PRACTICA N° 4

TIPIFICACIÓN SANGUÍNEA Rh

1. OBJETIVO
Determinar la clasificación sanguínea, en relación al sistema Rh, segundo Sistema
sanguíneo en importancia después del ABO, efectuando pruebas que identifiquen los
principales antígenos del sistema que se encuentran presentes en una muestra de
sangre dada.
La práctica incluye la Determinación del Antígeno D presente en los Glóbulos rojos por
diferentes métodos, la investigación de los cinco principales antígenos del Sistema
exceptuando el D, como son: C, c, E, e. Reconocer el interés e importancia clínica de su
determinación. Identificar las características de los antígenos del sistema y los diferentes
reactivos y métodos existentes para la determinación de los fenotipos relacionados.
Identificar los Genotipos más probables de acuerdo a los resultados de la fenotipificación
realizada.
Analizar las opciones de transfusión para los diferentes componentes sanguíneos de
acuerdo al Rh de los receptores.

2. INTRODUCCIÓN
El sistema del grupo sanguíneo Rhesus es de gran importancia en biología humana. Es el
más importante después del Sistema ABO. Su conocimiento permitió lograr transfusiones
exitosas después de la segunda guerra mundial. Su descubrimiento permitió comprender
el mecanismo de la enfermedad hemolítica del recién nacido por inmunización feto -
materna. Dado que la mayor parte de la población es Rh positivo, es indispensable que
en el laboratorio de Inmunohematología se utilicen los procedimientos adecuados para
establecer la correcta clasificación para el antígeno D, incluyendo las variantes débiles y
el fenotipo Rh, para lograr disminuir la sensibilización eritrocitaria por transfusión o
embarazo asociada con este sistema.
Los antígenos Rhesus fueron identificados por anticuerpos descubiertos en el suero de
sujetos transfundidos o mujeres embarazadas. Estos anticuerpos en su mayoría
anticuerpos inmunes, que pertenecen a la IgG y son incapaces de aglutinar in-vitro los
hematíes portadores del antígeno correspondiente, se les denominó anticuerpos
bloqueadores o incompletos.
Por esta razón se utilizan corrientemente técnicas de aglutinación “in vitro” para
comprobar la fijación del anticuerpo al antígeno específico mediante modificación del
medio de suspensión de los hematíes mediante macromoléculas o altas concentraciones
de proteínas (albúmina bovina) o utilización de hematíes tratados con enzimas; bromelina,
papaína, oficina.

El antígeno D es el más importante en transfusión e incompatibilidad feto-materna, dada

su gran inmunogenicidad, los restantes antígenos del Sistema pueden también ser causa
de inmunización.

La rutina en el laboratorio de Inmunohematología incluye la determinación del antígeno D

y la detección del antígeno D débil, confirmación del antígeno D negativo en todos
aquellos individuos susceptibles de recibir transfusiones repetidas o en posibles futuras
embarazadas a quienes también deben identificarse los 5 antígenos principales del
sistema Rhesus.

Para la determinación del antígeno D se utilizan variedades de antisueros cada una de

ellas tiene modificaciones o indicaciones específicas para sus uso, para lo pertinente se
revisarán algunos aspectos de comportamiento y actividad de dichos antisueros y la
utilidad práctica de cada uno de ellos.

3. PRE- LABORATORIO
1. Teniendo en cuenta las variedades de antisueros anti-D que existen comercialmente;
Explique comparativamente las diferencias existentes y sus diversas aplicaciones.

Anti D/ IgG + IgM

● Puede presentarse un antígeno monoclonal de IgM/IgG ,este reactivo aglutina

directamente hematíes Rh D positivos, incluyendo la mayoría de sus variantes
(excepto DVI) y una alta proporción de fenotipos D débiles (Du).
● Este reactivo es baja potencia que contiene anticuerpos IgM e IgG anti D
monoclonal, diluido en una solución amortiguadora de fosfatos, que contiene
cloruro de sodio, Albúmina de suero bovino y potenciadores macromoleculares.
● El reactivo provoca la aglutinación directa de los hematíes que contengan el
antígeno D y la aglutinación indirecta de los hematíes de la Categoría DVI en la
fase antiglobulina del test. La ausencia de aglutinación generalmente es indicativo
de la inexistencia del antígeno D.
● .En la mayoría de los casos los D débiles no se aglutinan directamente con este
reactivo.

Referencias: https://grupomexlab.com/wp-content/uploads/2020/07/ANTI-D.pdf
http://www.spinreact.com/files/Inserts/Grups_sanguinis/GSIS04_Ref._1700019-
21_Anti_D_2019.pdf
https://www.wiener-lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum
%20espanol/anti_d_rho_monoclonal_sp.pdf

2. En relación a la variante débil del D analice el comportamiento variable frente a los

anticuerpos anti-D (Rh).
- La variante D débil se produce por una mutación puntual en la región intracelular del
gen RHD y macroscópicamente se refleja en cantidades reducidas en relación con el
antígeno D normal.
- Un fenotipo D débil es identificado cuando se produce una reactividad de aglutinación ≤2(+)
con un antisuero anti-D, pero al ser enfrentado con antiglobulina humana se produce una
fuerte reacción que confirma la existencia de una variante D.
- En un laboratorio de referencia para ser ensayados en un panel de 12 reactivos anti-
D IgG para la identificación de fenotipos serológicos débiles.
- La tipificación molecular ha permitido determinar los tipos del antígeno D y de esa
manera clasificarlos de forma inequívoca como RhD positivo.
Referencias: https://www.redalyc.org/journal/535/53563408010/html/

3. Destaca las condiciones de reacción indispensables para detectar antígenos Rh.

- Siempre debe tenerse en cuenta de que naturaleza es el reactivo para de esa
manera poder implementar medidas adicionales en caso de que se requiera.
 - Se debe presentar y garantizar la unión antígeno anticuerpo.
- Usar dos sueros anti-D diferentes Usar el test indirecto de antiglobulina para detectar
los Du, si es necesario
- Realizar de manera correcta el lavado y preparación de los glóbulos rojos debido a
que si se hace con algún error técnico puede llevar a resultados equivocados.
- Utilizar reactivos que no estén vencidos.
- Usar dos muestras de control, Una muestra D+ y otra D–
- Que el método (tubo,lamina, gel o placa) esté en las correctas condiciones.
- Evitar contaminantes externos.
- Además debe hacerse Tipificación por duplicado usando dos sueros para cada
antígeno.
Referencias: https://www.scielosp.org/pdf/rpsp/2003.v13n2-3/176-182/es

4. Revise y analice a fondo las expresiones D débil y D parcial y explique en un

cuadro las diferencias.

D débil D parcial

● Posee una cantidad de antígeno D ● Los glóbulos rojos con D parcial se

reducida, lo cual requiere para su
detección una prueba de
antiglobulina indirecta (PAI).
● se produce por mutaciones en los
nuc!eótidos del RHD que
inducen cambios en los
aminoácidos intracelulares, o en la
región transmembrana del RhD
● Diferentes mutaciones causan la
expresión de D débil y se designan
desde el tipo 1 al 73 donde el más
común es el tipo 1.
tipifican como D positivo.
● Los individuos con D parcial pueden
inducir la síntesis de anti-D cuando
están expuestos al antígeno O
convencional.
● También pueden generar nuevos
antígenos.
● A diferencia del D débil, se predice
que los cambios estarán ubicados
en la superficie externa de la
membrana del G.R

Referencias: Manual AABB 17 edición.

5. Investigue los diferentes tipos de suero de de Coombs existente y los métodos de
obtención.
Existen 2 tipos de suero de coombs los monoespecíficos que son anti-IgG y anti-C3d y
estos permiten poner en evidencia el proceso inmunológico y colaborar en la determinación
del diagnóstico del paciente. Esta prueba se debe realizar siempre que la prueba
poliespecífica esté positiva.

Los sueros poliespecíficos son capaces de detectar tanto IgG como C3d. Si la prueba
poliespecífica es positiva, se debe investigar con sueros monoespecíficos (anti-IgG y anti-
C3d), lo que permite poner en evidencia el proceso inmunológico y colaborar en la
determinación del diagnóstico del paciente.Esta prueba que se ejecuta al hacer reaccionar
los glóbulos rojos de una muestra de sangre total con el suero antiglobulina humano
poliespecífico.

Obtención:
El método tradicional de obtención del suero de Coombs consiste en inmunizar los animales
más específicamente conejos con Igs y complemento utilizando como adyuvante para
ambos inmunógenos, el adyuvante completo de Freud (ACF) en la primera dosis, y el
adyuvante incompleto de Freud (AIF) en dosis sucesivas. Aunque actualmente se puede
conseguir de manera voluntaria en personas que aceptan que se inmunizan bajo su
consentimiento para la extracción y elaboración.
Referencias: https://www.ispch.cl/sites/default/files/Recomendaciones%20para%20la
%20prueba%20de%20antiglobulina%20directa.pdf

6. Revise el fundamento de las pruebas de Coombs, su aplicación para la detección

de antígenos débiles y la aplicación en la determinación de la variante D débil.
Explique el fundamento de la prueba.

Fundamento de la prueba de coombs directa:

Se utiliza para detectar anticuerpos que ya se han fijado a la superficie de los glóbulos rojos.
La prueba de la antiglobulina o prueba de Coombs, permite la detección e identificación de
globulinas ligadas inmunológicamente a los hematíes. La adición del reactivo antiglobulina a
los mismos ocasionará su aglutinación.

Fundamento de la prueba de coombs indirecta:

Se utiliza para detectar anticuerpos IgG contra eritrocitos en el plasma del paciente.
El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos cubiertos de
inmunoglobulinas y/o fragmentos de complemento produce una aglutinación de los glóbulos
rojos visible macroscópicamente.
Referencias: https://www.linear.es/ficheros/archivos/804_34100-C.pdf
https://www.wiener-lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum
%20espanol/suero_anti_humano_sp.pdf

4. LABORATORIO
DETERMINACION DEL FACTOR Rh(D)
a. Método en Lámina

4.1. MATERIALES Y REACTIVOS

Láminas portaobjetos, palillos, sangre total, suero anti-D y reactivo control Rh,
lámpara con visor de aglutinación, lupa, pipetas Pasteur.
4.2. PROCEDIMIENTO
Leer siempre las instrucciones del fabricante sobre el uso de los reactivos para
pruebas en tubo o lámina

Colocar sobre una lámina de vidrio previamente calentada a 4°C, una gota de suero anti-
D, en otra lámina una gota de control Rh o en su defecto albúmina bovina al 22%,

agregar a cada lámina una gota de sangre ó una suspensión de hematíes en su propio
suero al 50%. Mezclar circularmente y extender sobre una superficie de 22 mm x 40 mm
utilizando un palillo de madera, dentro de los 2 minutos siguientes oscilando la lámina
observar presencia o ausencia de aglutinación
Nota: Siempre debe usarse un control con el fin de que GR sensibilizados con
anticuerpos de tipo IgG(incompletos) o procedentes de pacientes cuyo suero posea
globulinas sericas anormales, anticuerpos autoinmunes, aglutininas frías o proteínas que
causen rouleaux, y que pueden agregarse espontáneamente sean detectados.

4.3 INTERPRETACIÓN

POSITIVO: Aglutinación de los glóbulos rojos.

NEGATIVO: Suspensión uniforme de glóbulos rojos.

Observaciones:
Si la preparación de glóbulos rojos en el tubo control presenta aglutinación; la prueba no
se logra interpretar (Esto puede suceder con antisueros de alta concentración proteica
caso en el cual se usa un antisuero salino)

Se debe tener cuidado en no leer pasado el tiempo indicado ya que la desecación en los
bordes de la preparación se puede confundir con aglutinación.
b. Método En Tubo
4.1 MATERIALES
Tubos de 12 x 75 mm, suspensión de glóbulos rojos 3 - 5%, baño serológico, anti-D,
reactivo control Rh, Pipetas Pasteur.

4.2 PROCEDIMIENTO
1. Lavar los glóbulos rojos del paciente con solución salina fisiológica (SSF) 0.85 % y
preparar una suspensión de glóbulos rojos a examinar al 3 - 5 % en SSF.
2. Identificar apropiadamente dos tubos de 12 x 75 mm (para la prueba y su control) y el
número de identificación de la muestra.

Continuar con el siguiente procedimiento:

4.3 INTERPRETACIÓN
POSITIVO: Aglutinación superior a 2+ antes o después de incubación.
NEGATIVO: Suspensión uniforme de GR o aglutinación débil o dudosa. En este caso
continuar con procedimiento para variante débil.

PRACTICA N° 5

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Rh

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS

- 6 Tubos de 12 x 75 mm, Baño de María, Serófuga, Lámpara, Lupa.
- Antisueros: Anti- C, anti – E, Anti- c, Anti- e.
- Solución salina 0.85 %.
3.2 PROCEDIMIENTO
1. Lavar los glóbulos rojos 3 o 4 veces y suspender del 2 al 5 %.
2. Marcar un tubo por cada antígeno a determinar, con la letra correspondiente al
antígeno y el # de identificación de la muestra.

4. INTERPRETACIÓN
POSITIVO: Se observa aglutinación en grado variable.
NEGATIVO: Suspensión homogénea de los glóbulos rojos

5. POS LABORATORIO
1. ¿Considera usted que en un paciente D negativo que va a recibir una transfusión
sanguínea es importante realizar el fenotipo Rh y porque?
Si es importante porque se necesita verificar si ese es su fenotipo de Rh en caso de una
transfusión, si se es una mujer en edad fértil debido a que se puede sensibilizar, aparte en
personal comune sy corrientes sería importante para verificar que ese si sea su Rh debido a
que los receptore Rh(-) solo pueden recibir sangre con Rh(-).
2.¿Por qué se debe determinar el fenotipo del sistema Rh en todas las personas Rh
D: Negativo?
Porque las personas que tienen un RH parcial pueden marcar como negativos y es
necesario verificar debido a que estos G.R podrían estimular una inmunización anti-D, lo
cual es muy peligroso.
3. Revise las principales nomenclaturas internacionales para identificar los diferentes
fenotipos del sistema Rh.
Encontramos dos tipos de nomenclatura, la primera es la nomenclatura de Wiener y de
Fisher y Race que se realiza de la siguiente manera:

Referencias: https://revistamedicahondurena.hn/assets/Uploads/Vol20-3-1952-5.pdf

PRACTICA N° 6

DETERMINACION DE LA EXPRESIÓN DÉBIL DEL ANTIGENO D

3.1. MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de 12 x 75 mm, Antisuero anti-D (Rh), suero de Coombs, Albúmina bovina al 30%
control de Coombs.

3.2. PROCEDIMIENTO
1. Lavar los glóbulos rojos del paciente con SSF al 0.85 % y preparar una suspensión de
glóbulos rojos a examinar al 3-5 % en SSF.
2. Identificar apropiadamente dos tubos de 12 x 75 mm (para la prueba y su control) y el
número de identificación de la muestra.
Continuar con el siguiente procedimiento:

3. INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO

1. La presencia de aglutinación en el tubo con anti- D, pero no en el de Control,
constituye un resultado positivo. La sangre debe clasificarse como D positivo ya
que tiene una expresión débil del Antígeno D.
2. La ausencia de aglutinación en el tubo con anti- D constituye un resultado negativo
e indica que las células no expresan D y deben clasificarse como D negativo.

4. AUTOEVALUACIÓN
• Describa las debilidades y fortalezas que encontró en la práctica
• Qué aportó usted para el desarrollo de la práctica

5. POST LABORATORIO
1.¿Cómo se rotulan las bolsas de sangre obtenidas de donantes con prueba de
expresión Débil del Ag D: positiva?
Se rotulan como Rh (+)
2. Revisar los criterios de transfusión en donantes y receptores que presentan una
expresión débil del Ag D Positiva.
- Los donantes de sangre tipificados como D débil son tratados como RhD positivos y
los receptores y mujeres embarazadas son manejados como RhD negativos.
- Los receptores de sangre que posean D débil son tratados como positivos, ya en el
caso de que el que va a ser transfundido sea una mujer en edad fértil se va a tratar
como negativo.
3. Analice la importancia de determinar la presencia de un antígeno D débil en una
materna y explique?.
Es importante para de esa manera no crear una sensibilización con el bebe y darle de
alguna manera tratamiento para que así no se vea afectada ni ella ni el bebe.

PRACTICA N° 7

DETERMINACIÓN DE FENOTIPO EXTENDIDO

1. OBJETIVOS
Determinar la presencia de los antígenos eritrocitarios más importantes de los
Sistemas de Grupos sanguíneos principales.
2. PRE LABORATORIO
1. Defina fenotipo eritrocitario.
Son el conjunto de características visibles en el eritrocito, por ejemplo los grupos
sanguíneos, en el laboratorio podemos determinar el genotipo si es A,B,O,AB pero no
podemos determinar el genotipo que sea el alelo que se heredó del padre y madre.
2. Investigue tipo de muestra que se emplea para determinación del fenotipo
eritrocitario y condiciones de las mismas.
Las muestras que se pueden emplear para determinar el fenotipo eritrocitario es:
- Sangre venosa.
- Sangre de cordón umbilical.
Condiciones.
- Los eritrocitos del paciente deben lavarse perfectamente utilizando solución salina
0.9% o solución amortiguadora pH 7.
- Si se trata de un paciente recién transfundido considerar que pudieran presentarse
dobles poblaciones celulares.
- La flebotomía debe realizarse de manera adecuada evitando ocasionar hemólisis
mecánica.
- Los tubos de sangre coagulada deben separarse perfectamente en un lapso no
mayor de cuatro horas para evitar que el complemento se degrade.
Referencias: https://www.medigraphic.com/pdfs/transfusional/mt-2017/mt171a.pdf

3. Revise la frecuencia de los fenotipos en raza blanca y raza negra para los
siguientes Sistemas:
● Kell ( K+ k-), (K-k+), (K+k+), (K-k-).

● Duffy (Fya + Fyb-), (Fya – Fyb+), (Fya + Fyb+), (Fya- Fyb-).

Referencias: https://www.redalyc.org/journal/535/53559114023/html/

● Kidd (Fya + Fyb-), (Fya – Fyb+), (Fya + Fyb+), (Fya- Fyb-).

 Referencias:https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-
29481997000100006
● Lewis (Lea+Leb-), (Lea-Leb+), (Lea+Leb+), (Lea-Leb-).

Referencias: https://www.franrzmn.com/sistema-lewis/

● Lutheran (Lua+Lub-), (Lua-Leb+), (Lua+Lub+), (Lua-Lub-).

4. Revisar el fundamento de la prueba de antiglobulina indirecta aplicada a la

determinación de antígenos eritrocitarios.
La prueba de la antiglobulina indirecta (de Coombs indirecta) se utiliza para detectar
anticuerpos IgG contra eritrocitos en el plasma del paciente. Se incuba el plasma del
paciente con eritrocitos reactivos; después, se agrega suero de Coombs (anticuerpos contra
IgG humana o anti-IgG humana).
Referencias:https://www.msdmanuals.com/es-
co/professional/multimedia/figure/hem_indirect_coombs_test_es#:~:text=La
%20prueba%20de%20la%20antiglobulina,o%20anti%2DIgG%20humana).

3. LABORATORIO
3.1 MATERIALES Y REACTIVOS
• Tubos de 12 x 75 mm de fondo redondo.
• Suero de Coombs poliespecífico (Anti- IgG y anti- complemento)
• Solución salina.
• Muestra de sangre anticoagulada del paciente.
3.2 PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE FENOTIPOS EN FASE DE
ANTIGLOBULINA
Casa comercial Sanquin .Reactivo para raros grupos sanguíneos. Método AGT
(k, Kpa,Kpb, Fya, Fyb, Lua, Lub,s, Wra)
4. INTERPRETACIÓN
POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.( Se debe
reportar la afinidad de la reacción. (Escala de Cruces)
NEGATIVA: Suspensiones homogéneas. Indica la ausencia del antígeno
correspondiente.
Nota: Probar siempre los resultados negativos con células control de Coombs Para
validar la prueba debe existir aglutinación al agregar las células, centrifugar y leer,
5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA
Resultados positivos inesperados a causa de: poliaglutinación, autoaglutinación,
reacción de aglutinación mixta.
Resultados negativos o débiles a causa de antígenos débiles, reacción de
aglutinación mixta, actividad reducida del reactivo.
Células rojas con PAD Positiva producen un resultado falso positivo.

3.3 PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE FENOTIPOS POR AGLUTINACIÓN EN

PRUEBA DIRECTA

4. INTERPRETACIÓN
POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.( Se debe
reportar la afinidad de la reacción. (Escala de Cruces)
NEGATIVA: Suspensiones homogéneas. Indica la ausencia del antígeno
correspondiente.
5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA
Resultados positivos inesperados a causa de: pseudo aglutinación, aglutinación,
reacción de aglutinación mixta, presencia de gelatina de Wharton en las células de
cordón umbilical.
Resultados negativos o débiles a causa de antígenos débiles, reacción de
aglutinación mixta, actividad reducida del reactivo.
Células rojas con PAD Positiva pueden producir un resultado falso positivo. Para
En estos casos se recomienda usar un control monoclonal inerte.

3.4 DETERMINACIÓN DE FENÓTICOS JKA y JKb (IgM) con antisuero Monoclonal.

Casa comercial Sanquin

4. INTERPRETACION
POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.( Se debe
reportar la afinidad de la reacción. (Escala de Cruces)
NEGATIVA: Suspensiones homogéneas. Indica la ausencia del antígeno
correspondiente.
5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA
Resultados positivos inesperados a causa de: pseudo aglutinación, aglutinación,
reacción de aglutinación mixta, presencia de gelatina de Wharton en las células de
cordón umbilical.
Resultados negativos o débiles a causa de antígenos débiles, reacción de
aglutinación mixta, actividad reducida del reactivo.
Células rojas con PAD Positiva pueden producir un resultado Falso positivo. Para
En estos casos se recomienda usar un control monoclonal inerte.
3.5 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIÓN DE FENOTIPOS Cw, Jka, Jkb, M y
anti N.
Casa Comercial Diagast ( Reactivos con anticuerpos monoclonales de tipo IgM
obtenidos a partir de sobrenadantes de cultivos in vitro de hibridomas de origen
humano)
4. INTERPRETACION
POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.
NEGATIVA: Suspensiones homogéneas, indican la ausencia del antígeno
correspondiente.
3.6 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE FENOTIPO Lea
Diagast

4. INTERPRETACIÓN
POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.
NEGATIVA: Suspensiones homogéneas, indican la ausencia del antígeno
correspondiente.
3.7 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE FENOTIPO Leb Diagast

4. INTERPRETACION
POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.
NEGATIVA: Suspensiones homogéneas, indican la ausencia del antígeno
correspondiente.
3.6. ROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE FENOTIPO P1 Diagast

4. INTERPRETACIÓN
POSITIVA: Aglutinación. Indica la presencia del antígeno correspondiente.
NEGATIVA: Suspensiones homogéneas, indican la ausencia del antígeno
correspondiente.