos inerciales de recogida de muestra ambiental por es el siguiente:

1. La corriente de aire, penetra a través del dispositivo de entrada.

2. En la zona de captación, la corriente de aire es obligada a cambiar de dirección.

3. Las partículas contenidas en ella, con suficiente inercia, son separadas del flujo de aire impactando
sobre una superficie que puede ser un sólido o un líquido.

*Filtración: “Captación de las partículas suspendidas en el aire al quedar retenidas en un material

poroso cuando el aire lo atraviesa”.

*La captación por filtración depende de: Diámetro de la partícula.

Tamaño del poro del filtro.
Caudal de aire que atraviesa el filtro.

*Se pueden distinguir 4 principios de captación de partículas:

1. Tamizado: Cuando el diámetro de la partícula es mayor que el tamaño del poro del filtro.

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 2. Interceptación: Las partículas de pequeño tamaño pasan lo suficientemente cerca para ser
retenidas debido a su carga electrostática, entre otros factores.

3. Impactación: La inercia fuerza la separación de las partículas de sus líneas de flujo de aire
cuando éstas se dividen al chocar con las fibras del filtro.

4. Difusión: La retención ocurre cuando las partículas chocan con las fibras por azar.

 EQUIPOS DE MUESTREO AMBIENTAL DE AGENTES BIOLÓGICOS :

*EQUIPOS IMPACTADORES:

*Muestreador de rendija:

- El aire penetra a través de rendijas, y es impulsado sobre la superficie de impactación.

- La superficie de impactación consta de:

*Una placa con medio de cultivo: Para la incubación, recuento de colonias e identificación.
*Un portaobjetos: Permite la observación directa al microscopio de las partículas captadas.

- Los soportes de captación pueden estar estáticos o colocados sobre un soporte giratorio.

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 *Muestreador Andersen:

- Es un impactador en cascada que capta las partículas en una serie de placas con medio de cultivo.

- Tiene 6 niveles de captación:

Cada nivel está separado del siguiente por un elemento perforado (con diametros menguantes).
Debajo de cada elemento perforado se coloca la placa con medio de cultivo.

- La captación se basa en la inercia de las partículas:

En el primer nivel se separan las partículas de mayor tamaño y así sucesivamente.
El resultado final es una separación por tamaño de partícula.

*Frascos borboteadores (Impingers):

- Conducen una corriente de aire al interior de un frasco que contiene un medio de captación líquido.

- Las partículas son transferidas por: Impactación inercial.

Dispersión en las burbujas formadas en la zona de impactación.

- Como líquido de captación puede utilizarse: Agua destilada.

Soluciones salinas tamponadas.
Medios de cultivo diluidos.

- A estos líquidos se les añaden los aditivos que se consideren necesarios para mejorar la supervivencia.

- Hay diseños de un solo nivel de captación y otros diseños multinivel.

- Ventajas: Con una muestra se pueden realizar diferentes ensayos o determinar diferentes componentes.
Las muestras obtenidas permiten el recuento del número total de partículas.
Mediante filtración se pueden concentrar las partículas.

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*EQUIPOS MUESTREADORES CENTRÍFUGOS:

*Ciclones lavadores:

- La captación ocurre por impactación en un medio líquido que baña la superficie interior del ciclón,
potenciada por la acción de la fuerza centrífuga.

- El líquido con las partículas es retirado por la parte inferior del equipo.

*Muestreador RCS (Reuter Centrifugal Sampler):

- Equipo portátil en el que la impactación es potenciada por la fuerza centrífuga que un ventilador
confiere al aire aspirado en la zona frontal del equipo.

- Las partículas son recogidas en cintas flexibles con pocillos que contienen medio de cultivo.

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*EQUIPOS MUESTREADORES CON FILTRO:

- La filtración es uno de los sistemas que permite tomar muestras personales que representan mejor el
patrón de exposición de los trabajadores.

- El equipo de toma de muestras consiste en: Una bomba de aspiración de aire.

El portafiltro, normalmente casetes de poliestireno.
El filtro.

*Filtros capilares:

- Los filtros capilares están hechos de una fina capa de policarbonato.

- Los poros consisten en cilindros rectos alineados de forma perpendicular a la superficie del filtro.

- Eficacia de captación: partículas submicrónicas (< 1 µm)  son retenidas por difusión.
partículas de tamaño inferior al poro  eficacia baja.
partículas de tamaño mayor que el poro  gran eficacia.

- Se colmatan antes que otros con el mismo tamaño de poro (limita la cantidad que puede recoger).

- Idóneos para la observación de las partículas captadas al microscopio óptico.

- Fácil lavado del filtro y recuperación de la muestra para su análisis.

*Filtros de membrana:

- Tienen una microestructura que proporciona caminos irregulares o tortuosos al flujo de aire.

- La eficacia de captación es bastante elevada, incluso para partículas de tamaño inferior al del poro.

- Los materiales de los que están hechos los son variados (para bioaerosoles  ésteres de celulosa).

- Las muestras se pueden teñir sobre los mismos filtros para su observación directa al microscopio.
(el filtro se puede trasparentar con un producto adecuado como fase previa a la observación)

- Se pueden colocar sobre medio de cultivo para la incubación de los microorganismos captados.

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 TÉCNICAS DE MUESTREO DE MATERIALES Y SUPERFÍCIES:

- Estas técnicas tiene un interés especial puesto que permite determinar la posible contaminación por
agentes biológicos de: Las materias primas,
El polvo,
Las propias personas,
Los instrumentos de trabajo,
Las ropas,
Las manos,
El mobiliario,
Los elementos de construcción.

- Todos los elementos anteriores pueden convertirse en reservorios de agentes biológicos.

- Estas técnicas de muestreo se justifican porque:

La simple medición ambiental puede, en ocasiones, proporcionar falsos negativos.
Permiten identificar los focos de contaminación.
Puede eliminar la necesidad de realizar un muestreo ambiental.

*FROTIS DE SUPERFÍCIES:

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- Consiste en la recogida del material depositado en las superficies con torundas estériles de algodón o gasas.

- Estos elementos pueden ser humedecidos con agua estéril para facilitar la captación de las partículas.

- Las muestras tomadas deben ser manipuladas en un modo aséptico para evitar cualquier contaminación.

- Se puede proceder a la siembra aplicando directamente la torunda sobre el medio de cultivo.

- También se puede proceder al lavado de la torunda con un diluyente estéril y sembrar el líquido obtenido.

- En general, este método no permite realizar estimaciones cuantitativas precisas de la contaminación.

- Se utiliza para comprobar la presencia de un microorganismo concreto.

*MUESTREOS POR CONTACTO:

- Son los métodos más utilizados.

- Consisten en la aplicación de medios de cultivo sobre la superficie que se desea muestrear y sobre las que
se ejerce una ligera presión para captar las partículas.

*Placas de contacto:

- Son placas de cultivo especiales en las que el medio de cultivo está en ligero exceso.

- En la base de estas placas está grabada una cuadrícula, de superficie determinada que permitirá el
cálculo de la concentración de los microorganismos que han formado colonia.

- El resultado se expresa en unidades formadoras de colonias por cm2 (ufc/cm2)

- La principal ventaja de este método es su sencillez.

- Inconveniente: superficies muy sucias provocan sobrecarga de la placa y dificultan el recuento.

- Las más utilizadas son las llamadas placas RODAC.

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 *Cintas adhesivas:

- Están indicadas cuando no se precisa información sobre los microorganismos viables y cultivables.

- El método es muy sencillo y consiste en atrapar en la cinta las partículas depositadas en una superficie.

- El análisis consiste en la observación al microscopio, por lo que el material de la cinta debe tener una
buena calidad óptica y permitir la tinción.

- Este método no permite análisis cuantitativos.

3. TÉCNICAS DE ANÁLISIS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE

AGENTES BIOLÓGICOS CONTAMINANTES:

 ELECCIÓN DEL MÉTODO DE ANÁLISIS:

Dependiendo del objetivo de la medición se pueden distinguir 3 métodos de estudio:

*Estudios generales:

- El objetivo es conocer, de la forma más amplia que sea posible, los diferentes tipos de agentes
biológicos que pueden estar presentes.

- Son de aplicación cuando se desconoce la composición (tipos y concentraciones) de agentes

biológicos ligados a la actividad laboral.

- Los métodos más comúnmente empleados en la actualidad son:

Cultivo de los microorganismos en medio gelatinoso (agar).
Observación directa al microscopio.
Evaluación de la diversidad microbiana.

*Estudios de indicadores:

- En este caso el agente biológico de interés es conocido.

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 - Para su análisis se ha seleccionado alguno de los indicadores que son representativos de la
presencia de grandes grupos de microorganismos.

Ej. Análisis de glucanos o de ergosterol como indicadores de la biomasa fúngica.

Determinación de guanina como indicador de la presencia de ácaros en el polvo doméstico.

*Estudios focalizados:

- Permiten documentar la presencia de un agente biológico asociado a efectos concretos.

- La elección de este tipo de estudios parte de una hipótesis sobre la existencia de un agente
específico en un ambiente.

- La hipótesis puede estar basada en:

Observación de efectos concretos asociados al agente en cuestión.
Existencia de condiciones ambientales que permitan sospechar la presencia del agente.

Ejemplo: Estudio de un brote de legionelosis

Los análisis estarán dirigidos a la detección de Legionella en muestras de agua y clínicas.
Deberán incluir el cultivo y aislamiento de la bacteria en:
Muestras de agua de las instalaciones implicadas.
Muestras biológicas obtenidas de las personas potencialmente infectadas.

 CULTIVO DE MICROORGANISMOS (BACTERIAS Y HONGOS):

*Microorganismo “vivo”: Aquel que es capaz de formar una colonia en un medio nutritivo.

*Colonia: “Conjunto de individuos formados por los procesos de reproducción microbiana del
individuo inicial y de las sucesivas generaciones”.

*Cultivo de microorganismos: Consiste en proporcionar entornos que favorezcan la multiplicación

de los microorganismos captados en la muestra.

- Ventajas: Ha sido el ensayo estándar durante muchos años.

Permite cuantificar microorganismos (con limitaciones).
Permite el aislamiento de microorganismos en cultivos puros.

- Inconvenientes: Los efectos tóxicos y alérgicos no son valorados por este método.
Existen diferentes razones por las que un microorganismo no forme una colonia:
(muerte durante muestreo, medios tóxicos, competencia entre especies, etc…)

*MEDIOS DE CULTIVO:

- Es el material donde se multiplicarán los microorganismos formando colonias.

- Deberá reunir las condiciones que permitan y favorezcan el desarrollo.

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 - Una práctica habitual es utilizar en diferentes medios de cultivo y condiciones de incubación para
poder poner de manifiesto el mayor número de microorganismos que sea posible.

- Todos los medios de cultivo deben proporcionar los nutrientes necesarios para el desarrollo.

*Tipos de medios de cultivo:

*Medios de cultivo generales:

- Son aquellos que permiten el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos.
- Pueden desarrollarse tanto bacterias como hongos.

*Medios de cultivo selectivos:

- Preparados para inhibir el crecimiento de determinados microorganismos y permitir el de otros.

*Medios de cultivo diferenciales:

- Permiten el crecimiento de varios microorganismos.
- Contiene ingredientes que producen diferencias de apariencia de algunos de ellos.

Ej. Agar Eosina - Azul de metileno (Agar EMB)

Se utiliza para aislar y diferenciar las bacterias del grupo entérico (BGN).
Es un medio de cultivo que es a la vez selectivo y diferencial:
- Selectivo: el azul de metileno inhibe el crecimiento de las bacterias Gram positivo.
- Diferencial: Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter forman colonias de color azul púrpura.
Shigella, Salmonella o Pseudomonas forman colonias incoloras o rosadas.

*TEMPERATURAS DE TRANSPORTE, CONSERVACIÓN E INCUBACIÓN:

- Tras la toma de muestras se debe procurar:

El transporte inmediato de las mismas al laboratorio.
Por lo menos, el mantenimiento de las muestras a bajas T.

- Se trata de impedir que las especies que crecen a T ambiente inicien su desarrollo, lo que les puede
conferir cierta ventaja sobre el resto de especies presentes en la muestra.

- Asimismo, se debe evitar la conservación de las muestras a T extremas que podrían dañarlas.

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 *Temperatura de incubación:

- Habitualmente se corresponderá con la del normal desarrollo del microorganismo en la naturaleza.

- Se puede utilizar para aislar selectivamente algún microorganismo:

Ej. Numerosos hongos y bacterias libres crecen de manera óptima a T entre 18°C y 25°C.
La mayoría de los hongos crece mal a T por encima de 35°C.
La T óptima de incubación para microorganismos patógenos es de 37°C (T corporal)
Para los actinomicetes termofílicos la temperatura de incubación debe ser superior a 50°C.

*ATMÓSFERA DE INCUBACIÓN:

*El análisis de las bacterias anaerobias requiere mecanismos especiales de transporte e incubación:
- Las muestras deben colocarse en recipientes sellados que contenga un gas libre de oxígeno.
- Se añade: Una solución de un agente reductor (ej. Tioglicolato)
Un indicador redox (cuyo cambio de color indicará contaminación por oxígeno).
- Otro medio para lograr consiste en el uso de cabinas para el cultivo de anaerobios.

*RECUENTO DE COLONIAS:

- Nos sirve para la obtención de la concentración de microorganismos.

- El cálculo de la concentración de microorganismos se basa en la relación entre:

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 Número de colonias que se han contabilizado.
Volumen de aire aspirado, que depende del caudal y el tiempo de muestreo.

*Causas de error más frecuentes en el recuento de colonias:

- Es difícil identificar como separadas, colonias formadas por agregados microbianos.
- Dificultad para diferenciar colonias debido a que su morfología es muy similar.
- Una especie segrega productos químicos que inhiben el crecimiento de otros microorganismos.
- La morfología y/o tamaño de unas colonias obscurecen completamente otras.

*IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS:

*Taxonomía: “Ciencia que permite la clasificación de las formas vivas”.

- Sus objetivos son: Establecer las relaciones que existen entre un grupo de organismos y otro.
Diferenciar entre un grupo de organismos y otros.
- Los métodos de que se sirve la taxonomía para establecer esas relaciones o diferencias son diversos.

*Taxonomía de microorganismos: Utiliza diferentes técnicas para la identificación de microorganismos:

*Observación de las características de las colonias: Es el método más clásico de clasificación.

Ej. Forma, elevación, margen, tamaño, olor y pigmentación de las colonias del cultivo.

*Observación de las células al microscopio:

Ej. Forma, tamaño, agrupaciones, presencia o ausencia de flagelos, cápsula o endosporas.

*Tinción de Gram:

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 - Es una de las primeras pruebas que se realizan para la identificación de las especies bacterianas.
- Se basa en las diferencias físicas que existen entre las paredes celulares de las bacterias.
- Permite clasificar todas las bacterias en dos grupos que se denominan: Gram positivo (azul)
Gram negativo (rosa)

*Identificación de hongos: - Se basa en la observación de la morfología de sus esporas.

- También se pueden utilizar pruebas de tinción.

*Identificación bacteriana a nivel de género, especie y subespecie:

- Se utilizan pruebas bioquímicas, fisiológicas o nutricionales.
- Permiten evaluar: constituyentes de las paredes bacterianas, sus inclusiones,
los antígenos, el rango de temperaturas a las que crecen, y su óptimo,
sus requerimientos de oxígeno, la tolerancia al pH, sales o presiones osmóticas,
su sensibilidad a los antibióticos, sus fuentes de energía, carbono y nitrógeno,
los productos de fermentación y el tipo de metabolismo.
- Disponemos de diferentes sistemas que permiten el ensayo múltiple de los aspectos mencionados.
Ej. Tiras API.

 MICROSCOPÍA
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*La observación al microscopio se utiliza para:
- Recuento del número total de microorganismos.
- Ayuda en la identificación de las especies: Permite reconocer la forma de las células.
Observar el resultado de las pruebas de tinción.
Ver la movilidad de las bacterias.

*Los tipos de microscopios más usados son: Microscopio óptico.

Microscopio de contraste de fase.
Microscopio de fluorescencia.
Microscopio electrónico.

*Microscopio óptico: Se trata de un microscopio “convencional”.

- La observación se basa en la iluminación de los especímenes que destacan contra un fondo oscuro.
- Permite el recuento total de hongos y bacterias.
- Para la observación de bacterias es necesario servirse de colorantes.

*Microscopio de contraste de fases:

- El principio de funcionamiento se basa en la difracción de la luz.
- La luz, al incidir sobre los especímenes provoca distintos grados de brillo y de contraste.
- Técnica apropiada para la observación de especies prácticamente invisibles al microscopio óptico.
- También para el estudio de las endosporas bacterianas.

*Microscopio de fluorescencia:
- Se basa en la observación de la fluorescencia emitida por determinados fluorocromos ligados a las
células (naranja de acridina) cuando son excitados por la luz ultravioleta.
- Esta técnica se utiliza para el conteo directo de partículas.

*Microscopio electrónico:
- En lugar de luz se utiliza un haz de electrones.
Hay de varios tipos:
*Microscopio electrónico de transmisión:
- Gran poder de resolución resolviendo estructuras de tamaño inferior que 0,2 µm.
- Permite poner de manifiesto estructuras y orgánulos internos de las células.
*Microscopio electrónico de barrido:
- Pone de manifiesto la forma externa de las partículas proporcionando imágenes en 3D.
- Técnica útil para la observación e identificación de esporas fúngicas, granos de polen, etc.

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 BIOENSAYOS:

*Bioensayo: “Métodos cuantitativos, ya sean in vivo o in vitro, cuyo objetivo es algún efecto
observable en un sistema biológico o en algún organismo”.

*Ensayos de infectividad:
- Los virus (y algunas bacterias) son parásitos intracelulares obligados.
- El análisis de virus supone la inoculación de cultivos celulares con la muestra en estudio.
- En el cultivo celular cada partícula viral se evidencia por la formación de una lesión.
- Proporciona información sobre el número de partículas víricas infectantes presentes en la muestra.

*Inmunoensayos:
- Métodos basados en la reacción específica que ocurre entre:
Un antígeno (Ag)
Su correspondiente anticuerpo (Ac).
Un marcador (enzimas, moléculas fluorescentes o radioactivas)
- El marcador hace visible y cuantificable el resultado del ensayo.

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 *ELISA (Enzymelinked inmunosorbent assay): Son los inmunoensayos más ampliamente utilizados.
1. Las paredes de los pocillos están recubiertas por el Ac de captura (específico para Ag concretos).
2. La muestra con el Ag es añadida a los pocillos que contienen el Ac de captura.
3. Las placas son incubadas produciéndose la reacción Ag-Ac.
4. Lavado de las placas para eliminar los materiales no ligados.
5. Detección: Usamos un 2º anticuerpo al que va unido un enzima.
Este 2º Ac reconoce y se une al complejo Ag-Ac formado anteriormente.
Se hace un 2º lavado de las placas para eliminar los materiales no ligados.
Se añade una sustancia cromógena que cambia de color al reaccionar con el enzima.
Se lee el cambio de color.

*Inmunofluorescencia: En vez de enzimas para la detección utiliza Ac fluorescentes.

- Los Ac llevan ligados compuestos orgánicos fluorescentes (rodamina B, isotiocianato de fluoresceína)
- Permite la detección del Ag al observar el preparado con el microscopio de fluorescencia.

*Radioinmunoensayo (RIA): En vez de enzimas para la detección utiliza isótopos radioactivos.

- Los Ac llevan ligados isótopos radiactivos (yodo-125).
- Para la detección de Ag, se mide la radiactividad en cada uno de los pocillos.
- Es rápido y sensible, pero presenta el elevado coste y genera residuos radiactivos.

*Ensayos de toxicidad:
- Se utilizan para medir concentraciones de toxinas o de otras sustancias tóxicas.
- El más usado mide el efecto tóxico sobre células linfáticas del cangrejo Limulus polyphemus.
- El efecto tóxico es observable y medible como: Coagulación.
Aumento de la turbidez.
Reacciones cromogénicas.

 PRUEBAS GENÉTICAS:

- Son métodos muy específicos y sensibles que se utilizan cuando lo que interesa es detectar de forma
rápida y fiable la presencia de una determinada especie microbiana.

- Están basados en el reconocimiento de secuencias de ADN (ácido desoxirribonucleico) específicos de

la especie microbiana que buscamos: Hibridación de ácidos nucleicos.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

*Hibridación de ácidos nucleicos:

- Debemos disponer de una de una “sonda de ácido nucleico” para un microorganismo.
- Se trata de una sola hebra de ADN que contenga secuencias características del organismo.
- Cuando en una muestra un microorganismo contiene secuencias de ADN complementarias a las
de la sonda, se produce la “hibridación”.
- La hibridación consiste en la formación de una molécula de ADN de doble cadena:
Una cadena será de la “sonda” que nosotros hemos añadido.
La otra será del microorganismo presente en la muestra.
- Para detectar la reacción se marca la sonda con moléculas indicadoras: Enzimas.
Isótopos radiactivos.
Compuestos fluorescentes.

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*Reacción en cadena de la Polimerasa: PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Es una “fotocopiadora” de ADN: método in vitro de síntesis de secuencias de ácidos nucleicos

seleccionados por el cual segmentos concretos de ADN son específicamente replicados.

1. El ADN de la muestra se mezcla con: Bases de nucleótidos (materia prima del ADN).
Enzima polimerasa (junta los nucleótidos formando cadenas).
2. Se incuba en condiciones de temperatura controlada en un aparato llamado “Termociclador”:
- Las cadenas se separan, se copian, se vuelven a separar y se vuelven a copiar.
- En poco tiempo se obtienen millones de copias de moléculas de ADN listas para el ensayo.
3. Detección por hibridación: Se añaden sondas seleccionadas de ADN con un marcador.
- La sonda se hibrida con regiones específicas del ADN buscado.
- El marcador de la sonda puede ser enzimático, fluorescente o radioactivo.

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 - Ventajas: Gran sensibilidad, especificidad y rapidez de los resultados.
Capacidad para detectar microorganismos que son muy lentos o difíciles de cultivar.
El técnico no tiene que manipular microorganismos peligrosos, sino parte de los mismos.

- Inconvenientes: Sólo detecta agentes biológicos predeterminados si éstos están presentes.

Es un método cualitativo: sólo indica si el microorganismo está o no está presente.

 ENSAYOS QUÍMICOS:

- Se pueden aplicar métodos químicos para la detección de los microorganismos:

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Cromatografía de gases (CG)
Espectrometría de masas (EM)

- Se usan de forma independiente o en combinación, para la detección de indicadores químicos.

*Estos indicadores químicos incluyen:

- Moléculas estructurales de las membranas y paredes de los microorganismos.
- Productos metabólicos: micotoxinas fúngicas, aldehídos, alcoholes, y otros compuestos volátiles.
- Macromoléculas segregadas: enzimas específicos y otras proteínas.
- Macromoléculas excretadas: guanina contenida en los excrementos de los ácaros.

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