Licenciatura

en
Biotecnología
Centro de Ciencias Básicas
Departamento de Biología
Molecular
Academia de Básicas y
Operaciones Unitarias

LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGÍA

ANIMAL
Practica 2: Uso de la cámara de Neubauer y
conteo diferencial

D r . E n C . M a r ti n H u m b e r t o M u ñ o z O r t e g a
Rebeca Ramírez Lloréns
ID: 210308
J e s ú s A l e j a n d r o R e y e s M a r tí n e z
ID: 237932
Victoria Elizabeth Vargas Andrade
ID: 187848
Fernanda Velazco Pachicano
OBJETIVO: El alumno deberá conocer el correcto funcionamiento de la cámara de Neubauer, así como las
características que lo componen.

FUNDAMENTO: El conteo celular es una parte fundamental puesto que permite hacer diluciones de células
precisas durante la resiembra, ensayos y cinéticas de crecimiento.
Durante hace más de un siglo, ha evolucionado la cámara de Neubauer, que va desde el primer método de
células hemáticas mediante un dispositivo de lentes rudimentarios en 1794 hasta lo que conocemos hoy.
Se conoce como hematocitómetro empleado para el conteo de células o partículas. Consta de la lámina con
los dos pozos y un cubreobjetos además de que tiene dos cámaras de 0.1 mm, donde cada cámara se divide
en nueve cuadrados de 1mm2 y el cuadrado del centro se encuentra subdividido en cinco por cinco cuadrados
de 0.2mm de lado y superficie de 0.04mm2 cada uno.
Para la determinación de leucocitos total se extrae la sangre por punción venosa o capilar, donde se colecta en
un tubo con anticoagulante agitándole suavemente. Para hacer el recuento se utilizan los cuatro cuadros de
1mm2 de las esquinas de la cuadrícula, cada uno de ellos dividido en 16 cuadritos.
Se pasa la pipeta al agitador y se mezcla durante un minuto para posteriormente colocar la cámara de conteo
sobre una superficie horizontal y se pone el cubreobjetos sobre las mesetas. Se carga la cámara con la quinta
gota y se deja reposar durante dos minutos para proceder a la localización de la cuadrícula a seco débil.
Fórmula para el cálculo de conteo celular en cámara de Neubauer:

leucocitos Número de células contadas(Dilucion)(10)

Número de =
mm 3 4

Concentración en suspensión (células/mL)=10000 (X/4)*1 microlitros de muestra.

Para poder realizar el conteo se deberán poder diferenciar a los leucocitos de acuerdo a su morfología en
neutrófilos segmentados, en cayado, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos.
La metodología del conteo diferencial se lleva a cabo con base en un frotis sanguíneo el cual se coloca sobre la
platina del microscopio, en donde principalmente se tienen que contar 100 leucocitos.
En ocasiones hay posibles fuentes de error de la cámara de Neubauer, que se pueden presentar en la dilución
mientras que en la tinción puede ser un mal extendido al momento de hacer el frotis.
Dentro de los métodos de cuantificación celular existen los métodos directos como los contadores
electrónicos y los indirectos como los encargados de la cuantificación de ADN y proteínas, sin embargo no
distingue las células viables de las no viables.
RESULTADOS
Ejercicios:

Dilución: 1:20

leucocitos (Número de células contadas)( Dilución)(10)

Número de =
mm3 número de cuadrantes

leucocitos (120)(20)(10)
Número de 3
= =6,000 leucocitos/mm3
mm 4

1. ¿Qué se hace antes de llevarlo a la cámara de Neubauer para tener estos conteos y a partir de ellos,
obtener el número de células por mililitro?
Subcultivo de células en monocapa a suspensión.
1. Preparación de medio
2. Mezcla y rotulación de la alícuota de medio completo
3. Tripsinización de la monocapa
4. Lavar con PBS por la pared de la placa
5. Retirar el PBS
6. Añadir 1ml de tripsina-EDTA directamente sobre las células
7. Incubar 2-3 min a 37°C en estufa
8. Preparar la placa donde se sembrarán de nuevo las células diluidas
9. Retirar la muestra de la estufa y observar la monocapa despegada
10. Comprobación de que las células se encuentran despegadas mediante el microscopio invertido
11. En la cabina de flujo se neutraliza añadiendo el doble de medio completo para inactivar la tripsina y
recoger las células
12. Conteo de células: Mezclar 20 μl de azul de tripano + 20 μl de solución de células
13. Se carga la cámara de Neubauer con 10 μl de cada lado
14. Conteo de células de al menor a 4 cuadrantes de células viables (blancas)
15. Se procede a realizar la siembra de las células diluidas, primero el medio y posteriormente las células.
16. Finalmente se mezcla suavemente
 2. ¿Cuántas células crecieron en el cultivo confluente?

células Número de células contadas( Factor de la camara)( FD )(mLde resuspensión de células)

Número de =
mL número de cuadrantes

células 68(10,000)(10)(1) cel

Número de = =1.7 x 106
mL 4 mL

Cálculo para sembrar 5000 células a partir del cálculo anterior y 15000
-24 posos
Para sembrar 5000 células:
Leucocitos por 1ml = 1,700,000 ( 1.7 x 106 )
Leucocitos que se desean sembrar = 5,000
Volumen = ¿?
ml = (5,000 células) (1) / (1,700,000 células) = 2.941 x 1 0−3 = 2.941 µl

Para sembrar 15000 células:

Leucocitos por 1ml = 1,700,000 ( 1.7 x 106 )

Leucocitos que se desean sembrar = 1,5000

Volumen = ¿?
ml = (1,5000 células) (1) / (1,700,000 células) = 8.82 x 10−4 = 8.82 µl

DISCUSIÓN
El conteo de células por cámara de Neubauer es una de las técnicas más ampliamente usadas en la actualidad,
te permite realizar conteos diferenciales para la obtención de vitalidad o viabilidad de varios tipos celulares. Al
realizar el conteo es sumamente importante utilizar siempre el mismo criterio, siendo común no contar las
células que estén sobre las aristas que apuntan hacía el centro de la cámara (Gomes, 2019), esto se hace para
evitar contar una célula dos veces que se ubica sobre la línea limítrofe de cada cuadrícula. Las células que se
ubiquen en las líneas izquierdas y superiores se cuentan y las que se ubiquen sobre las líneas derechas e
inferiores se ignoran (Rivadeneyra, 2001).
La cámara de Neubauer cuenta con 5 cuadrantes para el conteo, los 4 cuadrantes laterales y esquinados son
donde se realizan la mayoría de los conteos (hematíes y leucocitos), mientras que la zona central se usa
únicamente para el conteo de las plaquetas (Rivadeneyra, 2001).
Algunas de las consideraciones que se deben de tomar en cuenta son (GAB):

1. Debe haber uniformidad en los resultados obtenidos entre los distintos cuadrados.
2. Debe haber número adecuado de células por cuadrado (ni muchas, ni pocas).
3. Se cuentan por duplicado y el número debe ser similar.
Con los resultados del conteo es posible realizar cálculos para conocer la cantidad de células que se tienen por
ml de muestra.
Al realizar dicha técnica es posible cometer errores que puedan llegar a afectar el proceso del experimento,
algunos de los errores más comunes son (GAB):

1. Tomar mal la muestra.

2. Armar o cargar incorrectamente la cámara.
3. Tamaño de muestra inadecuado (nunca menos de 100 células).
4. Distribución heterogénea.
 5. Errores humanos (contar mal o perder la cuenta, hacer mal los cálculos, mala visualización, no usar
criterios homogéneos, subjetividades, errores de dilución).
Las características básicas de una cámara Neubauer son (GAB):
1. Cuadro grande central (centro de la cruz, 400 cuadros pequeños): 1mm /400 cuadros.
2. Cuadro mediano (formado por 5x5=25 cuadros pequeños): 0.25 mm x 0.25 mm.
3. Cuadro pequeño: 0.05 mm x 0.05 mm = 0.0025 mm.
4. Líneas separadoras de cuadros medianos (en rojo): 0.025 mm del extremo del cuadro pequeño.

CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
 GOMES O. (2019). Hemograma Como Hacer e Interpretar. Páginas 317-319.
 GAB Sistemática Analítica S.L. Cámara Thoma y Neubauer Improved Para el Recuento de Levaduras
(tiraje).
 Rivadeneyra D. E., Galán Z. R. (2001). Guía de Laboratorio de Hematología.