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Introducción

La producción agroindustrial de maní en argentina en la provincia de Córdoba, presenta una

alta presión por parte de enfermedades fúngicas, transportadas por las semillas como el
carbon del mani producida por Thecaphora frezzi y el tizon del mani ocasionado por sclerotinia
minor, allá se usan aplicaciones químicas para combatir la enfermedad, sin embargo, estos
presentan consecuencias en la salud humana, sobre el medio ambiente y sobre el microbiota
del suelo. Por esta razón se buscan alternativas como es el biocontrol, en este caso se utilizan
preparados de microorganismos que aplicados al suelo o a la semilla favorecen la intereccion
rizosfera – suelo.

Así los organismos utilizados son bacterias del género Bacillus, las cuales tienen la capacidad
de producir metabolitos antimicrobianos y antifúngicos, por ejemplo, B. subtilis, el cual ha
demostrado una reducción significativa la población de Aspergillus flavus, además
Thricoderma es un hongo ampliamente utilizado en la agricultura y las aplicaciones de este
hongo indujo crecimiento vegetal en aplicaciones realizadas en Mani.

Objetivo

Se pretende evaluar el efecto biocontrol sobre Aspergillus flavus, Fusarium sp., Sclerotinia
minor y Thecaphora frezzi y la promoción de crecimiento en maní al inocular Trichoderma
harzianum y Bacillus subtilis en condiciones controladas y campo.

Materiales y métodos

Los biológicos utilizados T. harzianum y B. subtilis fueron aislados de lotes de producción de

maní de Córdoba e identificados como las cepas CT306 y CT104 respectivamente,

El efecto antagonista de cada microorganismo fue evaluado in vitro en estudios previos.

Se utilizaron semillas de maní Var. Granoleico.

En el ensayo en condiciones controladas se evaluó la eficiencia de control de los biológicos en

estudio sobre los siguientes patógenos asociados a semillas: A. flavus, Fusarium sp., S. minor y
T. frezzi.

El biocontrol de cada patógeno con los microorganismos se llevó a cabo por separado, para lo
cual se prepararon macetas de 30 cm de diámetro con sustrato compuesto por tierra: arena
(3:1) previamente esterilizado mediante autoclavado. Los tratamientos evaluados fueron: a)
Testigo (semilla infectada con patógeno en sustrato estéril); b) inoculación con T. harzianum
(semilla infectada con patógeno en sustrato inoculado con T. harzianum 1x108 conidios mL-1; 1
L m3 de sustrato); c) inoculación con B. subtilis (semilla infectada con patógeno y a las 24 h
inoculada con B. subtilis 2.5x1010 UFC en dosis de 100 mL/100 kg de semillas, en sustrato
estéril) y d) inoculación combinada con T. harzianum y B. subtilis (semilla infectada con pa-
tógeno y a las 24 h inoculada con B. subtilis y T. harzianum en las mismas dosis y concentración
de los tratamientos anteriores).
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En el campo, Los tratamientos evaluados fueron: a) Testigo (semilla sin tratamiento); b)

Fungicida (Pretratado con Metalaxil-M 1.0 g/Fludioxonil 2.5 g; 750 cc/100 kg semilla); c)
Fungicida + T. harzianum (Pretratado con fungicida + Preinoculación con T. harzianum 1 x 108
conidios viables mL-1; 200 mL/100 kg semilla + adherente); d) Fungicida + B. subtilis (Pretratado
con fungicida + Preinoculación con B. subtilis (2.5 x 1010 UFC/L; 100 mL/100 kg semilla); e)
Fungicida + T. harzianum + B. subtilis (Pretratado con fungicida + Preinoculación con T.
harzianum y B. subtilis en las mismas dosis y concentración de los tratamientos anteriores).

El ensayo se condujo en un diseño completamente al azar. Cada unidad experimental estuvo

constituida por cuatro macetas por duplicados para cada tratamiento evaluado. El ensayo se
repitió completo dos veces. Desde la siembra y hasta los 60 DDS. (días después de la siembra)
se evaluaron los signos y síntomas de cada enfermedad por observación visual, lupa es-
tereoscópica y microscopio óptico.

Las variables evaluadas fueron: porcentaje de plantas emergidas a los 28 DDS, crecimiento de
plantas medido como peso seco (PS) a los 30 y 165 DDS (Pérez y Arguello, 1995). Al final del
ciclo.

(165 DDS) se procedió a la cosecha manual de cada repetición en cada tratamiento para poder
determinar: grado de madurez de acuerdo al método de raspado de vaina (Pérez et al., 2004),
porcentaje de infección de vainas con T. frezzi (March y Marinelli, 2005), rendimiento de
vainas y granos (qq/ha) y calidad granométrica como porcentaje de granos confitería.

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Introducción

La familia Brassicaceae incluye plantas que no son hospedantes de hongos micorrízicos

arbusculares (HMA) como la planta modelo Arabidopsis thaliana (arabidopsis) y la planta de
cultivo de importancia económica Brassica napus (colza). Es bien sabido que las especies de
Trichoderma tienen la capacidad de colonizar la rizosfera de las plantas de Brassicaceae,
promoviendo el crecimiento y desarrollo, así como estimulando las defensas sistémicas.

Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) son capaces de establecer relaciones simbióticas
con la mayoría de plantas terrestres, incluidas especies de gran interés económico para la
agricultura. Como resultado, la planta se beneficia de una mejor absorción de agua y
nutrientes, mientras que el hongo recibe un lugar para desarrollar las estructuras micorrízicas
y la absorción de azúcares producidos durante el proceso fotosintético. Sin embargo, la
pérdida de genes esenciales para la simbiosis durante la evolución ha llevado a la incapacidad
de varios linajes de plantas con flores, incluidas la mayoría de las plantas de la familia
Brassicaceae, para formar relaciones simbióticas de AMF.

Una compleja red reguladora mediada por fitohormonas, que involucra las vías del ácido
salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y etileno (ET), juega un papel clave durante el proceso de
colonización de la raíz de HMA o Trichoderma.

Objetivos

Los objetivos de este estudio han sido analizar: i) el efecto de la aplicación combinada de T.
harzianum T34 y una formulación de HMA sobre la colonización de raíces fúngicas de dos no
hospedantes (arabidopsis y colza) y un hospedero (Solanum lycopersicum, tomate) Plantas de
HMA y en la producción de arabidopsis y silique de colza; ii) los cambios transcriptómicos de
las plantas derivados del uso combinado de estos dos inóculos fúngicos; y iii) el papel de SA y
JA en la colonización de raíces de hongos cuando se aplican juntos T34 y AMF.

Materiales y métodos

Material vegetal. El ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana, su mutante sid2 alterado por SA y
su mutante coi1-30 alterado por JA, así como Solanum lycopersicum cv. Marmande y Brassica
napus cv. Jura fueron las plantas utilizadas en este estudio.

Cultivos de hongos. En este estudio se utilizó Trichoderma harzianum CECT 2413 (Colección
Española de Cultivos Tipo, Valencia, España) (denominada cepa T34). La cepa T34 se cultivó
rutinariamente en agar patata-dextrosa (PDA, Sigma-Aldrich, Madrid, España) en la oscuridad a
28 ° C y las esporas se almacenaron a -80 ° C en una solución de glicerol al 20%. Las esporas se
recolectaron de placas PDA de 7 días de edad como se describió anteriormente, y se
determinó una concentración final usando un hemocitómetro y se ajustó a 2 × 107 esporas mL
− 1.

Como inóculo de HMA se utilizó la formulación micorrízica Miratext-02, proporcionada por

Mirat Fertilizantes (Salamanca, España), que contenía al menos 1 × 106 esporas kg − 1 en un
sustrato inerte e incluía cinco especies diferentes de HMA

Inoculación de hongos y condiciones de crecimiento de las plantas. Las semillas se sembraron

en medio sólido de Murashige y Skoog (MS) (Duchefa, Haarlem, Países Bajos) (agar 1%) con
sacarosa (1%) y las placas se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 22 ° C, 40% de
humedad relativa (HR). y un fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de oscuridad a 80-100 μE m − 2 s
− 1, durante 7 (colza), 10 (arabidopsis) y 16 (tomate) días. Las plántulas se transfirieron
individualmente a 0.2 (para arabidopsis) y 5 (para colza y tomate) macetas en L, que contenían
una mezcla de turba / vermiculita (3: 1), se mantuvieron en condiciones de invernadero como
se describió anteriormente y se regaron según fuera necesario. Para cada tipo de planta, los
cuatro tratamientos considerados fueron: sin tratar (control) y plantas tratadas con HMA, T34
y HMA más T34. La inoculación de HMA se realizó enterrando 1 g de Miratext-02 (1000
esporas g − 1) por maceta a 5 cm por debajo de la superficie del sustrato justo antes de
trasplantar las plántulas. Las plantas tratadas con T. harzianum T34 se inocularon en la raíz con
1 mL de un

suspensión de conidios que contiene 2 × 107 esporas mL − 1 una semana después del
trasplante de las plántulas. Se utilizaron veinte plantas para cada tipo de planta y tratamiento,
y cada ensayo se repitió tres veces.

Las silicuas de 15 plantas de arabidopsis y colza por condición se recogieron al final del ciclo de
vida y se contaron (11 semanas para arabidopsis y 19 semanas para colza). Los análisis de
colonización de raíces fúngicas y expresión de genes de defensa se realizaron con raíces de un
total de 60 plantas de arabidopsis, colza y tomate. Para cada tipo de planta, se combinaron las
raíces de cinco plantas por cada tratamiento y se consideraron los grupos de raíces de tres
ensayos independientes. Las raíces se recolectaron una semana después de la inoculación de
T34 y durante la formación de los primordios florales en plantas de 5- (arabidopsis), 10- (colza)
y 7- (tomate) semanas de edad, excepto en el caso de los mutantes arabidopsis ya que el
mutante sid2 no pudo alcanzar el crecimiento reproductivo en presencia de T34.
En este último caso, las raíces se recolectaron 10 días después de la inoculación de hongos
cuando las plantas tenían 4 semanas de edad. Todo el material de la raíz se lavó con agua
hasta que no quedó sustrato, inmediatamente se congeló con nitrógeno líquido y se pulverizó
con un mortero.

Cuantificación de la colonización de raíces fúngicas. La cuantificación de ADN de T34 y AMF en

las raíces de plantas de colza, arabidopsis y tomate se realizó mediante qPCR como se
describió anteriormente62,63, con algunas modificaciones. El ADN se extrajo de las raíces de
las plantas no tratadas (control) y las plantas inoculadas con AMF, T34 y AMF más T34. Se
preparó una mezcla en un volumen de 10 μL utilizando 5 μL de Brilliant SYBR Green QPCR
Master Mix (Roche, Penzberg, Alemania), 10 ng de ADN, los cebadores directo e inverso a una
concentración final de 100 nM, y

agua de grado PCR sin nucleasas para ajustar el volumen final. Se utilizaron el gen ARNr 18S de
AMF64 y los genes Actina de Trichoderma, arabidopsis, colza y tomate; sus pares de cebadores
correspondientes se indican en la Tabla 3. Las amplificaciones se realizaron en un Sistema de
Detección de Secuencias ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.)
programado para 40 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización, 95 ° C durante 15
s; recocido,

60 ° C durante 1 min; extensión, 72 ° C durante 1 min. Cada PCR se realizó por triplicado
utilizando el ADN extraído de 3 grupos de raíces de 5 plantas cada una para cada tratamiento y
tipo de planta. Los valores de umbral de ciclo sirvieron para calcular la cantidad de ADN
fúngico utilizando curvas estándar. Los valores de ADN de Trichoderma o AMF se refirieron a la
cantidad de ADN de arabidopsis, colza o tomate en cada muestra correspondiente. Los
cebadores utilizados para la cuantificación del ADN de cada especie son suficientemente
específicos, sin mostrar ninguno de ellos, reacción cruzada con ninguna de las demás especies
fúngicas y / o vegetales utilizados.

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Arabidopsis y producción de colza. El número de silicuas se utilizó para determinar la

capacidad productiva de las diferentes plantas de Brassicaceae utilizadas. La producción de
silicuas fue significativamente mayor en plantas de arabidopsis y colzas inoculadas con T.
harzianum T34 en contraste con las plantas de control no tratadas (Fig. 1), mientras que la
producción fue menor en plantas solo desafiadas con HMA. Sin embargo, el mayor número de
silicuas se registró para arabidopsis y plantas de colza tratadas con HMA más T34.