FUNDAMENTOS DE COROMATOGRAFIA

La cromatografía fue descubierta por un botánico, llamado Mijai Tvse en el año 1906. Quien
descubrió la forma de separar los compuestos de una mezcla mediante la cromatografía de
pigmentos vegetales.

Se le atribuye el nombre ya que el prefijo CROMO hace referencia a color y GRAFIA a escritura.

Según la UIPAC se define en la actualidad cromatografía como el proceso para separar los
compuestos que conforman una mezcla. Utilizando dos fases, una estacionaria en donde los
compuestos van a quedar “adheridos” y una móvil que va a arrastrar aquellos que no tengan una
afinidad con la fase estacionaria. Logrando así obtener “puntos” que nos permitan cuantificar las
concentraciones de sustancias puras que conforman la mezcla de estudio.

HLPC es el método mas conocido de cromatografía. Sus siglas significan Hight , Liquid, Perfonmance,
Cromatografy. (cromatografía liquida de alta performance)

Se basa básicamente en dos tipos de funcionamiento:

1. cromatografía de FASE NORMAL

La fase móvil es NO POLAR y la fase estacionaria es POLAR.
Esto permite que en el comatograma (el grafico que obtenemos con los picos que simbolizan
las diferentes sustancias en la mezcla) se logren ver en primer lugar aquellas sistancias que
son menos polares y quedan menos retenidas en la fase estacionaria, mientras que las mas
polares, quedan mas tiempo retenidas en la columna y por lo tanto los picos “salen mas
retardados”.
2. cromatografía de FASE REVERSA
En general es la mas utilizada en laboratorios de calidad, es lo contrario a la fase normal.
En este caso, la fase móvil es polar (generalmente una mezcla de agua con otros solventes
polares) y la fase estacionaria es NO POLAR (generalmente una alteración con el C18 en la
columna que hace que sea no polar). El método es inverso, por lo tanto en los gráficos
veremos primero en “salir” los picos que representan a las sustancias que son menos
retenidas en la fase estacionaria, por su alta polaridad y los últimos picos, serán aquellas
sustancias menos polares.

El cromatograma, nos va a indicar en función del tiempo de retención de cada sustancia y la medida
de absorbancia que cada una realiza en el proceso.

Las partes que conforman un HPLC básicamente son:

Una fase móvil, una bomba que impulsa a gran velocidad la fase móvil, un lugar para inyectar la
muestra. Luego la fase móvil y la muestra se “mezclan” se introducen dentro de la fase estacionaria
donde se realizara la separación de compuestos. Luego de circular por la columna, el equipo envía
las señales mediante el software informático para que la maquina registre los datos y nos haga el
grafico, mientras que el solvente es liberado por otra sección a un frasco de desechos.

Existen muchas variedades de tamaños de columnas de fase estacionaria, dependiendo del

compuesto que vamos a analizar definiremos el tipo de columna. Básicamente la selección de basa
en el peso molecular de la muestra, si es menor a 2000 o si es mayor. Luego se evalúan dos caminos
posibles, si es soluble en agua o en algún solvente orgánico o alguna mezcla también, se define si es
iónica o no en el caso de ser soluble en agua y en función de eso, en el manual por ejemplo de
Agilent que es fabricante de columnas, nos indica que tipo utilizar y también el tipo de
cromatografía.

BOMBAS DE HPLC

Como mencionamos anteriormente, la bomba sirve para tranportar la fase móvil con presión a la
columna. Esto lo realiza mediante un pistón que tiene a bomba donde al provocar el movimiento
genera presión en una cámara por donde pasa la fase móvil. Cabe destacar que la presión con la que
se ingresa la fase móvil a la columna puede ser regulada por el HPLC.

No hay riesgo de explosión, ya que los líquidos son prácticamente incompresibles, pero si podemos
tener perdida de disolvente y si este es inflamable, puede haber riesgo de incendio.

SISTEMAS DE BOMBEO