verificación de

métodos
microbiológicos.
La nueva norma
ISO 16140-3
David Tomás Fornés
Webminar, 12 Mayo 2021

The life science business of Merck KGaA,

Darmstadt, Germany operates as
MilliporeSigma in the U.S. and Canada.
Agenda
1 Validación y verificación 4 Verificación:
Métodos cuantitativos

2 Métodos de referencia y
alternativos 5 Conclusiones

3
Verificación:
Métodos cualitativos
Validación y
verificación
Desarrollo e implementación métodos microbiológicos
Objetivo de la presentación

LABS. EXPERTOS
INVESTIGACIÓN

LAB. I+D
Y DESARROLLO

VALIDACIÓN

LAB. USUARIO
VERIFICACIÓN

CONTROL DE CALIDAD

4 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Validación y verificación
Definiciones

Validación: Verificación:

Establecimiento de las características de Demostración de que un método validado utilizado

comportamiento de un método y provisión de por un usuario funciona conforme a las
evidencia objetiva que demuestre que se cumplen especificaciones del método determinadas en el
los requisitos de comportamiento para un uso estudio de validación y que resulta adecuado
previsto definido para sus objetivos.

5 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Métodos de
referencia y
alternativos
Requisitos normativos en UE
Reglamento 2073/2005

7 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Métodos de referencia normalizados
Organismos de Normalización

8 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Validación métodos microbiológicos
Métodos referencia. Datos de validación

9 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Validación métodos microbiológicos
Métodos referencia. Datos de validación

10 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Requisitos normativos en UE
Reglamento 2073/2005 Métodos rápidos

Explotadores de empresas alimentarias puedan usar

métodos analíticos diferentes de los métodos de
referencia, en particular métodos más rápidos, siempre
que estos métodos alternativos produzcan resultados
equivalentes.

Validación métodos alternativos

Métodos alternativos deben ser validados con respecto

al método de referencia y si se utiliza un método
registrado, certificado por terceros conforme al protocolo
de la norma EN/ISO 16140.

11 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Validación métodos microbiológicos
Métodos alternativos
LABS. EXPERTOS

INVESTIGACIÓN
LAB. I+D

Y DESARROLLO

VALIDACIÓN
LAB. USUARIO

VERIFICACIÓN

CONTROL DE CALIDAD

12 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Validación métodos microbiológicos
Métodos alternativos. Datos de validación

13 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Validación métodos microbiológicos
Métodos alternativos cualitativos. Datos de validación

14 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Validación métodos microbiológicos
Métodos alternativos cuantitativos. Datos de validación

MC MediaPad®

15 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

VERIFICACIÓN
Desarrollo de métodos microbiológicos
LABS. EXPERTOS

INVESTIGACIÓN
LAB. I+D

Y DESARROLLO

VALIDACIÓN
LAB. USUARIO

VERIFICACIÓN

CONTROL DE CALIDAD

17 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Verificación métodos microbiológicos
¿Cuando?

• Métodos ya verificados. No requieren nueva verificación.

• Nuevos métodos.
• Métodos revalidados (impacto mayor). Requieren verificación.
• Extensiones del alcance.

18 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos

1 Método

2 Matrices

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

19 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos

1 Método

2 Matrices

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

20 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos

1
1 2
Método

Verificación alimentos
Implementación

2 Matrices
Demostrar que el laboratorio obtiene
resultados equivalentes a los de la
Seleccionar alimentos realmente analizados por el
laboratorio, seleccionando de diferentes categorias
aquellas matrices que sean „complicados“ de

3
validación.
Inóculo analizar.

 Matriz empleada en la validación

4
 Elevada flora acompañante
 Matriz fácil de homogeneizar
Análisis  pH ácido
 Alto contenido en inhibidores (sal, fenoles...)

5
 Viscosidad
Resultados
 Baja Aw
 Alto contenido en grasa

6 Evaluación

21 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos

1 Método

2 Matrices

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

22 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Métodos
cualitativos
 Verificación métodos microbiológicos

1 Método

2 Matrices

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

24 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos

1
IMPLEMENTACION
Método

2 Matrices

Leche desnatada en polvo

3 Inóculo

VERIFICACION ALIMENTOS

4 Análisis

5 Resultados
Chocolate Queso azul Sirope

6 Evaluación

25 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021 Mayonesa Sobrasada

 Verificación métodos microbiológicos

1 Método

2 Matrices

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

26 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos
Implementación. Protocolo 3
1 Método

2 Matrices
25 g

3
3-5 cfu

Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

Incluir un blanco (no inoculado)

27 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021
 Verificación métodos microbiológicos
Verificación alimentos. Protocolo 3
1
x7 x7 x7 x7 x7
Método

2 Matrices

3
25 g 3-5 cfu 25 g 3-5 cfu 25 g 3-5 cfu 25 g 3-5 cfu 25 g 3-5 cfu
Inóculo

4 Análisis

5 Resultados Pickpen Pickpen Pickpen Pickpen Pickpen

6 Evaluación
PCR Assurance® GDS PCR Assurance® GDS PCR Assurance® GDS PCR Assurance® GDS PCR Assurance® GDS

+ blanco (no inoculado)

28 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021
 Verificación métodos microbiológicos
Verificación alimentos. Protocolo 3
1 Método
Verificación chorizo Teror inoculado
con Salmonella (4,7 ufc/25g)

2 Matrices Results PCR Assurance® GDS

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

29 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos
Verificación alimentos. Protocolo 1
1 Método

2 Matrices

3 Inóculo

4 Análisis Al menos 6 réplicas

5 positivas de cada
alimento
Resultados

6 Evaluación

30 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos
Implementación. Protocolo 1
1 Método

2 Matrices

3 10-7 1:3 1:3 1:3

Inóculo
20 ufc/ml 6,7 ufc/ml 2,2 ufc/ml 0,7 ufc/ml

4 Análisis
LOD50 metodo
0,7 ufc/muestra

5 Resultados Nivel alto

6,7 ufc/ml
Nivel medio
2,2 ufc/ml
Nivel bajo
0,7 ufc/ml

6
9xLOD50 3xLOD50 1xLOD50
Evaluación
Incluir un blanco (no inoculado)

31 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos
Verificación alimentos. Protocolo 1
1 Método

2 Matrices

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

Incluir un blanco (no inoculado)

32 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021
 Verificación métodos microbiológicos
Verificación alimentos. Protocolo 1
1 Método

2 Matrices

Cálculo del eLOD50

3 Inóculo
para cada matriz a
partir del número de
positivos y negativos

4
obtenidos en cada nivel
Análisis de contaminación.

5 Resultados

6 Evaluación
eLOD50 = 1,0 x 0,9 = 0,9 ufc/25g
33 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021
 Verificación métodos microbiológicos
Verificación alimentos. Protocolo 1
1 Método

2 Matrices

eLOD50 ≤ 4 x LOD50
3 Inóculo

4 Análisis 0,9 ufc/25 g < 2,8 (4 x 0,7 ufc/25g)

5 Resultados

Si no se dispone de LOD50 , considerar LOD50 = 1 ufc/muestra

6 Evaluación

34 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos
Implementación. Protocolo 2
1 Método Implementación con carne ternera cruda inoculada con STEC O157:H7

2
eLOD50 <1.5 cfu/25g LOD50 STEC = 0,45 cfu/25g
Matrices
Método implementado correctamente: eLOD50 LABROVET <1,8 ufc/g (4 x 0,45 cfu/25g)

3
Multiplex PCR Assurance® GDS

Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

35 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Métodos
cuantitativos
 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Objetivo
1 Método

2 Matrices

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

Tomado de http://blog.educastur.es

37 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Diseño estudio
1 Método

MUESTRA

2 Matrices

3
PORCION A PORCION B
Inóculo

4
VALOR
SOLUCIÓN MADRE A DE REFERENCIA SOLUCIÓN MADRE B
Análisis (INÓCULO)

5
RESULTADO A RESULTADO B
Resultados

6
Condiciones diferentes
Evaluación

38 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Diseño estudio
1 Método

MUESTRA

2 Matrices

3
PORCION A PORCION B
Inóculo

4
VALOR
SOLUCIÓN MADRE A DE REFERENCIA SOLUCIÓN MADRE B
Análisis (INÓCULO)

5
(SIR)
RESULTADO A RESULTADO B
Resultados PRECISION/
REPRODUCIBILIDAD

6
Condiciones diferentes
Evaluación

39 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Implementación
1 Método

2
10 ml 10 ml
Matrices

3 Inóculo 3000 ufc 3000 ufc

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

40 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Implementación
1 Método

2
10 ml 10 ml
Matrices

3 Inóculo 6000 ufc 6000 ufc

4 Análisis

5 Resultados

6
Realizar en total 10 veces con diferentes referencias del mismo alimento
Evaluación

41 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Implementación
1 Método
Muestra
Valor
referenci
a (ufc/g)
Resultado A
(XiA)
ufc/g
Resultado B
(XiB)
ufc/g
Log Resultado A
yiA=log10(XiA)
Log Resultado B
yiA=log10(XiB)

2
1 30 <40 (20) <10 <1,6 <1,6
Matrices
2 300 110 250 2,04 2,40

3 300 450 580 2,65 2,76

3 Inóculo 4

5
600

600
640

900
520

850
2,81

2,95
2,72

2,93

4
6 600 500 450 2,70 2,65
Análisis
7 600 700 900 2,85 2,95

5
8 1200 1500 1100 3,18 3,04

Resultados 9 1200 1100 1400 3,04 3,15

10 1200 1700 2400 3,23 3,38

6
11 1200 1300 1500 3,11 3,18
Evaluación

42 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Implementación
1 Método

2 Matrices

Estimación de la reproducibilidad (precisión)

3
a través de desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio (SIR)
Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

43 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Implementación
1
Diferencia
Log Resultado A Log Resultado B Cuadrado diferencia
Método Muestra
yiA=log10(XiA) yiB=log10(XiB)
(valor absoluto)
|yiA-yiB|2
|yiA-yiB|

1 <1,6 <1,6 No válido No válido

2 Matrices 2 2,04 2,40 0,36 0,13

3 2,65 2,76 0,11 0,01

3
4 2,81 2,72 0,09 0,01

Inóculo 5 2,95 2,93 0,02 0,00

6 2,70 2,65 0,05 0,00

4
7 2,85 2,95 0,11 0,01
Análisis 8 3,18 3,04 0,13 0,02

9 3,04 3,15 0,10 0,01

5
10 3,23 3,38 0,15 0,02
Resultados
11 3,11 3,18 0,06 0,00

6
Suma 0,22

Evaluación Suma/(2x10) 0,01

SIR=√(0,010871) 0,10

44 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Implementación
1 Método

2
MC MediaPad®

Matrices

3 Inóculo

4 Análisis

5 Resultados

6
0.180+0.187+0.207
Media SR = = 0.19 Log10 ufc/g
3
Evaluación

45 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Implementación
1 Método

2
El método está correctamente implementado si:
MC MediaPad®

Matrices
MC MediaPad®

SIR ≤ 2 x SR
3 Inóculo

4 Análisis
SIR = 0,10 Log10 ufc/g << 2 x SR = 0,38 Log10 ufc/g (2 x 0,19)

5 Resultados

6 Evaluación

46 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Verificación matrices
1 Método

MUESTRA

2 Matrices

3
PORCION A PORCION B
Inóculo

4
VALOR
Análisis SOLUCIÓN MADRE A DE REFERENCIA SOLUCIÓN MADRE B
(INÓCULO)

5
SESGO (ebias)
Resultados

RESULTADO A

6
RESULTADO B
Evaluación

47 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Verificación matrices
1 Método

2 Matrices
10 g 10 g

3 Inóculo 3.000 ufc

4
3.000 ufc 3.000 ufc

Análisis

5 Resultados

6 Evaluación

48 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Verificación matrices
1 Método

2 Matrices
10 g 10 g

3 Inóculo 10.000 ufc

4
10.000 ufc 10.000 ufc

Análisis

5 Resultados
MC MediaPad®

6 Evaluación

49 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Verificación matrices
1 Método

2 Matrices
10 g 10 g

3 Inóculo 1500 ufc

4
1500 ufc 1500 ufc

Análisis

5 Resultados

MC MediaPad®

6 Evaluación

50 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Verificación matrices
1 Método
Recuento
alimentos
Media alimentos
artificalmente
Inóculo sin
alimento
Diferencia (valor
absoluto) entre
muestras con
contaminados contaminados (log10 ufc/g)

2
alimentos y muestra
(log10 ufc/g) (log10 ufc/g)
sin alimento
Matrices
Muestra 1 (lote 1) Porción A 2,32
2,51 2,85 0,33

3
Muestra 1 (lote 1) Porción B 2,70
Inóculo
Muestra 2 (lote 2) Porción A 3,26

4
3,33 3,60 0,28
Muestra 2 (lote 2) Porción B 3,40
Análisis
Muestra 3 (lote 3) Porción A 2,00

5
2,24 2,70 0,46
Resultados Muestra 3 (lote 3) Porción B 2,48

6 Evaluación

51 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos microbiológicos cuantitativos
Verificación matrices
1 Método
Recuento
alimentos
Media alimentos
artificalmente
Inóculo sin
alimento
Diferencia (valor
absoluto) entre
muestras con
contaminados contaminados (log10 ufc/g)

2
alimentos y muestra
(log10 ufc/g) (log10 ufc/g)
sin alimento
Matrices
El alimento se
Muestra 1 (lote 1) Porción A 2,32 ha verificado si
2,51 2,85 0,33

3
Muestra 1 (lote 1) Porción B 2,70
Inóculo sesgo (ebias) ≤ │0.5 Log ufc/g│
Muestra 2 (lote 2) Porción A 3,26

4
3,33 3,60 0,28
Muestra 2 (lote 2) Porción B 3,40
Análisis
Muestra 3 (lote 3) Porción A 2,00

5
2,24 2,70 0,46
Resultados Muestra 3 (lote 3) Porción B 2,48

6 Evaluación

52 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

 Verificación métodos
microbiológicos cuantitativos

Para considerar el método válido para todo tipo de

alimentos, deben ser verificados al menos 5 alimentos
de diferentes categorias seleccionados entre matrices
que seán «complicadas» de analizar

53 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

conclusiones
 Conclusiones

Cuadro resumen

Método Carac. Implementación Verificación matrices Criterio

1 matriz x 7 replicas 5 matrices x 7 replicas Al menos 6
Prot. 3
3-5 ufc/muestra 3-5 ufc/muestra positivos
Cualitativo 1 matriz x 9 replicas 1 matriz x 9 replicas
Prot. 1(1) eLOD50 ≤
(9xLOD50; 3xLOD50; (9xLOD50; 3xLOD50;
eLOD50 4 x LOD50 (2)
1xLOD50) 1xLOD50)
1 matriz x 10 muestras x SIR ≤ 2 x media
SIR No aplicable
Cuantitativo duplicado inferior SR (3)
5 matrices x 3 niveles x Sesgo ≤
Sesgo No aplicable
duplicado |0.5 Log ufc|

(1) Protocolo 2 contempla 8 replicados.

(2) LOD
50 = 1 ufc en ausencia de datos de validación.
(3) No aplicable en ausencia de datos de validación.

55 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

Conclusiones
Verificación métodos microbiológicos

Empleo de
métodos de Incluye:
implementación
referencia o
•
• verificación
alternativos El método alimentos
validados funciona
correctamente
en mi laboratorio

56 ISO 16140-3 Verificación | 12.05.2021

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