UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ingeniería

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fortificación de yogur con polifenoles

Tesis de Grado Ingeniería de Alimentos

María Laura Mediza Romero

Directoras:

Mariana von Staszewski - María Julia Martinez

Buenos Aires, 2018

 La accesibilidad a los alimentos es un compromiso de toda la
humanidad. Es parte de nuestra obligación profesional poner el
conocimiento adquirido al servicio de que más seres humanos puedan
acceder a alimentos nutritivos.
Agradecimientos
A Mariana y Julia por la dedicación, la motivación, el criterio y el compromiso desde el
primer día. Por hacer que la realización de la tesis, no sólo haya sido posible, sino que también fuera
con un entusiasmo permanente. Por generar que la incorporación de conocimientos sea una tarea
disfrutable.

A mi familia por la contención, la confianza, el aliento y la incondicionalidad, a lo largo de la

carrera y de mi vida.

A mis amigos de la facultad por darle la cuota de alegría a cada día de estudio.

A mis amigos de la vida por acompañar y compartir conmigo el día a día de mis dudas y
certezas respecto a mi futura profesión.

A todas las personas que a lo largo de estos años han sido parte de mi formación por
brindarme su tiempo y conocimientos.

A todos los que colaboraron con mi tesis, ya sea con información, consejos, una frase de
aliento o un lugar en su escritorio.

Simplemente, gracias.
Resumen
Un desafío para la industria de alimentos es conciliar la demanda del consumidor de
alimentos más saludables con la demanda simultánea de comodidad y calidad del producto,
incluidas la textura y el sabor.
El presente trabajo explora la factibilidad de fortificar con polifenoles un alimento conocido
por sus cualidades nutricionales y consumido popularmente, como es el yogur, sin modificar en gran
medida sus características organolépticas, físicas y estructurales. Adicionalmente, se evaluaron dos
métodos de incorporación de los polifenoles: de manera directa y vehiculizados en partículas
proteicas WPC-gelatina.
Se elaboraron seis formulaciones de yogur firme: tres de ellas con partículas proteicas WPC-
polifenol-gelatina con distintas concentraciones de polifenoles (0,025; 0,05 y 0,1 % p/p), una sin
partículas con polifenol (0,1 % p/p), un control sin agregados de partículas ni polifenol y un control
con partículas proteicas WPC-gelatina sin polifenol. A lo largo de la vida útil de los yogures se
analizaron las características relacionadas con la estructura (capacidad de retención de agua,
parámetros texturales, reológicos y microestructura) de los mismos, la viabilidad de las bacterias
lácticas, y la capacidad antioxidante de los polifenoles. Finalmente, se determinó la bioaccesibilidad
de los mismos luego de una digestión gastroduodenal in vitro.
Los resultados de este trabajo demostraron que independientemente del método de adición de
los polifenoles, éstos no modificaron en gran medida el color del yogur, ni la viabilidad de las
bacterias ácido lácticas. Sin embargo, se observó que la adición de polifenoles, generó un yogur con
una estructura más interconectada que el yogur control, lo que fue atribuido a la capacidad de los
polifenoles de interactuar con las proteínas lácteas. Esta estructura más interconectada podría
explicar la mayor capacidad de retención de agua y los mayores valores de firmeza, adhesividad y
cohesividad observados en este yogur. Además, la incorporación de partículas proteicas incrementó
más aún estos parámetros por el mayor contenido proteico presente en dichas formulaciones. En
relación a las propiedades bioactivas de los polifenoles se observó que luego de la digestión
gastroduodenal se obtuvo una alta bioaccesibilidad de los mismos, manteniendo su actividad
antioxidante.
Por lo tanto, se puede concluir que es factible la fortificación de yogur con polifenoles de té
verde para el desarrollo de un alimento funcional. Además, en lo que respecta al método de adición
de los polifenoles, en este producto con alto contenido de proteínas no se justificaría el uso de las
partículas proteicas como vehículo de los polifenoles, ya que las proteínas propias de la leche
actuarían como ¨protectoras¨ de estas biomoléculas.
Introducción _______________________________________________________________ 1
Alimentos funcionales ____________________________________________________________2
Características de los alimentos funcionales __________________________________________________2
Fortificación de alimentos _________________________________________________________________4
Leche _________________________________________________________________________5
Agua__________________________________________________________________________________7
Lactosa ________________________________________________________________________________7
Lípidos ________________________________________________________________________________7
Proteínas ______________________________________________________________________________8
Vitaminas y minerales ___________________________________________________________________11
Suero de queso_________________________________________________________________11
Gelatina ______________________________________________________________________12
Té Verde______________________________________________________________________13
Polifenoles ____________________________________________________________________14
Propiedades benéficas para la salud de los polifenoles _________________________________________18
Propiedades antioxidantes de los polifenoles _________________________________________________19
Impacto sensorial de los polifenoles ________________________________________________________21
Propiedades antimicrobianas de los polifenoles _______________________________________________22
Interacción y asociación de polifenoles y proteínas ___________________________________24
Encapsulación de polifenoles en nano-micropartículas proteicas _________________________________25
Yogur ________________________________________________________________________28
Etapas del proceso de elaboración del yogur _________________________________________________29
Bibliografía ___________________________________________________________________34

Objetivos _________________________________________________________________ 45
Objetivo general _______________________________________________________________46
Objetivos particulares___________________________________________________________46

Materiales y Métodos _______________________________________________________ 47

Materiales ____________________________________________________________________48
Obtención de las nano-micropartículas proteicas ____________________________________48
Carga superficial de las partículas proteicas en solución ______________________________50
Caracterización del tamaño de las partículas proteicas _______________________________52
Formulación de los yogures ______________________________________________________53
Proceso de elaboración de yogur __________________________________________________54
Diagrama de flujo ______________________________________________________________________56
pH ___________________________________________________________________________56
Color_________________________________________________________________________57
Capacidad de retención de agua __________________________________________________58
Atributos mecánicos asociados a la textura _________________________________________59
Caracterización del comportamiento viscoelástico ___________________________________60

i
 Color _______________________________________________________________________57
Capacidad de retención de agua ________________________________________________58
Atributos mecánicos asociados a la textura _______________________________________59
Caracterización del comportamiento viscoelástico _________________________________60
Microestructura _____________________________________________________________62
Viabilidad de bacterias lácticas _________________________________________________63
Actividad antioxidante ________________________________________________________64
Polifenoles totales ____________________________________________________________64
Digestión gastroduodenal in vitro de los yogures ___________________________________65
Fluidos que simulan las condiciones de digestión gástrica y duodenal _________________________ 65
Proceso de simulación de la digestión gastroduodenal in vitro _______________________________ 66
Análisis estadístico ___________________________________________________________67
Bibliografía _________________________________________________________________68

Resultados y Discusión ___________________________________________________ 70

Caracterización de las partículas proteicas _______________________________________71
Potencial zeta _____________________________________________________________________ 71
Distribución de tamaño de partículas ___________________________________________________ 73
Caracterización del yogur _____________________________________________________76
Evolución del pH durante el proceso de fermentación ______________________________________ 76
Evolución del pH durante el almacenamiento ____________________________________________ 78
Color ____________________________________________________________________________ 79
Capacidad de retención de agua _______________________________________________________ 83
Atributos mecánicos asociados a la textura ______________________________________________ 85
Comportamiento viscoelástico ________________________________________________________ 89
Microestructura ___________________________________________________________________ 93
Viabilidad de bacterias ácido lácticas (BAL) _____________________________________________ 95
Polifenoles Totales _________________________________________________________________ 97
Actividad Antioxidante _____________________________________________________________ 99
Digestión gastroduodenal in vitro de los yogures __________________________________102
Bibliografía ________________________________________________________________105

Conclusiones ____________________________________________________________112
Introducción
 Alimentos funcionales
Los alimentos funcionales son aquellos alimentos que proporcionan beneficios para la salud
más allá de la nutrición básica (Tur & Bibiloni, 2016). Se trata de alimentos que pueden tener un
efecto beneficioso sobre una función fisiológica del cuerpo humano y mejorar con ello el estado de
salud y bienestar de los individuos, así como reducir el riesgo de aparición de enfermedades.

La investigación ha demostrado que las propiedades promotoras de la salud de los alimentos

funcionales se derivan del contenido de sustancias bioactivas, tales como polifenoles, fibra dietética,
vitaminas, probióticos, prebióticos, ácidos grasos y minerales (Bigliardi & Galati, 2013; Tur et al.,
2016). Los alimentos funcionales constituyen un campo emergente en la ciencia de los alimentos en
la actualidad. Entre los logros más mencionados en la literatura científica y en el marketing de los
productos alimenticios se encuentran la mejora de las funciones gastrointestinales, el aporte de
antioxidantes y la modificación del metabolismo de macronutrientes (Tur et al., 2016).

El concepto de alimentos funcionales nace en Japón en la década de 1980 cuando las

autoridades alimentarias japonesas tomaron conciencia de que para controlar los gastos globales en
salud era necesario desarrollar alimentos que mejoraran la calidad de vida de la población,
cubriendo ciertas “deficiencias pandémicas” (Goldberg, 1994). La posibilidad de modular ciertas
funciones de la salud mediante el consumo de alimentos fortificados o enriquecidos con elementos
bioactivos ha aumentado la demanda en forma exponencial de este tipo de alimentación en todo el
mundo, y la aparición de patentes relativas al diseño de alimentos funcionales y su beneficio
económico ha disparado el interés por parte de la industria alimentaria (Khan, Grigor, Winger &
Win, 2013). El interés a nivel mundial de contar con alimentos que sean más beneficiosos para la
salud se vio apoyado por los cambios socioeconómicos y demográficos que se dieron en la
población actual. A principios del Siglo XXI, la ciencia atiende a esta nueva perspectiva y se plantea
el estudio de la promoción de la salud a través de la alimentación con horizontes más amplios
(Sastre Gallego, 2005). Así nace el concepto de “alimentación funcional” en distintos ámbitos
científicos de Asia, Europa y América (Diplock, Aggett, Ashwell, Bornet, Fern & Ruberfroid,
1999).

Características de los alimentos funcionales

Un alimento es funcional si contiene algún componente (sea o no un nutriente) que beneficia

una o un número limitado de funcionalidades en el organismo proporcionando salud (entendida

2
como reducción de riesgo de enfermedad) y bienestar. Un alimento o ingrediente funcional puede
ser un macronutriente si posee efectos fisiológicos específicos, como puede ser el almidón resistente
a los jugos gástricos o un ácido graso o incluso un nutriente esencial. Puede referirse también a un
componente alimenticio que a pesar de poseer un valor nutritivo no es esencial, como por ejemplo
los oligosacáridos, o incluso puede carecer de valor nutritivo (como pueden ser los organismos
vivos o compuestos químicos de plantas) (Juarez, Olano & Morais, 2005).

Un alimento puede acabar siendo funcional si durante su procesado se le ha realizado alguna

de las siguientes operaciones:
-Eliminación de un componente alimenticio conocido como causante o determinante de una
enfermedad. Ejemplos pueden ser las proteínas alergénicas de ciertos alimentos o la eliminación de
la lactosa de ciertos productos lácteos.
-Incremento en la concentración de un componente alimenticio. Esta operación de
fortificación, o añadidura de un componente activo, hace que la dosis diaria del mismo se acerque a
las recomendaciones de los organismos reguladores, lo que a la larga redundará en una disminución
de riesgos de enfermedad.
-Adición de un componente que no está presente en la mayoría de los alimentos. No
necesariamente debe ser un macronutriente o un micronutriente.
-Reemplazo de macronutrientes, como por ejemplo la grasa.
-Incremento de la biodisponibilidad o estabilidad de algún biocomponente.

Los objetivos primarios de la ciencia de la alimentación funcional son identificar las

interacciones beneficiosas entre un alimento concreto y una o más funciones del organismo y,
además, obtener evidencias sobre los mecanismos implicados en la interacción. Por ejemplo,
algunos de los alimentos funcionales se han diseñado para satisfacer ciertos aspectos como:
-Funciones gastrointestinales. Estas funciones incluyen aquellas que están asociadas a la
microflora bacteriana en el colon, a la modulación en la actividad endocrina e inmune del tracto
gastrointesinal, al control de la biodisponibilidad de nutrientes (sobre todo de minerales) y al control
del tiempo de tránsito (Zhang, Ju & Zuo, 2018b).
-Sistemas antioxidantes. Incluyen vitaminas, polifenoles y otros antioxidantes naturales de
origen vegetal. Las actividades rédox y la protección antioxidante son muy importantes para las
células y tejidos y su desequilibrio se asocia con la aparición de diversas enfermedades (Comert &
Gokmen, 2018) .
-Ayuda al feto. El alimento de la madre y del feto son objetivos en algunos alimentos
funcionales, un ejemplo es el ácido fólico (Singh et al., 2018).

3
 -Salud mental y rendimiento. Por ejemplo algunos carbohidratos pueden afectar los niveles de
serotonina o bien la cafeína, que mantiene el estado de alerta ya que es un competidor antagonista
de los receptores de adenosina (Tur et al., 2016).
-Protección contra el cáncer. Se ha estudiado la relación de ciertos hábitos alimentarios con la
incidencia de cáncer (Martínez Leo, Altamirano, Segura Campos & Grumezescu, 2018).
-Salud ósea y osteoporosis. Por ejemplo la fortificación de los alimentos con calcio y
vitamina D (Whiting & Vatanparast, 2011).

Fortificación de alimentos

Los alimentos fortificados y enriquecidos son alimentos envasados, preparados especialmente,

que se diferencian por su composición y/o por sus modificaciones físicas, químicas, biológicas o de
otra índole, resultantes de su proceso de fabricación o de la adición, sustracción o sustitución de
determinadas substancias componentes.

El Código Alimentario Argentino (CAA) define como Alimentos Fortificados a aquellos que se
elaboran especialmente con un contenido mayor de algún nutriente, su fin es satisfacer necesidades
alimentarias específicas de determinados grupos de personas sanas, y por lo general son elecciones que
toma la industria para agregar valor a sus productos. Por ejemplo, si encontramos leche fortificada con
hierro, significa que la empresa elaboradora le ha incorporado una cantidad mayor de ese mineral a su
producto respecto de lo que contiene ese alimento en forma natural. Es importante tener en cuenta que
la fortificación no es obligatoria, pero en caso que una empresa defina hacerlo deberá cumplir con
ciertos requisitos. Estos alimentos deben cubrir, en una porción del producto, desde un 20% hasta un
50% de los requerimientos diarios recomendados para el nutriente.
Además, los nutrientes incorporados deben:
a) Ser estables en el alimento en las condiciones habituales de almacenamiento, distribución, expendio
y consumo y presentar una adecuada biodisponibilidad.
b) No presentar incompatibilidad con ninguno de los componentes del alimento ni con otro nutriente
agregado.
c) Estar presente en niveles tales que no ocasionen una ingesta excesiva por efecto acumulativo a
partir de otras fuentes de la dieta.

Teniendo en cuenta estos conceptos, en este trabajo se propone desarrollar un alimento

funcional basado en la fortificación de un yogur con polifenoles de té verde, incluyendo además la
evaluación de la encapsulación previa del polifenol.

4
 A continuación se describen las principales materias primas utilizadas para el desarrollo del
alimento funcional.

Leche
La leche es un alimento muy valioso en las diferentes etapas de la vida del ser humano por
sus incomparables características nutricionales: contiene proteínas de alto valor biológico, diversas
vitaminas y minerales, y es la fuente de calcio por excelencia debido a su alta biodisponibilidad. La
leche y sus derivados son alimentos insustituibles en la alimentación del ser humano, por las
siguientes razones:
– Son fuente de nutrientes fundamentales para el crecimiento y desarrollo de los niños por
poseer proteínas, calcio, zinc, magnesio, potasio, fósforo, Vitamina D y Vitaminas del complejo B,
entre otros componentes.
– Son esenciales para la formación y mantenimiento de los huesos por ser fuente natural de
calcio, necesarios para una adecuada salud ósea.

La producción de leche en Argentina estimada en 2016 fue de 9.895,3 millones de litros

(Ministerio de Agricultura de la Nación, 2018). De la producción de leche el 18,3 % se consume
como leches fluidas, mientras que un 74,2 % se destina a la elaboración de productos y el 7,5
corresponde a leche no procesada por la industria.

De este total de leche que se destina a la elaboración de productos, el mayor porcentaje es

utilizado para la producción de quesos (47 %), mientras que la elaboración de leche en polvo (entera
y descremada) insume el 15,5 %. Le siguen en importancia decreciente la manteca, el yogur y el
dulce de leche que demandan el 5 %, 3 % y 2 %, respectivamente. Un porcentaje menor se destina a
postres y flanes y a leche condensada (Tabla 1-1).

La composición química de la leche depende de muchos factores, como la especie, la raza, la

variabilidad animal, la edad, la estación del año, la alimentación, el tiempo de ordeñe, el período de
tiempo entre ordeños, las condiciones fisiológicas, condiciones higiénicas y el que reciba
medicación o no. Sin embargo, los procedimientos realizados para la venta y consumo aseguran una
composición siempre constante, dentro de ciertos márgenes establecidos por la legislación
alimentaria según el tipo de leche.

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Tabla 1-1. Composición porcentual del destino comercial de la leche de vaca (Ministerio de Agricultura de la
Nación, 2018).

2016 Participación (%)

Destino Productos
(% millones de litros) 2010 1016
Leche pasteurizada 66,4 57,5
LECHE FLUIDA Leche esterilizada 18,3 28,4 37,5
Leche chocolatada 5,2 5,0
Leche en polvo entera 78,4 70,1
LECHE EN POLVO 15,5
Leche en polvo descremada 21,6 29,9
Pasta dura 21,4 21,4
QUESOS Pasta semidura 47 41,4 42,3
Pasta blanda 37,2 36,3
Manteca 52,6 46,1
Yogur 27,9 29,7
OTROS PRODUCTOS Dulce de leche 11,7 15,6 19,4
Postres 2,9 3,6
Leche condensada 1,0 1,1
LECHE NO
PROCESADA POR LA 7,5 7,3 7,5
INDUSTRIA

La Tabla 1-2 muestra la composición típica de la leche de vaca. La leche está constituida
principalmente por dos grupos de sustancias: el agua y los sólidos totales (ST). Dentro de los sólidos
totales se encuentran las grasas, proteínas, azúcares, vitaminas y minerales. A su vez, los sólidos
totales menos la grasa reciben el nombre de sólidos no grasos y abreviadamente se designan SNG.

Tabla 1-2. Composición porcentual de la leche de vaca (Moreiras, Carbajal, Cabrera & Cuadrado, 2015).

Componentes %
Agua 88
Lactosa 4,7
Lípidos 3,4
Proteínas 3,2
Cenizas 0,7

La acidez titulable normal de la leche es de 0,14 % (g ácido láctico/100 mL leche) o 14 ºD, y

se debe a la presencia de CO2 disuelto, fosfatos ácidos, grupos ionizables de las proteínas
(carboxilos) y citratos ácidos que se encuentran habitualmente en la leche. El pH normal varía entre
6,5 a 6,7, siendo el más común 6,6 (Kailasapathy, 2008).

6
Agua

El agua de la leche es igual a cualquier otra agua; su función es constituir la fase continua en
la que se encuentran los sólidos, ya sea en solución, suspensión coloidal o emulsión. Lactosa,
proteínas del suero, sales, enzimas, vitaminas hidrosolubles y parte de los minerales se encuentran
en solución, las micelas de caseína forman una suspensión coloidal muy estable y las grasas se
encuentran como emulsión dispersa en la fase continua del suero.

El contenido de agua en la leche por ser relativamente alto, hace que la distribución de sus
componentes sea uniforme y permite que una cantidad muy pequeña de leche contenga casi todos
los nutrientes proporcionados en ésta.

Lactosa

La lactosa es el principal hidrato de carbono de la leche y se encuentra en un 4,7-4,9 %, en la

leche de vaca (Fox, 2011a). Es un disacárido reductor compuesto por una unidad de galactosa y una
de glucosa, unidas por un enlace glicosídico  1-4 (Figura 1-1). Presenta un menor sabor dulce
comparado con otros azúcares y es lábil a la acción de los microorganismos.

Figura 1-1. Estructura química de la lactosa.

Lípidos

La grasa de la leche de vaca es considerada como una de las grasas más complejas de origen
natural, debido a la gran cantidad de ácidos grasos con diferentes estructuras bioquímicas, peso
molecular, y grado de insaturación (Harvatine, Perfield & Bauman, 2009).

El 98 % de los componentes lipídicos son triglicéridos y se asocian formando glóbulos con un

7
diámetro menor a 2 µm que se obtiene por homogeneización de la leche (Tamime & Robinson,
1999). Una membrana, formada por fosfolípidos y proteínas, los rodea y evita su floculación y
coalescencia (Figura 1-2). Los fosfolípidos representan aproximadamente el 1 % y cumplen la
función de emulsionantes naturales de los glóbulos de grasa. El resto de los lípidos son esteroides,
carotenoides y vitaminas liposolubles (A, D, E y K).

Proteína

Agua

Figura 1-2. Diagrama de un glóbulo de grasa y su membrana.

Proteínas

Las proteínas se clasifican en tres categorías: 1) las caseínas, 2) las proteínas del lactosuero, y
3) las proteínas de la membrana del glóbulo graso (Swaisgood, 2008).

Las caseínas constituyen alrededor del 78 % de las proteínas lácteas, son el grupo
predominante de las proteínas de la leche y se subdividen en cinco clases: s1, s2, ,  y . La
Tabla 1-3 muestra los distintos tipos de caseínas y el porcentaje presente en la leche con respecto al
total de las proteínas.

8
 Se las define como fosfogluco-proteínas, esto significa que contienen residuos de hidrato de
carbono y fosfatos, los cuales, generalmente, esterifican a los hidroxilos de las serinas. Los residuos
fosfoserinas les proveen una fuerte carga negativa.

Tabla 1-3. Principales proteínas de la leche (Farrell Jr et al., 2004; Swaisgood, 2008)

Proteínas %
s1 y s2 43 (34,7 y 8,3)
 19
Caseínas 78
 12
 4
-lactoglobulina 11,7
-lactalbúmina 3
Proteínas del suero Proteosa / Peptonas 2,2 20
Inmunoglobulina 2
Albúmina 1,1

Proteínas de la
Proteínas de la membrana del glóbulo
membrana del 2 2
de grasa
glóbulo de grasa

Las caseínas se encuentran asociadas entre sí integrando complejos esféricos conocidos como
micelas. Éstos son agregados coloidales de caseína (92 %) y fosfato de calcio coloidal (CCP) (8 %).
Su estructura es porosa, muy voluminosa y fuertemente hidratada (Ferrandini, Castillo, Lopez &
Laencina, 2006). Tienen un peso molecular promedio de ~108 Da y un diámetro medio de ~100 nm
con un rango que va desde los 50 a los 600 nm. Existen numerosos modelos que intentan explican la
estructura de la micela de caseína. La mayoría de ellos se clasifican en tres categorías: de núcleo y
corteza, de subunidades y de estructura interna (Dalgleish, 1998; Dalgleish, 2011; Dalgleish &
Corredig, 2012; de Kruif, 1999; de Kruif & Holt, 2003; de Kruif, Huppertz, Urban & Petukhov,
2012; Farrell, Malin, Brown & Qi, 2006; Ferrandini et al., 2006; Fox & Brodkorb, 2008; Holt,
Carver, Ecroyd & Thorn, 2013; Horne, 2006; McMahon & Oommen, 2013; Phadungath, 2005). El
más aceptado hoy día es el modelo de subunidades (Figura 1-3), propuesto por primera vez por
Schmidt (1982). Este modelo clásico considera que las micelas de caseína son partículas esféricas
groseras con una superficie rugosa, constituida por pequeñas submicelas con un diámetro entre 12-

9
15 nm. Las submicelas contendrían aproximadamente 20-25 moléculas de caseína con una
composición variable. También se describen, en las submicelas, centros hidrofóbicos y superficies
hidrofílicas. Las distintas submicelas se encuentran unidas mediante CCP, interacciones
electrostáticas e hidrofóbicas mantienen la integridad de las micelas.

Figura 1-3. Modelo de subunidades de la micela de caseína. A: submicela de caseína, B cadena sobresaliente,
C: fosfato de calcio, D: κ-caseina, E: grupos fosfatos (Schmidt, 1982).

El punto isoeléctrico (pI) promedio de las caseínas es de 4,6. A este pH, las caseínas se
encuentran en su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones
intermoleculares, por lo que coagulan y precipitan.

Por su parte, las proteínas del lactosuero constituyen el 20 % de las proteínas presentes en la
leche, y permanecen solubles a un pH de 4,6 (Swaisgood, 2008). Las proteínas del suero lácteo
(WP, por sus siglas en inglés), también se clasifican en distintas fracciones, entre las que se destacan
la -lactoglobulina (-lg), la -lactalbúmina (-la), las proteosas-peptonas, las inmunoglobulinas, la
albúmina (Tabla 1-3). A diferencia de las caseínas, las WP son compactas, globulares, solubles en
un intervalo amplio de pH y sensibles a las altas temperaturas, ya que su mecanismo de estabilidad
es por hidratación y no por carga eléctrica (Badui Dergal, 1990). Durante el calentamiento las
proteínas del suero se desnaturalizan, lo que implica la pérdida de la estructura terciaria y/o
secundaria, la exposición de grupos hidrofóbicos internos y la formación de agregados y polímeros
a través de uniones disulfuro (Surroca, Haverkamp & Heck, 2002). La naturaleza de los agregados
depende de las condiciones de calentamiento, pH y fuerza iónica (Jones, Decker & McClements,
2009; Tolstoguzov, 2007).
El punto isoeléctrico (pI) de la β-lg es cercano a 5,1 (Donato, Schmitt, Bovetto & Rouvet,
2009b; Verheul, Roefs & de Kruif, 1998) y su temperatura de desnaturalización ronda los 70 ºC a
pH neutro (Hoffmann, van Miltenburg, van der Eerden, van Mil & de Kruif, 1997).

10
 La -la es la segunda proteína en orden de importancia del suero (Tabla 1-3). Representa
aproximadamente el 20 % de las WP y un 3 % de las proteínas totales. Su pI es aproximadamente
4,8 y su temperatura de desnaturalización ronda los 65 ºC (Fox, 2011a).

La seroalbúmina bovina (BSA) es una proteína que se encuentra predominantemente en el

sistema circulatorio pero también es parte del suero bovino, aunque en pequeñas cantidades: 0,1-0,4
g/L (Fox, 2011a).

Por último, las proteínas de la membrana del glóbulo graso, que fueron adheridas durante la
secreción apócrina a través de la membrana celular del lactocito, sólo representan alrededor del 2 %
de las proteínas lácteas (Reinhardt & Lippolis, 2006).

Vitaminas y minerales

En la leche cruda se encuentran las vitaminas: A, B1, B2, B5, B6, B12, C, D, E, K. Las
vitaminas liposolubles generalmente se hallan en la membrana del glóbulo de grasa, mientras que
las hidrosolubles se localizan en el suero. Las leches calentadas, hervidas o pasteurizadas carecen de
las vitaminas B5 o ácido pantotémico, B12 o ácido fólico y C o ácido ascórbico.
Los principales minerales presentes en la leche son los cloruros, citratos, y bicarbonatos y
fosfatos de calcio, magnesio, sodio y potasio. Los mismos se encuentran distribuidos entre la fase
soluble y la coloidal. El sodio, el potasio y los cloruros se encuentran mayoritariamente en forma
iónica en solución. Casi la mitad del fósforo se encuentra esterificando a las fosfoserinas de las
caseínas, y casi el 70 % del calcio se encuentra en forma coloidal unido a las caseínas en forma de
sales, y el resto, en forma soluble en el suero (Badui Dergal, 1990).

Suero de queso
Dentro de las proteínas lácteas, las proteínas del suero han sido objeto de interés debido a su
alto valor nutricional y a sus propiedades tecnológicas (Mulvihill & Ennis, 2003). El suero de queso
es un residuo líquido rico en proteínas (6 g de proteína/litro de suero), por lo que resulta de gran
interés recuperar y revalorizar este residuo en un producto de alto valor agregado. Del total de litros
de leche destinados a la producción de quesos, el 85 % de esos litros, queda convertido en suero
luego del proceso. En Argentina la producción de suero de queso en el 2016 fue de
aproximadamente 3900 millones de litros. De ese valor, sólo un 45 % se procesa, lo que implica que
se debe seguir explorando y explotando este recurso proteico con gran potencial de desarrollo de

11
cara a la demanda mundial de proteínas (Ministerio de Agricultura de la Nación, 2018).

Entre los productos proteicos del suero, además de los concentrados (WPC por sus siglas en
inglés, “whey protein concentrates”) con distintas proporciones de proteína, también se encuentran
los aislados de proteínas (WPI por “whey protein isolates”) y proteínas aisladas como la α–
lactalbúmina, β–lactoglobulina, lactoferrina y otras inmunoglobulinas. Todos estos productos se
obtienen por diafiltración o cromatografía de intercambio iónico. Para obtener suero en polvo, WPC
o WPI se utiliza la deshidratación por spray. En el primer caso el suero es deshidratado
directamente, mientras que en los otros dos, el suero es previamente enriquecido en proteína,
eliminando sales y lactosa mediante tecnología de membrana.

El gran avance de esta rama de la ingeniería se produjo a comienzos de la década del setenta
cuando se desarrolló la tecnología de ultrafiltración. La ultrafiltración se caracteriza por poseer un
espectro de corte que va de 3.000 a 100.000 Da. El corte más común para sistemas de lechería es
10.000 Da. Éste es el tamaño de poro tradicional para separar las proteínas del suero de la lactosa,
para producir WPC desde 35 a 85 % de pureza. Durante el proceso de ultrafiltración las proteínas
del suero no se desnaturalizan, por lo que sus propiedades funcionales permanecen intactas. El paso
más reciente en esta notable evolución fue la nanofiltración, que comenzó a aplicarse en el mercado
industrial en la década del noventa y que desde entonces ha tenido un gran auge.

Los productos derivados del suero de queso son considerados como productos GRAS
(sustancias generalmente reconocidas como seguras, por sus siglas del inglés “generally recognized
as safe”) por el Departamento de Administración de Alimentos de Estados Unidos (USFDA), y
presentan un amplio rango de aplicaciones debido a su variada funcionalidad (Havea, Watkinson &
Kuhn-Sherlock, 2009; Kresic, Lelas, Jambrak, Herceg & Brncic, 2008).

Gelatina
La gelatina es una proteína animal producida a partir del colágeno (Boran, Mulvaney &
Regenstein, 2010). El colágeno es el más común de los componentes orgánicos de los tejidos
conectivos (tejidos relacionados fundamentalmente con aspectos estructurales y mecánicos del
organismo animal), es el material estructural dominante en el reino animal. La molécula de colágeno
(tropocolágeno) es una macromolécula muy alargada, en forma de varilla, constituida por tres
cadenas polipeptídicas, de unas 1.000 unidades aminoacídicas cada una, enrolladas entre sí
constituyendo una triple hélice estabilizada fundamentalmente por interacciones o enlaces por

12
puente de hidrógeno. Es conocido desde hace tiempo que cuando los tejidos colaginosos se
calientan a temperaturas moderadas en agua o en disoluciones acuosas de ácidos o bases se
disuelven parcialmente, dándose, a la porción de proteína solubilizada, el nombre genérico de
gelatina. Puesto que ese calentamiento suave solamente puede provocar la ruptura de los enlaces de
hidrógeno que estabilizan la triple hélice del colágeno, el proceso de transformación de colágeno en
gelatina puede ser considerado como un proceso típico de desnaturalización que, en este caso,
supone tan sólo el desmoronamiento de la estructura de triple hélice del colágeno nativo, sin afectar
para nada a la estructura primaria de la proteína. La estructura de la gelatina resulta ser, por lo tanto,
altamente simplificada con relación a la del colágeno, estando constituida por las cadenas
originarias de la molécula de aquél, pero en un claro ordenamiento al azar.

En el proceso convencional de producción de gelatina comestible tipo A y B, la extracción del

colágeno a partir de materiales en crudo como pieles de cerdo, cuero de vaca, huesos, entre otros, se
hace con ácidos o con álcalis respectivamente, y los extractos acuosos ricos en colágeno son
clarificados, desmineralizados y posteriormente concentrados en evaporadores al vacío de efecto
múltiple. La solución concentrada se esteriliza, enfría y extrude para formar fideos de gelatina. Estos
pasan a través de un túnel de secado donde se secan con aire purificado. El producto resultante
(gelatina) es una proteína fibrosa que tiene numerosas aplicaciones principalmente en la industria
farmacéutica y alimenticia debido a sus propiedades químicas y físicas; tiene la habilidad de formar
geles térmicamente reversibles (Saxena, Tripathi, Kumar & Shahi, 2009), puede ser usada como
agente emulsificante, estabilizante, o para mejorar algunas características como textura y capacidad
de retención de agua (Simón, Vandanjon, Levesque & Bourseau, 2002). La propiedad más conocida
de la gelatina es su capacidad para formar un gel. Se mide la fuerza de gel de acuerdo con normas y
metodología internacionales y se expresa como Bloom o fuerza de gel. Las gelatinas se clasifican
por su tipo (A o B) y la fuerza de gel. Su viscosidad en solución se ve afectada por la concentración
pH y la temperatura.

Té Verde
El té (Camellia sinensis) es una bebida común de consumo mundial. Es ampliamente
conocido por sus beneficios para la salud incluyendo los efectos antimicrobianos y antioxidantes, la
prevención del desarrollo de las enfermedades cardiovasculares y del cáncer, como también la
mejora de las funciones cognitivas y del funcionamiento metabólico general (da Silva Pinto, 2013;
Khan & Mukhtar, 2007; Lorenzo & Munekata, 2016; Sur & Panda, 2017).
Existen tres tipos de té basados en el método de procesamiento de las hojas: 1) el té verde y

13
blanco sin fermentar, 2) el té oolong parcialmente fermentado y 3) té negro fermentado (da Silva
Pinto, 2013). En la fabricación del té verde, las hojas de té son inmediatamente sometidas a cocción
previo a la laminación y secado, para inactivar la enzima polifenol oxidasa endógena (PPO) así
como la microflora nativa en las hojas (Ahmed & Stepp, 2013). Esto evita que los polifenoles,
principalmente las catequinas, se oxiden y colabora en la retención de una gran cantidad de
polifenoles monoméricos en las hojas del té verde.

Las diferencias en los constituyentes de la hoja de té se deben a varios factores como:

variedad de la planta, época de zafra, edad de la hoja, clima, estado del suelo, prácticas de cultivo,
contaminación del ambiente, condiciones de secado, procesos tecnológicos durante la producción
del té y tipo de solvente utilizado en la extracción (Ahmed et al., 2013; Wachira, Karori, Kerio &
Wanyoko, 2013).

Entre todos los tipos de té, el té verde es considerado como la fuente más rica de polifenoles
sin modificar (da Silva Pinto, 2013). Un consumo equivalente de 6 a 10 tazas diarias de té verde ha
sido sugerido por los científicos para proporcionar beneficios para la salud; sin embargo, esta gran
cantidad de té no es un consumo realista. Por ello, ha crecido el interés para usar polifenoles del té
verde como aditivos en productos alimenticios que se consumen con regularidad como parte de una
dieta diaria (Marquardt & Watson, 2014, Lorenzo et al., 2016).

Polifenoles
Los polifenoles son un amplio grupo de metabolitos secundarios que abundan en las plantas.
Cumplen importantes funciones como agentes de defensa contra el estrés bióticos (patógenos y
herbívoros) y abióticos (radiaciones ultravioletas y sequía).

El té presenta una de las concentraciones más altas en polifenoles, hasta un 30 % de su peso

seco (Zhang, Suen, Yang & Quek, 2018a). A modo comparativo, el contenido de polifenoles en el té
verde se encuentra en un rango de 800 a 2400 mg/L (Atoui, Mansouri, Boskou & Kefalas, 2005;
Rusak, Komes, Likić, Horžić & Kovać, 2008) mientras el vino tinto posee entre 1000 y 4000 mg/L
(Dreosti, 2000; Simonetti, Pietta & Testolin, 1997).

Los polifenoles del té verde son principalmente flavonoides, los cuales son compuestos de
bajo peso molecular que comparten un esqueleto común de difenil piranos (C6-C3-C6), compuesto
de dos anillos bencénicos (A y B) unidos mediante una cadena piranosa heterocíclica con oxígeno

14
(C) (Figura 1-4). Los átomos de carbono en los anillos C y A se numeran del 3 al 8, y en el anillo B
desde el 2´ al 6´. El número y la posición de los grupos hidroxilo y la subsiguiente adición de anillos
aromáticos determinarán muchas de sus propiedades. En función de sus características estructurales
se pueden dividir en seis clases: flavonas, flavanonas, isoflavonas, flavonoles, flavanoles y
antocianinas. Las clases principales de flavonoides encontradas en la planta de té son flavanoles y
flavonoles.

Figura 1-4. Estructura básica de los flavonoides.

Flavanoles: Dentro de éstos se agrupan las catequinas, compuestos hidrosolubles sin color,
que imparten amargor y astringencia a las infusiones de té verde (Zhang et al., 2018a). Las
catequinas más abundantes en las hojas frescas de té y en el té verde son (-)-epigalocatequina galato
(EGCG), (-)-epigalocatequina (EGC), (-)-epicatequina galato (ECG) y (-)-epicatequina (EC)
(Figura 1-5).

Casi todas las características del té manufacturado, incluyendo su sabor, color y aroma están
asociadas directa o indirectamente con modificaciones de las catequinas. De hecho, cuando las
catequinas se oxidan se forman polímeros conocidos como teaflavinas y tearrubiginas (Figuras 1-6
y 1-7). Existen cuatro teaflavinas principales en el té negro: teaflavina, teaflavina 3-galato,
teaflavina 3´-galato y teaflavina 3,3´-galato (Figura 1-6). Por su parte, las tearrubiginas son un
grupo heterogéneo de pigmentos fenólicos con masas moleculares que van de los 700 a los 40.000
Da (Figura 1-7). El té negro posee las concentraciones más altas de estos compuestos ya que las
catequinas se oxidan totalmente durante el proceso de fermentación. El contenido de teaflavinas en
el té negro es de 0,3-2 % en peso seco, mientras que la fracción de tearrubiginas comprende un 10-
20 % del peso seco (Zhang et al., 2018a).

15
Figura 1-5. Estructuras químicas de las catequinas mayoritarias del té verde.

16
 R1 R2
Teaflavina H H
Teaflavina 3-galato galato H
Teaflavina 3´-galato H galato
Teaflavina 3,3´-galato galato galato

Figura 1-6. Estructura de las teaflavinas presentes en el té negro.

Figura 1-7. Estructura de las tearrubiginas presentes en el té negro.

Flavonoles: Los flavonoles encontrados en el té son quercitina, kaempferol y miricitina

(Figura 1-8), y constituyen hasta un 2-3 % del extracto hidrosoluble del té (Zhang et al., 2018a).
Los flavonoles están presentes predominantemente en su forma glicosilada ya que se encuentran
unidos a un monosacárido preferentemente en la posición C3 y con menor frecuencia al carbono 7
del anillo A. El residuo azúcar más frecuente es la D-glucosa pero también están presentes L-
ramnosa, D-galactosa, L-arabinosa, fructosa, D-xilosa y ácido D-glucorónico (Wang, Provan &
Helliwell, 2000). Se han identificado mono-, di- y tri-glicósidos, los cuales son más solubles en
agua y menos reactivos frente a radicales libres que los correspondientes flavonoles sin glicosilar,
denominados agliconas.

17
 Figura 1-8. Estructura química de miricitina (A), quercitina (B) y kaempferol (C) con 3, 2 y 1 sustituyentes
hidroxilo en el anillo B, respectivamente.

Propiedades benéficas para la salud de los polifenoles

Los radicales libres son considerados como la mayor causa de enfermedades crónicas y
degenerativas como hipertensión, ateroesclerosis, Alzheimer, Parkinson, diabetes y muchos otros
desórdenes relacionados, como enfermedades cardiovasculares, cáncer y alergias (Valko, Leibfritz,
Moncol, Cronin, Mazur & Telser, 2007). Esto se debe a que los radicales libres pueden disparar
reacciones en cadena que causan daño oxidativo a biomoléculas como el ADN y a estructuras
biológicas sensibles como las membranas celulares.

Los antioxidantes son sustancias que disminuyen significativamente los efectos adversos de
las especies reactivas de oxígeno o nitrógeno en funciones fisiológicas normales. Existen fuertes
indicaciones a partir de estudios epidemiológicos y clínicos de que el consumo diario de frutas y
vegetales ricos en polifenoles está relacionado con una menor incidencia de las enfermedades
(Seifried, Harrison, Seifried, Boushey, Ferruzzi & Delahanty, 2017). Así, los polifenoles son
considerados cada vez más como esenciales para la salud humana debido a que suprimen los efectos
nocivos de los radicales libres sobre la fisiología normal (Khan et al., 2007).

Recientemente, el té ha atraído más atención debido a que representa una rica fuente de
antioxidantes naturales, los cuales pueden reducir la oxidación de lípidos y la acumulación de
colesterol disminuyendo la incidencia de ateroesclerosis y enfermedades cardiovasculares
(Quiñones, Miguel & Aleixandrea, 2013). Los polifenoles presentes en el té poseen una fuerte

18
actividad antioxidante y secuestradora de radicales libres, resultando más efectivos que las
vitaminas C y E para proteger células del daño de radicales libres (Henning et al., 2004).

Paralelamente, se ha informado que también posee propiedades benéficas para la salud como
agente anti-mutagénico y anti-carcinogénico ya que estudios con animales indicaron que el consumo
de té verde, por sus polifenoles, podría tener efectos significativos en la reducción del número de
tumores y en su crecimiento (Sur et al., 2017). Los efectos anticancerígenos se observaron en
diversos tejidos y órganos incluyendo boca, estómago, duodeno, colon, hígado, pulmón, mama y
piel, entre otros.

Propiedades antioxidantes de los polifenoles

Con más de 5000 especies conocidas, los flavonoides se encuentran entre los más potentes
antioxidantes naturales de plantas, y muchos de ellos son agentes reductores más fuertes en base
molar que el ácido ascórbico (Carocho, Morales & Ferreira, 2018). Las polifenoles del té pueden
actuar como antioxidantes mediante la donación de un átomo de hidrógeno, como aceptores de
radicales libres, como interruptores de reacciones de oxidación en cadena o mediante la quelación
de metales.

Numerosos estudios in vitro han demostrado que los polifenoles del té son neutralizadores
efectivos de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, incluyendo los radicales superóxido, oxígeno
singulete, peroxinitrito y ácido hipocloroso (Carocho et al., 2018). Diferentes estructuras de las
catequinas parecen estar involucradas en su acción antioxidante, incluyendo los grupos catecol
(orto-3’-4’-dihidroxilo) o galato (3’-4’-5’-trihidroxilo) en el anillo B, un grupo galato esterificado
en la posición 3 del anillo C, y los grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A (Figura 1-
9). Estas características estructurales producen una falta de localización de los electrones entre los
anillos A y B, posibilitando la estabilización de radicales formados como consecuencia de la
donación de un protón (Rice-Evans, Miller & Paganga, 1996) (Figura 1-10). Esta deslocalización
de los electrones es generalmente considerada un factor que aumenta la actividad antioxidante de los
flavonoides. Por lo tanto, la capacidad antioxidante de las catequinas se debe a su alto número de
grupos OH en sus estructuras. También se ha propuesto un mecanismo de donación de electrones
luego de la desprotonación del polifenol, dado que la capacidad de neutralizar radicales libres
aumenta con el aumento del pH cuando predominan las formas aniónicas de las catequinas (Muzolf,
Szymusiak, Gliszczynska-Swiglo, Rietjens & Tyrakowska, 2008).

19
 Grupo catecol

Grupos
Grupo galato
hidroxilo

Figura 1-9. Grupos funcionales importantes para la actividad antioxidante de los polifenoles del té verde.
Ejemplo: ECG.

Figura 1-10. Actividad neutralizante de radicales libres mediante donación de protones y posterior
estabilización de la molécula de flavonoide (Fl).

Por otro lado, la habilidad de los polifenoles para quelar iones metálicos como el hierro o el
cobre también podría contribuir a su actividad antioxidante porque prevendría que los mismos
catalicen la formación de radicales libres mediante reacciones redox (Rice-Evans, Miller &
Paganga, 1997) (Figura 1-11).

20
 Figura 1-11. Sitios de unión para los iones metálicos (Men+) en la molécula de polifenol.

También pueden actuar como antioxidantes indirectos a través de la regeneración de -

tocoferol, estimulación de enzimas antioxidantes e inhibición de factores de transcripción (Pietta,
2000).

La actividad antioxidante de diferentes polifenoles depende también del tipo de sistema al que
es incorporado (sistemas acuosos, aceites o emulsiones). Por ejemplo, la localización y
concentración de los polifenoles en distintas regiones de un sistema polifásico dependerá de su
polaridad, solubilidad y afinidad hacia los constituyentes estructurales (micelas, liposomas, etc.)
(Gramza & Korczak, 2005).

En relación a la explotación de la actividad antioxidante de las catequinas del té en matrices

alimentarias, los polifenoles se han evaluado en sistemas como carnes, pescados y aceites vegetales
(Massounga Bora, Ma, Li & Liu, 2018). Estos alimentos son muy susceptibles a la oxidación de
lípidos debido a su alto contenido de grasa. La capacidad antioxidante de las catequinas del té es
mucho mayor que la de otros antioxidantes sintéticos y naturales utilizados en la industria de
alimentos como BHA, BHT, -tocoferol, vitamina E y otros extractos vegetales (Carocho et al.,
2018).

Sin embargo, el mayor desafío a la hora de incluir polifenoles en la formulación de un

alimento es la de reducir al máximo las modificaciones sensoriales que pueda provocar el mismo.

Impacto sensorial de los polifenoles

El consumo de alimentos ricos en polifenoles está asociado con el sabor amargo pero más
precisamente con la sensación oral de astringencia (Bate-Smith, 1973). La astringencia es una

21
sensación de sequedad o constricción en la boca que se desarrolla y se disipa lentamente. Las bases
moleculares de este fenómeno son las interacciones entre los polifenoles y las glicoproteínas y
mucopolisacáridos que conforman la saliva, resultando en agregados insolubles que precipitan y
obstruyen la lubricación del paladar, dando la particular sensación áspera de astringencia (Haslam &
Lilley, 1988, Ferruzzi et al., 2012).

La percepción del sabor amargo también tiene una base genética en la población humana. En
1931 se descubrió que existía una marcada variación entre los humanos en lo que respecta a la
percepción del gusto amargo. Este hallazgo se realizó con un compuesto orgánico artificial llamado
feniltiocarbamida (PTC), el cual puede sentirse con gusto muy amargo, o virtualmente sin sabor,
dependiendo del genoma del degustador. Aparte de notar o no el gusto de PTC, existen dentro de
ambas categorías una cierta variación individual que hace que algunos individuos tengan una
elevada capacidad de detectar el sabor amargo, incluso a niveles muy bajos (Lesschaeve & Noble,
2005).

Tanto la astringencia como el sabor amargo son generalmente percibidos como atributos
negativos en bebidas y productos de soja, lácteos y jugos. Debido a esto las industrias de alimentos
continuamente están quitando los polifenoles y otros compuestos presentes en los productos
derivados de plantas. Sin embargo, estos fitoquímicos o fitonutrientes bioactivos siguen siendo
prometedores para la creación de alimentos de diseño orientados a la prevención de enfermedades
crónicas (Massounga Bora et al., 2018). Estas demandas competitivas de sabor y salud plantean un
dilema para la industria alimentaria.

Una de las soluciones a este problema es intentar enmascarar la astringencia de estos

compuestos. Se han reportado resultados satisfactorios mediante el uso de polisacáridos de grado
alimentario (gomas guar, xántica y arábiga y carboximetilcelulosa) debido a que al aumentar la
viscosidad pueden modificar la percepción de astringencia y la liberación de compuestos volátiles y
no volátiles (Troszynska et al., 2010).

Propiedades antimicrobianas de los polifenoles

Los polifenoles alimentarios son capaces de modificar selectivamente el crecimiento de

microorganismos susceptibles. La mayoría de los polifenoles presentan actividad antimicrobiana, en
particular sobre patógenos intestinales. La tolerancia de las bacterias a los mismos depende de la
especie bacteriana en cuestión y de la estructura del polifenol (Campos, Couto & Hogg, 2003;

22
Taguri, Tanaka & Kouno, 2004). Los polifenoles pueden inhibir el crecimiento de clostridios y de
Helicobacter pylori pero no de otras bacterias lácticas intestinales (Gramza et al., 2005). También se
ha demostrado que los extractos de té inhiben a los microorganismos patógenos contaminantes de
alimentos, incluyendo a Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli y
Salmonella Typhimurium (von Staszewski, Pilosof & Jagus, 2011b). Otros microorganismos
inhibidos por el té verde son Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa y la
levadura Candida albicans (Almajano, Carbó, López Jiménez & Gordon, 2008). Con respecto a
Staphylococcus aureus se ha demostrado que las catequinas de té verde pueden disminuir la
resistencia de este patógeno a antibióticos como oxacilina (Stapleton et al., 2004). En general, se
observa una mayor resistencia de las bacterias Gram negativas comparadas con las Gram positivas y
el hecho de que los extractos de té verde inhiban a microorganismos contaminantes de alimentos
pero que no afecten a las bacterias intestinales supone una gran ventaja para el uso de este producto
como antimicrobiano natural.

Si bien la respuesta más común en las cepas bacterianas es la inhibición de crecimiento,

algunos estudios han demostrado que este comportamiento no se da en todos los casos. Se han
encontrado diferencias de crecimiento entre las especies de bacterias ácido lacticas (BAL) en
presencia de fenol. S. thermophilus, L. fermentum, L. acidophilus y L. vaginalis mostraron una
notable sensibilidad a todos los extractos fenólicos ensayados. Por otro lado, L. plantarum, L. casei
y las cepas de L. bulgaricus alcanzaron un crecimiento máximo (Tabasco et al., 2011). Otros
estudios han reportado que los polifenoles no interfieren en el desarrollo de los cultivos iniciadores
en productos lácteos fermentados (Jaziri, Ben Slama, Mhadhbi, Urdaci & Hamdi, 2009; Tabasco et
al., 2011).

Aunque algunos autores han llevado a cabo estudios sobre el mecanismo de acción
antibacteriano de los polifenoles del té (Caturla, Vera-Samper, Villalaín, Mateo & Micol, 2003;
Zhang & Rock, 2004), el mecanismo de acción exacto aún no está claro. Se ha sugerido que los
flavonoides (polifenoles) pueden inhibir la síntesis de ácidos nucleicos y afectar la actividad
enzimática, particularmente de aquellas enzimas asociadas a la producción de energía. La síntesis de
lípidos y proteínas también puede ser afectada, aunque en menor medida. También se producen
cambios en la expresión de proteínas y en la composición de los lípidos de la membrana (Cho,
Schiller, Kahng & Oh, 2007). Adicionalmente, los polifenoles pueden interferir con funciones de la
membrana plasmática (transporte de electrones, absorción de nutrientes, síntesis de ácidos nucleicos
y actividad enzimática) e interaccionar con proteínas de la membrana causando deformaciones en la
estructura y funcionalidad de la misma.

23
Interacción y asociación de polifenoles y proteínas
La investigación y la aplicación de polifenoles ha ganado un gran interés por parte de las
industrias farmacéutica, nutracéutica y de alimentos funcionales, debido a sus potenciales efectos
benéficos para la salud de la población. Sin embargo, la efectividad de los polifenoles depende de la
preservación de su estabilidad, bioactividad y biodisponibilidad. Los compuestos polifenólicos son
particularmente inestables y sujetos a degradación cuando se exponen a pH extremos, extracción
brusca o proceso térmicos y tienden a impartir sabor amargo o astringencia (Ferruzzi, Bordenave &
Hamaker, 2012).

A su vez, aún cuando ingresan al organismo es dudosa su bioaccesibilidad porque hay una
alta tendencia a la descomposición previa a su absorción intestinal. Los polifenoles monoméricos,
como las catequinas del té verde, son estables a pH ácido como el que se encuentra en el estómago
pero son parcialmente degradados en el medio alcalino del tracto intestinal antes de su absorción, y
esta degradación continúa luego de la absorción en la sangre y otros órganos. Esta rápida
degradación de las catequinas en los fluidos biológicos resulta desventajosa en términos de
biodisponibilidad y efectos farmacológicos.

Como se mencionó previamente el sabor amargo y la astringencia de la mayoría de los

compuestos fenólicos son los factores que más limitan su aplicación en alimentos, ya que son
percibidos como atributos negativos (Balentine, Wiseman & Bouwens, 1997; Ferruzzi et al., 2012)
y están relacionados con la formación de complejos entre los polifenoles y las proteínas salivares.

Pero además de problemas sensoriales, esta afinidad de los polifenoles con las proteínas
puede traer aparejado alteraciones en otras propiedades, como funcionales o tecnológicas que
imparten las proteínas en los alimentos. En relación a esto, se reportó que la incorporación de
polifenoles en productos lácteos puede presentar inconvenientes tecnológicos afectando sus
propiedades espumantes, la estabilidad al calor (Yildirim-Elikoglu, 2018) e incluso sus propiedades
gelificantes en productos como el yogur (Jaziri et al., 2009).

Por otro lado, los polifenoles se oxidan muy rápida y extensivamente cuando están en
solución, mientras que en presencia de distintos tipos de estructuras proteicas y/o lipídicas se
encuentran protegidos.

Por todo lo expuesto, a fin de que los polifenoles mantengan sus efectos para la salud y no

24
afecten negativamente las propiedades funcionales de un sistema alimenticio, en los últimos años, se
ha evaluado la posibilidad de vehiculizarlos en forma de complejos proteína-polifenol y así
enmascarar su amargor y astringencia.

Encapsulación de polifenoles en nano-micropartículas proteicas

Las nano y micropartículas construidas con materiales de grado alimentario tienen

aplicaciones tanto en alimentos como en productos farmacéuticos y para el cuidado de la salud.
Pueden ser usadas para encapsular, proteger o entregar controladamente componentes bioactivos o
funcionales, como minerales, péptidos, proteínas, enzimas, drogas, lípidos o fibra dietaria, entre
otros (Li, Jiang, Xu & Gu, 2015; Oehlke, Adamiuk, Behsnilian, Graf, Mayer-Miebach & Greiner,
2014). El término “nanopartícula” se refiere formalmente a una estructura tipo esfera con un
diámetro de entre 1 y 100 nm, el cual se ha ampliado a un rango de entre 1 y 1000 nm,
especialmente en el campo biomédico (Hu, Liu, Zhang & Zeng, 2017). En general, a las partículas
con un tamaño mayor a 200-500 nm se las denomina micropartículas.

Se ha reportado que los polifenoles de té verde pueden interactuar con numerosas proteínas
alimentarias como gelatina, gliadina, lisozima, papaína (Siebert, Troukhanova & Lynn, 1996), las
proteínas de la leche (Chanphai, Bourassa, Kanakis, Tarantilis, Polissiou & Tajmir-Riahi, 2018;
Yildirim-Elikoglu, 2018) , y con enzimas digestivas como -amilasa, pepsina, tripsina y lipasa (He
et al., 2006).

Muchos autores han propuesto modelos para explicar la formación de complejos proteína-
polifenol (Charlton et al., 2002; Jöbstl, O´Connell, Fairclough & Williamson, 2004; Lin, Chen,
Cheng & Chen, 2004; Poncet-Legrand, Edelmann, Putaux, Cartalade, Sarni-Manchado & Vernhet,
2006; Richard, Lefeuvre, Descendit, Quideau & Monti, 2006; Shafaei et al., 2017; Siebert et al.,
1996). La mayoría de estos modelos proponen que los complejos de proteína y polifenol se forman
por múltiples interacciones débiles (principalmente hidrofóbicas) entre las cadenas laterales de los
aminoácidos y los anillos aromáticos de los polifenoles, indicando que la asociación de polifenoles
con proteínas es principalmente un fenómeno de superficie. A veces estas interacciones pueden ser
complementadas por enlaces puente hidrógeno, los cuales pueden jugar un rol importante en la
estabilización de los complejos (Frazier, Papadopoulou & Green, 2006; Haslam, 1996; Shafaei et
al., 2017). La formación del complejo ocurre entonces debido al carácter hidrofóbico de ambas
moléculas y en segundo lugar, cuando se da la posibilidad de formación de enlaces puente
hidrógeno, éstos pueden estabilizar el complejo pero sin alterar las modificaciones fundamentales

25
obtenidas en el primer paso (Jöbstl et al., 2004; Richard et al., 2006). Otros autores también
proponen cambios en la conformación tridimensional de la proteína como procesos de
desnaturalización y renaturalización, los cuales estarían acompañados por el complejamiento con el
polifenol (Hatano, Hori, Hemingway & Yoshida, 2003). Debido a esto, la flexibilidad de la proteína
en cuestión y el balance hidrofílico/hidrofóbico del polifenol serían parámetros a tener en cuenta a la
hora de caracterizar la interacción de estas moléculas.

La capacidad de formación de complejos proteína-polifenol está entonces profundamente

influenciada por la naturaleza de la proteína (secuencia y disponibilidad estérica de aminoácidos,
tamaño y estructura molecular), la hidrofobicidad del polifenol (la cual aumenta con el número de
anillos aromáticos) (Poncet-Legrand et al., 2006) y la presencia de otros componentes como
polisacáridos que puedan afectar la interacción (de Freitas, Carvalho & Mateus, 2003). La presencia
de aminoácidos aromáticos y prolina está correlacionada positivamente con una alta capacidad de
unión a los polifenoles, si es que estos aminoácidos están accesibles. La presencia de hélices en la
conformación de las proteínas hace que sean menos flexibles y por lo tanto menos capaces de
formar complejos de inclusión con los polifenoles. Generalmente, se considera que aquellas
proteínas con estructuras al azar poseen una mayor capacidad de unión que las proteínas globulares
compactas, debido a que estas últimas mantienen sus aminoácidos hidrofóbicos inaccesibles en el
interior de su estructura terciaria. Sin embargo, la BSA y la β-lg poseen sitios específicos de unión
para compuestos fenólicos (Al-Hanish et al., 2016; Bose, 2016; Jia, Gao, Hao & Tang, 2017). Por
ejemplo, el monómero de β-lg posee un sitio aromático polar cerca del AB-loop en la superficie.
Este sitio posee una alta afinidad por resveratrol, ácido fólico, EGCG y otros flavonoides (Shafaei et
al., 2017; Zhang, Liu, Subirade, Zhou & Liang, 2014).

Con respecto al efecto del pH en dicha interacción, Frazier et al. (2006) mostraron que el pH
no afecta la interacción entre la proteína seroalbúmina bovina y (-)-epicatequina. Charlton et al.
(2002) sugirieron que las interacciones electrostáticas no son un factor principal en la formación de
complejos entre polifenoles y proteínas. Es decir que los polifenoles se adsorben preferentemente de
manera “no específica” a la superficie de las proteínas.

Hasni et al. (2011) estudiaron la interacción entre las cuatro epicatequinas mayoritarias del té
verde y las caseínas lácteas (α-caseína y β-caseína), confirmando que se producen interacciones
tanto hidrofóbicas como hidrofílicas. Los polifenoles de té verde también poseen una fuerte afinidad
por todas las proteínas del lactosuero (β-lg, α-la y caseinomacropéptido) en un rango amplio de
valores de pH, observándose que el tamaño de los complejos formados es máximo cercano al punto

26
isoeléctrico de cada proteína. Además, la insolubilidad de los mismos está mayormente determinada
por su carga superficial; no obstante conservan las propiedades antioxidantes y antimicrobianas (von
Staszewski, Jagus & Pilosof, 2011a; von Staszewski et al., 2011b) y la acción antiproliferativa en
líneas celulares tumorales (von Staszewski, Jara, Ruiz, Jagus, Carvalho & Pilosof, 2012).

Por todo lo mencionado hasta aquí, la funcionalidad específica de los compuestos fenólicos
en los productos lácteos se basa en su capacidad para interactúan con las proteínas de la leche
(Yildirim-Elikoglu, 2018; Yuksel, Avci & Erdem, 2010). Las proteínas del suero de la leche,
especialmente la β-lg ha recibido mucha atención como proteína carrier de polifenoles, ya sea en su
forma nativa o bien luego de tratamientos térmicos (Lestringant, Guri, Gulseren, Relkin & Corredig,
2014; Li, Du, Jin & Du, 2012; Shpigelman, Cohen & Livney, 2012). La unión de polifenoles a
proteínas del suero ha demostrado un gran incremento en la foto-estabilidad y solubilidad de los
polifenoles (Liang, Tajmir-Riahi & Subirade, 2008; Shpigelman, Israeli & Livney, 2010). Además,
a diferencia de otras proteínas, la β-lg nativa es resistente a la digestión enzimática debido a su
estructura globular con sitios de unión inaccesibles. Particularmente, se ha observado que los
nanocomplejos de polifenol-β-lg son resistentes a la acción de la pepsina pero sensibles a la tripsina
(Li, Cui, Ngadi & Ma, 2015). Así, la β-lg puede llegar casi intacta a la parte superior del intestino.
En las condiciones alcalinas del intestino, la β-lg pierde su estructura terciaria resultando en la
liberación del polifenol (Madalena et al., 2016). Se ha comprobado, tanto con β-lg como con BSA,
que los polifenoles retienen su actividad antioxidante y antiproliferativa de células tumorales aun
encontrándose unidos a estas proteínas (Guo et al., 2015; Lestringant et al., 2014; von Staszewski et
al., 2012).

Por otro lado, se han realizado varios estudios utilizando gelatina como vehículo de
polifenoles (Gómez-Mascaraque, Lagarón & López-Rubio, 2015), indicando que los mismos
retienen su actividad biológica a pesar de encontrarse unidos a esta proteína (Karthikeyan, Hoti &
Prasad, 2015; Shutava et al., 2009). Como se describió anteriormente, la gelatina es una proteína
desnaturalizada, obtenida del colágeno por hidrólisis ácida o alcalina. Es considerada GRAS por la
FDA y ha sido ampliamente utilizada en productos farmacéuticos, cosméticos y alimenticios
(Elzoghby, 2013). Es una molécula anfótera que posee grupos catiónicos, aniónicos e hidrofóbicos
en una relación de aproximadamente 1:1:1. La molécula de gelatina se encuentra aproximadamente
un 13 % cargada positivamente (lisina y arginina), un 12 % cargada negativamente (ácido aspártico
y ácido glutámico) y un 11 % de la cadena es hidrofóbico (leucina, isoleucina, metionina y valina).
Glicina, prolina e hidroxiprolina conforman el resto de la cadena. El alto contenido de prolina hace
que la interacción con polifenoles sea más favorable (Chen, Yu, Tsai, Tang, Mi & Peng, 2010).

27
Yogur
El Código Alimentario Argentino (CAA) en su artículo 576 define al yogur como el producto
obtenido por coagulación y disminución del pH de la leche o leche reconstituida, por fermentación
láctica mediante cultivos protosimbióticos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a los que en forma complementaria pueden acompañar
otras bacterias acidolácticas. Estos microorganismos deben ser viables, activos y abundantes en el
producto final durante su período de validez.

Según datos de la consultora Kantar Worldpanel, en Argentina, el consumo de yogur per

cápita por año, es de seis litros. El dato reflejado incluye lo que se consume en el hogar. Los
yogures se han impuesto en la mayoría de las compras familiares hasta el punto de que 9 de cada 10
hogares en un año compran al menos una vez esta variedad de lácteos.

El yogur posee un alto contenido de proteínas (Sahan, Yasar & Hayaloglu, 2008) y una mayor
biodisponibilidad de calcio que la leche, ya que el pH ácido ioniza el calcio facilitando su absorción
en el intestino y reduce el efecto inhibitorio del ácido fítico dietario sobre el calcio, por lo que
también es reconocido como alimento saludable (Adolfsson, Meydani & Russell, 2004; Singh &
Muthukumarappan, 2008).

Se ha observado in vitro e in vivo que los productos lácteos fermentados con BAL
(probióticos) tiene propiedades funcionales porque ayudan a incrementar la habilidad del cuerpo
para resistir la invasión de patógenos y mantener bien la salud del huésped. Las BAL probióticas
pueden obstaculizar la colonización y subsecuentemente la proliferación de los patógenos, debido a
que tienen un potencial para producir toxinas (sustancias antimicrobianas) en el tracto
gastrointestinal.

Los microorganismos probióticos aparecen en el tracto gastrointestinal del hombre desde eta-
pas tempranas de la vida, pero al pasar el tiempo, y debido a factores como la edad, la dieta, el
ambiente, el estrés y la medicación, descienden a cantidades que pueden llegar a ser muy pequeñas
lo cual puede favorecer el crecimiento de bacterias patógenas, por ello se recomienda el consumo de
productos que las contengan.

28
Etapas del proceso de elaboración del yogur

Leche
La leche es el ingrediente principal del yogur y, por ende, su composición y características
físico-químicas influirán en las características del gel formado luego del proceso fermentativo. Por
ello, la leche utilizada para elaborar yogur debe encontrarse estandarizada en su contenido graso y
proteico y debe ser de buena calidad original.

Enriquecimiento de sólidos lácteos no grasos

Los sólidos no grasos (SNG) comprenden todos los sólidos de la leche, a excepción de la
grasa, es decir, las proteínas, la lactosa y los minerales. Para lograr un yogur con la firmeza y
consistencia deseada por el consumidor debe aumentarse el % de SNG, ya que el nivel de SNG de la
leche (8,5 – 9,0 %) no es suficiente (Robinson, 2011). Se observó que algunos defectos típicos de los
productos lácteos fermentados son la baja viscosidad, la reducida firmeza o sinéresis y la consistencia
líquida (Domagała, Wszołek, Tamime & Kupiec-Teahan, 2013). Por ello, se intenta garantizar una
textura adecuada y evitar estos defectos aumentando el contenido total de sólidos de la leche
añadiendo otros ingredientes y estabilizadores (Matumoto-Pintro, Rabiey, Robitaille & Britten,
2011). Una de las maneras empleadas para aumentar los SNG es añadir leche en polvo a la leche
base. Para evitar los problemas asociados a la oxidación de lípidos, se prefiere la fortificación con
leche en polvo descremada (Tamime & Robinson, 2007). Tamime et al. (2007) observaron que la
consistencia mejoraba cuando el contenido de sólidos varió entre 12 y 20 g/100 g. Cuanto mayor es
el contenido de sólidos, mayor es la viscosidad del producto final y menor la sinéresis (Amatayakul,
Sherkat & Shah, 2006). Sin embargo, un contenido de sólidos mucho mayor no es conveniente ya
que disminuye la disponibilidad de agua, lo que dificulta el desarrollo de los microorganismos y
conlleva a una mala palatabilidad.

Tratamiento térmico
El sometimiento de la leche a temperaturas entre 80 y 90 ºC garantiza la destrucción de la
mayoría de las células vegetativas de patógenos e indeseables, así como también disminuye la
cantidad de microorganismos competidores para el cultivo starter. El starter se inocula en una etapa
posterior y es el responsable de llevar a cabo la fermentación. Además, el aumento de temperatura
disminuye la solubilidad del oxígeno, lo cual también resulta beneficioso para el crecimiento de las
bacterias lácticas.

29
 Sin embargo, uno de los aspectos más importantes de esta etapa es su efecto sobre las
proteínas de la leche. El tratamiento térmico a 85 °C durante 20 minutos (más drástico que una
pasteurización típica) desnaturaliza el 90 % de la β-lg y el 60 % de la α-la (Tamime et al., 2007). Es
un hecho bien conocido que las proteínas de suero desnaturalizadas, en la leche, interactúan entre sí
para formar agregados de proteínas de suero soluble y con micelas de caseína para formar micelas
de caseína recubiertas de proteína de suero de leche (Aguilera & Kessler, 1989; Considine, Patel,
Anema, Singh & Creamer, 2007; Donato & Guyomarc’H, 2009a). El despliegue parcial de la
estructura globular nativa de la β-lg implica la disociación de enlaces intramoleculares, en
particular, enlaces disulfuro covalentes y la agregación intermolecular inducida por la disminución
del pH durante el proceso de fermentación, produce la formación de complejos de β-lg/κ-caseína
mediante enlaces hidrófobos y disulfuro. Este proceso se representa en la Figura 1-12.

Figura 1-12. Interacción entre las proteínas de suero desnaturalizadas y las micelas de caseína. Adaptado de
Robinson, Lucey y Tamime (2007b).

Donato et al. (2009b) enumeran los efectos positivos del calentamiento en la elaboración del
yogur:
 Incremento en el pH del inicio de la gelificación de 4,9 a 5,4.
 Formación de un gel final con mayor viscosidad y firmeza.
 Microestructura más homogénea con un aumento del reticulado y menor porosidad,
y mayor capacidad de retención de agua.

30
 Por otra parte, el calentamiento no sólo afecta la textura sino que también se liberan
aminoácidos que contribuyen al flavour, por la desnaturalización parcial de las proteínas del suero
(Tamime et al., 2007).

Fermentación
Una vez concluido el proceso térmico, se disminuye la temperatura hasta valores que
permitan el desarrollo de las bacterias lácticas (BAL). En la producción de yogur, las BAL utilizadas
son L. bulgaricus y S. thermophilus. Ambas tienen un óptimo crecimiento entre los 40-45 ºC y por lo
tanto, la fermentación se lleva a cabo a dichas temperaturas. Las mismas son microaerófilas, ácido
tolerante y se caracterizan por la producción de ácido láctico a partir de azúcares (Fox, 2011b).

Los lactobacilos son bacterias Gram positivas, catalasa negativos, que producen ácido láctico
como principal producto de la fermentación. Las cepas del grupo de L. delbrueckii son capaces de
desarrollarse a temperaturas menores a 10 ºC, pero su óptimo crecimiento se da entre 40-45 ºC
(Rizzello & De Angelis, 2011). Este grupo es homofermentativo obligado, por lo que fermenta
hexosas casi totalmente a ácido láctico, pero no es capaz de metabolizar pentosas o gluconato (De
Angelis & Gobbetti, 2011; Rizzello et al., 2011). L. delbrueckii subespecie bulgaricus fermenta
glucosa, lactosa y fructosa, pero no galactosa. Al crecer en un medio lácteo, transporta lactosa hacia
el interior de la célula que es hidrolizada por la -galactosidasa. La galactosa es expulsada, siendo
únicamente la glucosa fermentada a lactato (Rizzello et al., 2011).

La otra bacteria utilizada como starter es Streptococcus thermophilus, que también es Gram
positiva y pertenece al grupo de las BAL. Fermenta un número limitado de azúcares entre los que se
encuentran la lactosa, fructosa, sacarosa y glucosa. Es una bacteria homofermentativa y tampoco es
capaz de fermentar galactosa, siendo el mecanismo de aprovechamiento de lactosa similar al de L.
bulgaricus. S. thermophilus se caracteriza por tener baja actividad proteolítica, por lo que requiere
aminoácidos libres para su crecimiento. Debido a esto, es una práctica usual utilizarlo en conjunto
con otro lactobacilo termofílico más proteolítico, para así obtener la máxima producción de ácido
(Harnett, Davey, Patrick, Caddick & Pearce, 2011).

Streptococcus aparece como cadenas de forma esférica, mientras que Lactobacillus como
bastones, largos o cortos pero cocoides o células pleomórficas (Tamime et al., 2007). El
estreptococo crece más rápidamente al comienzo de la fermentación, produciendo ácido fórmico y
reduciendo el oxígeno que estimula el crecimiento de Lactobacillus bulgaricus (Rizzello et al.,
2011; Robinson, 2002; Robinson et al., 2007b). El lactobacilo posee más enzimas proteolíticas

31
 (Harnett et al., 2011) y produce aminoácidos que promueven el crecimiento del Streptococcus. A
medida que el pH desciende, el crecimiento de S. thermophilus disminuye, ya que es menos ácido
tolerante y aumenta la cantidad de L. bulgaricus (Beal, Skokanova, Latrille, Martin & Corrieu,
1999; Robinson & Itsaranuwat, 2007a).

Durante la fermentación, L. bulgaricus y S. thermophilus realizan principalmente tres

transformaciones bioquímicas en los componentes de la leche: i) conversión de la lactosa a ácido
láctico (fermentación), ii) hidrólisis de las caseínas en péptidos y aminoácidos libres (proteólisis) y iii)
ruptura de la grasa láctea en ácidos grasos libres (lipólisis) (Smit, Smit & Engels, 2005). Estas
reacciones generan varios metabolitos, resultando en un descenso de pH, formación de una textura
semisólida y el flavour característico (Settachaimongkon et al., 2014). Uno de los componentes más
importantes en el flavor es el acetaldehído (Robinson, 2002), aunque el ácido láctico, butírico, la
acetona y compuestos volátiles también contribuyen (Rizzello et al., 2011).

Gelificación
La producción de ácido láctico por parte de las BAL induce la formación del gel, ya que
provoca cambios en las propiedades físico-químicas de las micelas de caseína. Existe una reducción
de la carga superficial de las caseínas, desde una carga neta negativa hasta valores cercanos a cero,
alrededor del pI (pH 4,6). Esto permite el acercamiento y agregación de las moléculas de caseínas
a través de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. Si previamente la leche fue sometida a un
efectivo tratamiento térmico, se formará un gel firme y con buena viscosidad (Lucey, 2004). En la
Figura 1-13 se muestra un esquema de este proceso.

Figura 1-13. Cambios físicos en la micela de caseína durante la acidificación de la leche. Adaptado de
Robinson et al. (2007b).

32
 Cuando la leche pasteurizada es acidificada, las WP desnaturalizadas presentes en el suero y
las asociadas a las micelas de caseína son susceptibles de agregarse, a medida que la repulsión entre
cargas se reduce por generación de ácido láctico. Cerca de su pI, aumentan las interacciones entre
proteínas a través de los grupos hidrofóbicos expuestos. Las proteínas desnaturalizadas unidas a las
micelas de caseína actúan como material de unión, interactuando con análogas asociadas a otras
micelas, lo que incrementa el número y la fuerza de las uniones entre partículas proteicas (Lucey &
Singh, 1997). Las WP desnaturalizadas y unidas a las caseínas provocan que éstas se agreguen a un
valor de pH mayor, debido al mayor pI de la -lg (pH 5,3) (principal proteína del suero), respecto
al de las caseínas. En el caso de leche no tratada térmicamente, la gelificación ocurriría a pH 5,0
(Lucey, 2009). Por otra parte, a pH menores a 6 comienza a solubilizarse el CCP, el que ayuda a
estabilizar las micelas de caseína, actuando como puente y neutralizando dos cargas negativas
provenientes de los residuos fosfoserinas de las caseínas (Horne, 1998).

Por debajo de pH 5 la firmeza del gel continúa aumentado y llega a su máximo en el pI de las
caseínas. Tanto antes, durante como después de la formación del gel, existen reorganizaciones en las
asociaciones caseínas / agregados caseína+-lg debido a cambios en la fuerza y el tipo de
interacciones entre caseínas en función del pH (Lucey, 2004).

Enfriamiento y conservación
Una vez que se alcanza el pH deseado (4,6), el yogur es enfriado para detener la actividad
metabólica de los microorganismos y sus enzimas. De lo contrario, el producto podría tornarse
demasiado ácido. Puesto que el crecimiento de las BAL se ve disminuido a temperaturas por debajo
de 10 ºC, el objetivo de esta etapa es llevar al producto desde la temperatura de fermentación hasta
los 10 ºC (e incluso preferiblemente a 5 ºC) lo antes posible (Tamime et al., 1999).

Esta etapa también contribuye a incrementar la firmeza del gel debido al encogimiento de las
partículas de caseína, por el fortalecimiento de las interacciones puente hidrógeno, y al incremento
del área de contacto entre partículas (Peng, Serra, Horne & Lucey, 2009; Robinson et al., 2007a).

Teniendo en cuenta por un lado los efectos benéficos de los polifenoles sobre la salud, pero
por el otro, el desafío que implica incluirlos en una matriz alimentaria por el impacto sensorial y
tecnológico que puede producir en ella, es que se propone la inclusión de polifenolesen un producto
saludable como el yogur, incluidos de dos maneras diferentes: directamente o encapsulados en
partículas proteínas.

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44
Objetivos
Objetivo general
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la factibilidad de fortificar yogur con
polifenoles de té verde a fin de incorporar sus propiedades antioxidantes a dicho alimento sin
modificar sustancialmente las características del producto.

Con el fin de evaluar el impacto que tiene dicha incorporación en algunos aspectos
organolépticos, funcionales y estructurales, los polifenoles fueron incorporados de dos
maneras: adición directa o vehiculizados a través de partículas proteicas de WPC y gelatina.

Objetivos particulares
Los objetivos específicos del presente trabajo se centran en evaluar, en primer lugar, la
influencia de la adición de polifenoles sobre la dinámica del proceso de fermentación y sobre
las características del yogur durante el almacenamiento, y además determinar si existen
diferencias asociadas a la forma de adición de los mismos (de manera directa, o incluidos en
partículas proteicas).

El efecto de la presencia de polifenoles se evaluó sobre las siguientes características

del yogur:

 Los parámetros cromáticos (espacio Cie L*a*b*).

 La capacidad de retención de agua.

 Las propiedades reológicas, texturales y microestructurales.

 La viabilidad de las bacterias lácticas empleadas como starters.

 La capacidad antioxidante y el contenido fenólico del yogur recién elaborado,

durante su vida útil, así como también luego de una digestión gastroduodenal in
vitro.

46
Materiales y Métodos
Materiales
La fuente de polifenol utilizada para la fortificación fue un extracto de té verde en polvo
(Sunphenon® 90MD), el cual fue obtenido de Taiyo International, Inc. (Minneapolis, Minnesota) y
contiene más de un 95 % de polifenoles totales, más de un 75 % de catequinas totales, más de un 45
% de Epigallocatequina gallato (EGCG) y menos de un 6,0 % de cafeína.

Para la elaboración de las partículas proteicas se utilizó, además:

 WPC (Arla Food Ingredients, Argentina). La composición de este concentrado fue:

72,2 % proteína, 2,7 % cenizas, 8,4 % humedad, grasas despreciables.

 Gelatina tipo A, PEUSA 250 H 40 (Rousselot Argentina S.A., Argentina). Las

características de la gelatina utilizada fueron las siguientes: BLOOM: 216 g Bloom,
viscosidad 6,67 %: 5,0 mPa.s.

Las soluciones se prepararon con agua potable y el pH fue ajustado por adición de soluciones
0,1 o 1 N de HCl o NaOH. Todo otro reactivo empleado en este trabajo fue de grado analítico.

Las materias primas utilizadas para elaborar los yogures firmes fueron:

 Leche fluida: entera, Sancor Coop. Unidas Ltda.

 Leche en polvo: descremada, Sancor Coop. Unidas Ltda.
 Cultivos starters: bacterias ácido lácticas (Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus), YoFlex Mild 1.0 CHR
HANSEN.
 Azúcar, Ledesma S.A.

Obtención de las nano-micropartículas proteicas

De acuerdo a lo expuesto en Encapsulación de polifenoles en nano-micropartículas
proteicas de la sección Introducción, se construyeron partículas WPC-polifenol-gelatina mediante la
técnica de auto-ensamblado. Inicialmente se mezcló WPC-polifenol siguiendo los lineamientos de
un trabajo previo (von Staszewski, 2011) donde se evaluaron diferentes concentraciones y
condiciones de pH para favorecer las interacciones WPC-polifenol, y posteriormente se mezcló el
complejo WPC-polifenol con la solución de gelatina siguiendo las condiciones descriptas por
Rodríguez et al. (Rodríguez, von Staszewski & Pilosof, 2015).

48
 En el presente trabajo, se realizaron estudios preliminares para seleccionar las
concentraciones óptimas del complejo WPC-polifenol y de gelatina, así como también las
condiciones de pH y tiempo necesario para favorecer la interacción entre los compuestos, teniendo
en cuenta las características del alimento en el que se iban a incluir.

Para formar los complejos WPC-polifenol se prepararon soluciones mixtas de WPC (6 % p/p)
y de polifenol en concentraciones variables (entre 0,5 y 2 % p/p) en agua a temperatura ambiente. A
cada una de ellas se le midió el pH y se lo ajustó a un valor de 6. Las soluciones resultantes se
conservaron 24 horas a 4 ºC para lograr la completa hidratación de las moléculas de proteína y
formación del complejo WPC-polifenol (von Staszewski, 2011).

Por otro lado, la solución de gelatina se preparó al 0,5 % p/p, siendo el doble de la
concentración final deseada (0,25 % p/p). Se disolvió la cantidad necesaria del polvo de gelatina en
agua a temperatura ambiente, luego se calentó hasta 70 °C con agitación suave, por un minuto, para
lograr su completa disolución y se dejó enfriar. El pH de la gelatina 0,5 % p/p fue 5,5.

Las partículas proteicas se obtuvieron mezclando volúmenes iguales de las soluciones de

WPC-polifenol y gelatina. Se ajustó el pH a 6 (condición elegida a partir de los resultados de
potencial zeta que se verán más adelante) y se almacenaron por 24 horas en refrigeración. De esta
manera se obtuvieron tres soluciones:
 0,25 % polifenol – 3 % WPC – 0,25 % gelatina
 0,5 % polifenol – 3 % WPC – 0,25 % gelatina
 1 % polifenol – 3 % WPC – 0,25 % gelatina

En la Figura 2-1 se presenta una síntesis esquemática del procedimiento seguido para la
obtención de las partículas proteicas con antioxidante.

49
 Figura 2-1. Esquema del procedimiento seguido para la obtención de las partículas proteicas con polifenol.

Carga superficial de las partículas proteicas en solución

Se determinó la carga neta superficial de WPC y de gelatina en solución mediante la
medición del potencial zeta (ζ) en un equipo Zetasizer Nano-Zs (Malvern Instruments,
Worcestershire, Inglaterra) como el que se muestra en la Figura 2-2, con el objetivo de determinar
las condiciones óptimas para favorecer su interacción.

Figura 2-2. Fotografía del equipo Zetasizer Nano-Zs.

Las muestras se diluyeron en el buffer apropiado antes de cargarse en las celdas

50
correspondientes para la medición de movilidad electroforética (Figura 2-3) y la temperatura se
ajustó a 25 ºC. El potencial zeta (ζ) se determinó midiendo la dirección y velocidad de las partículas
al aplicar un campo eléctrico.

Figura 2-3. Celda para la medición del potencial zeta. En los electrodos ubicados a cada lado de la celda, el
equipo aplica el campo eléctrico (Malvern-Instruments, 2014).

El efecto que se analiza para la determinación del potencial zeta es la electroforesis, la cual se
define como el movimiento de una partícula cargada, en el líquido en el cual está suspendida, bajo
la influencia de un campo eléctrico.

En la técnica de velocimetría por láser Doppler (LDV), la cual mide en un rango desde 5 nm a
10 µm, se aplica un voltaje a través de un par de electrodos ubicados a ambos extremos de una celda
que contiene la dispersión de partículas (Figura 2-3). Las partículas cargadas son atraídas al
electrodo de carga opuesta. Las fuerzas viscosas que actúan sobre las partículas tienden a oponerse a
este movimiento. Cuando se alcanza el equilibrio entre estas dos fuerzas opuestas, la partícula se
mueve con una velocidad constante. Esta velocidad se mide y expresa por unidad de campo de
fuerza como la movilidad electroforética µe. Luego, se calcula el potencial zeta (ζ) mediante el
software provisto por Malvern de acuerdo a la ecuación de Henry:

3
  e (Ecuación 2-1)
2  F (a)

donde ζ es el potencial zeta de la muestra, µe es la movilidad electroforética, η es la constante

dieléctrica del agua, F(κa) es la función del parámetro adimensional κa, el cual es igual a 1,5 de
acuerdo a la aproximación de Smoluchowski que es usualmente utilizada cuando el radio de la
partícula es mucho más grande que la longitud en Debye de la doble capa eléctrica.

51
 Las mediciones de potencial zeta se informan como el promedio ± la desviación estándar
(SD) de al menos tres mediciones.

Caracterización del tamaño de las partículas proteicas

Los diámetros promedio y las curvas de distribución de tamaño de las partículas proteicas se
determinaron por dispersión estática de luz (SLS) en un equipo Mastersizer 2000 provisto con una
unidad de dispersión Hydro 2000MU y con un láser He - Ne (633 nm) (Malvern Instruments,
Worcestershire, Inglaterra) (Figura 2-4).

Figura 2-4. Fotografía del equipo Mastersizer 2000 con su unidad de dispersión Hydro 2000MU.

El rango de medición del equipo se encuentra entre 0,1 μm y 1 mm. La velocidad de la

hélice en la unidad dispersora se mantuvo en 1000 rpm. Se utilizó el índice de refracción de la fase
dispersa (1,47) y su parámetro de absorción (0,001).

Para determinar el tamaño de las partículas, éstas deben irradiarse con un haz de luz láser. La
dispersión de la luz del láser provoca que, detrás de la muestra, se forme una distribución de
intensidad anular característica que es medida por un detector con una forma especial. El tamaño de
las partículas se determina a partir de la distancia de estos anillos (o del ángulo de dispersión
correspondiente): las partículas grandes generan anillos muy cercanos (ángulo de dispersión
pequeño), mientras que las partículas pequeñas dan lugar a anillos muy separados (ángulo de
dispersión grande). El tamaño de las partículas se determina por la dependencia de los ángulos de la
intensidad de dispersión.

El tamaño de partícula se informa como el diámetro promedio de volumen-superficie o

diámetro de Sauter (D32) (Ecuación 2-2) y el diámetro promedio de volumen equivalente o diámetro
De Broucker (D43) (Ecuación 2-3). D32 representa el diámetro que tendría una esfera con la misma

52
relación volumen/superficie que toda la población de partículas en la muestra, y brinda una medida
del diámetro promedio en donde se encuentran la mayoría de las partículas. D43 es el diámetro
medio ponderado, asumiendo partículas esféricas del mismo volumen que las partículas reales, y
está relacionado con cambios en el tamaño de partícula que involucran procesos de
desestabilización.

 ni  d i3 (Ecuación 2-2)
D32 
 ni  d i2

 ni  d i4 (Ecuación 2-3)
D43 
 ni  d i3

donde ni es el número de gotas de diámetro di (Jafari, Beheshti & Assadpour, 2013; Leroux,
Langendorff, Schick, Vaishnav & Mazoyer, 2003).

Estas mediciones se deben hacer a un mismo pH, ya que modificar este valor alteraría los
resultados, por ello se trabajó con agua a pH = 6 en la unidad dispersora.

Los valores que se informan en la sección Resultados y Discusiones corresponden al

promedio ± la desviación estándar (SD) de triplicados.

Formulación de los yogures

Se elaboraron seis formulaciones de yogur firme. Tres de ellas con partículas proteicas WPC-
polifenol-gelatina con distintas concentraciones de polifenoles (0,025; 0,05 y 0,1 % p/p), una sin
partículas con polifenol (0,1 % p/p), un control sin agregados de partículas ni polifenol y un control
con partículas proteicas WPC-gelatina sin polifenol.

Los yogures se rotularon de la siguiente manera:

 0 % sp: sin partículas - sin polifenol
 0 %: con partículas – sin polifenol
 0,025 %: con partículas – con 0,025 % de polifenol
 0,05 %: con partículas – con 0,05 % de polifenol
 0,1 %: con partículas – con 0,1 % de polifenol
 0,1 % sp: sin partículas – con 0,1 % de polifenol

Si bien no hay una ingesta diaria recomendada (IDR) definida por la Food and Nutrition
Board del National Research Council (U.S.A.), a través de numerosos estudios se comprobó que

53
superada la ingesta de 500 mg diarios, hay efectos visibles en la salud (Marquardt & Watson, 2014).
De esta manera, una porción de yogur de 200 g representa un 10 %, 20 % y 40 % de la dosis para
los yogures con 0,025, 0,05 y 0,1 % p/p de polifenoles, respectivamente. Si bien el porcentaje
alcanzado es bajo, mediante pruebas preliminares se decidió no utilizar concentraciones mayores ya
que generaba cambios organolépticos inaceptables.

El porcentaje de sólidos totales (ST) de la leche se encuentra entre un 8 y 9 %, el cual se

compone de sólidos grasos (SG) y sólidos no grasos (SNG). Como se mencionó en la Introducción,
para la elaboración de yogures se recomienda incrementar el contenido de ST hasta un 15-16 %
(Tamime & Robinson, 2007), lo que se realiza habitualmente adicionando leche en polvo
descremada. A su vez en los casos en los que se adicionó las partículas proteicas con antioxidante,
parte del volumen de la leche se reemplazó por volumen de la solución de las partículas, con el
objetivo de mantener el contenido de ST constante en todas las formulaciones. A continuación, en la
Tabla 2-1 se muestra la composición final para cada yogur.

Tabla 2-1. Composición porcentual de las formulaciones elaboradas.

Formulación
g/100 mL de
0 % sp 0% 0,025 % 0,05 % 0,1 % 0,1 % sp
formulación
% SNG 7,8 7,02 7,02 7,02 7,02 7,8
% SG 3 2,7 2,7 2,7 2,7 3
Adición de sólidos
% partículas 0 0,325 0,325 0,325 0,325 0
% SNG 4,2 4,955 4,955 4,955 4,955 4,2
% ST 15 15 15 15 15 15

En todos los casos se utilizó leche fluida entera Sancor con un contenido de 3 % SG y de 7,8
% SNG en 100 ml de leche y leche en polvo descremada Sancor. El % se SNG aportados por la
leche en polvo se calculó según la información provista en el envase, donde se informa un contenido
de SNG de 8,7 % en la leche reconstituida.

A su vez, a todas las formulaciones se les adicionó 10 % (p/p) de azúcar, 10 % (p/p) del
fermento activado.

Proceso de elaboración de yogur

La elaboración de los yogures se realizó siguiendo los pasos delineados por Barja (2013) con
leves modificaciones.

54
 Se utilizó un concentrado comercial (starter) compuesto por una mezcla de Lactobacillus
bulgaricus y Streptococcus thermophilus. El día previo a la elaboración se procedió a activar el
fermento en leche incubando a 32 ºC durante la noche (aproximadamente 14 horas). La incubación
finalizó cuando el pH de dicha solución de starter alcanzó un valor entre 4,2 a 4,4.

Los polifenoles se pueden agregar al yogur en dos momentos distintos de su elaboración:

pre-fermentación (agregando las partículas antes de la fermentación como un ingrediente más de la
mezcla del yogur); o post-fermentación (agregando las partículas de polifenol después de la
fermentación, como parte de la práctica habitual para impartir sabor y agentes de color) (Sun-
Waterhouse, Zhou & Wadhwa, 2013). Estos autores exploraron estas dos formas de elaboración al
agregar polifenoles de frutos rojos a los yogures, y encontraron que agregarlos previo a la
fermentación introdujo algunos cambios favorables como promover el crecimiento de los cultivos
starter. En el presente trabajo se decidió incorporar los polifenoles (solos o en forma de complejos
con proteínas) antes de la fermentación ya que se trata de un yogur set o firme, por lo que luego de
la fermentación el yogur ya se encuentra gelificado y no existe una etapa posterior de batido o
ruptura de la estructura (como si ocurre, por ejemplo, en yogures batidos o bebibles) en la que se
puedan incorporar los polifenoles.

Procedimiento de elaboración del yogur:

I. Se utilizó un vaso de precipitado de 1000 mL sobre un agitador magnético con fuente de calor. La
temperatura se monitoreó constantemente con un termómetro colocado dentro del vaso. Se
calentó la leche fluida hasta 50-55 °C y se agregaron las partículas antioxidantes en forma de
suspensión líquida y los ingredientes sólidos (leche en polvo, azúcar). En el caso de la
formulación 6 se diluyó el polifenol en una pequeña cantidad de la leche y luego se la incorporó a
la mezcla restante.
II. Se continuó con el calentamiento de la mezcla hasta 85 ºC y se mantuvo durante 20 minutos para
lograr la pasteurización y la desnaturalización de las proteínas, agitando continuamente para
evitar precipitación de sólidos y mantener una temperatura homogénea (de 85 °C) en toda la
mezcla.
III. Pasado ese tiempo, se retiró de la fuente de calor y se dejó enfriar hasta 43 ºC.
IV. Luego de alcanzar los 43 °C, se agregó el inóculo de starter preparado anteriormente y se mezcló
durante 5 minutos para asegurar la homogeneización.
V. Se colocó en vasos de vidrio limpios en cantidades de aproximadamente 100 ml. Los mismos se
taparon con tapas plásticas y se registró el valor inicial de pH.

55
VI. Los yogures se colocaron en cámara de incubación a 43 ºC y se registró la evolución del pH cada
media hora durante toda la fermentación.
VII. Cuando el pH alcanzó un valor de 4,6-4,7 se dio por finalizada la fermentación, los vasos se
sacaron de la cámara y se conservaron a 4 °C durante 21 días.

Diagrama de flujo

La Figura 2-5 resume el proceso de elaboración de los yogures.

Figura 2-5. Diagrama de flujo del proceso de elaboración de yogur firme.

pH
Monitorear el pH es crucial para producir un yogur con una consistencia y calidad adecuada.
La cantidad de ácido láctico presente al finalizar la fermentación es la que le da la acidez
característica, favoreciendo la gelificación y actuando como un conservante contra cepas bacterianas
indeseables.

Durante el proceso de fermentación se registró el pH cada 30 minutos con un pHmetro Orion

56
3 Star (Thermo Scientific, USA). Así mismo, este parámetro se midió a lo largo de la vida útil de los
yogures en los días 7, 14 y 21 posteriores a la elaboración, durante su almacenamiento a 4 °C.

Color
El color es una sensación visual que se origina por la estimulación de la retina del ojo. La
percepción del color incluye tres elementos necesarios: una fuente de luz que emite ondas
electromagnéticas, un objeto que absorbe parte de ellas, reflejando las restantes y un observador,
que a través de sus ojos capta las ondas reflejadas y las interpreta como colores según las longitudes
de onda correspondientes. La percepción del color para cada persona es diferente ya que intervienen
factores como el tipo de luz, las características físicas del objeto y las condiciones del observador.
La evaluación del color por métodos visuales es subjetiva, la evaluación del color con colorímetros
es objetiva. Para determinar el color de los yogures se utilizó un espectrocolorímetro CM 503
Minolta Co., Tokyo, Japón (Figura 2-6), con el sistema de medición CIE L*a*b*, usando un
iluminante D65 y un observador de 10 º.

Figura 2-6. Fotografía del espectrocolorímetro Minolta.

El sistema CIE L*a*b* (Figura 2-7) es un modelo cromático usado para describir los colores
que puede percibir el ojo humano. Fue ideado en base a una teoría de color oponente que establece
que dos colores no pueden ser rojo y verde al mismo tiempo, o amarillo y azul simultáneamente.
Los parámetros de este modelo son:

 L*= Luminosidad (claro u oscuro).

 a*= Tendencia del color al rojo (positivo) o al verde (negativo).
 b*= Tendencia del color al amarillo (positivo) o al azul (negativo).

57
 Figura 2-7. Coordenadas del sistema CIE L*a*b*.

El iluminante está relacionado con la fuente de luz, y en este caso, el D65 simula la luz solar
promedio, que incluye la radiación ultravioleta; mientras que el observador se define como la visión
normal de color de la media de la población humana ya que dependiendo del ángulo de observación,
la sensibilidad del ojo cambia (MetAs, 2009).

Se realizaron mediciones por triplicado a cada una de las formulaciones a lo largo de la vida
útil de los yogures a los días 7 y 21; los parámetros de color se informan como el promedio ± la
desviación estándar (SD).

Capacidad de retención de agua

La capacidad de retención de agua (WHC, por sus siglas en inglés, water holding capacity) es
un parámetro físico importante en un producto gelificado como el yogur, por su contribución en la
calidad, ya que es una medida de la estabilidad del gel. Para su determinación se utilizó el método
modificado de Abbasi et al. (2009), el cual incluye centrifugación como fuerza externa. Se
colocaron 2 g de yogur en tubos eppendorf de 2 mL de capacidad, los cuales se centrifugaron a 5600
g durante 5 minutos (Modelo 10, Costar, USA). Posteriormente, se descartó el sobrenadante y se
pesó el gel remanente.

La capacidad de retención se calculó mediante la Ecuación 2-4:

mf Ecuación 2-4
% WHC   100
m0
donde WHC es la capacidad de retención de agua, m0 es la masa inicial de las muestras y mf
es la masa final, luego de retirar el suero sobrenadante.

58
 Se realizaron 6 mediciones a los 7 y 21 días para cada una de las formulaciones; los valores
de WHC se informan como el promedio ± la desviación estándar (SD).

Atributos mecánicos asociados a la textura

La textura está definida por los atributos mecánicos, geométricos y de superficie de un
producto, perceptible mediante receptores mecánicos, táctiles y cuando es pertinente, visuales y
auditivos. Los atributos mecánicos son los relacionados a la reacción del producto con el estrés: la
dureza, viscosidad, elasticidad y adhesividad (ISO, 2008).

En este trabajo se realizó un test de retroextrusión por medio de un texturómetro

Microsystems TA-XT2i (Figura 2-8) que brinda medidas objetivas de algunos de estos valores a
partir de la realización de una compresión. A partir de las curvas de fuerza en función del tiempo
(Figura 2-9) se obtienen los siguientes parámetros:

 Firmeza: calculada como la máxima fuerza positiva alcanzada.

 Cohesividad: calculada como el pico máximo negativo.
 Adhesividad: calculada como el área negativa bajo la curva.

Figura 2-8. Fotografía del texturómetro Microsystems TA-XT2i.

En nuestro caso se utilizó una punta de retroextrusión con anillo de 35 mm. La distancia de
penetración fue de 10 mm y la velocidad del cabezal de 1 mm/s. La medición se realizó a 10 ºC,
temperatura aproximada a la cual es consumido el yogur. Todos los ensayos fueron realizados por
duplicado, transcurridos 7 y 21 días después de la elaboración. Los parámetros de textura se

59
informan como el promedio ± la desviación estándar (SD).

Firmeza

Cohesividad
Figura 2-9. Curva modelo de fuerza en función del tiempo, resultado de un test de retroextrusión.

Caracterización del comportamiento viscoelástico

La caracterización del comportamiento viscoelástico de los yogures se realizó mediante
reometría oscilatoria. Un experimento oscilatorio consiste en someter un material a un esfuerzo o
deformación sinusoidal midiendo el esfuerzo resultante.

Este tipo de comportamiento puede ser descripto mediante números complejos; en tal sentido,
el esfuerzo puede descomponerse en dos componentes, un componente en fase y un componente
fuera de fase. Puede definirse entonces un módulo de elasticidad complejo (Ecuación 2-5)

G   G´iG´´ Ecuación 2-5

G' es el módulo de almacenamiento (elástico), o energía almacenada por ciclo, y corresponde

al carácter sólido-elástico de la muestra. G'' es el módulo de pérdida (módulo viscoso), o energía
disipada por ciclo, y corresponde al carácter viscoso-fluido.

La relación entre la componente viscosa y la elástica es la tangente (tan):

G' '
tan  
G' Ecuación 2-6
δ representa el desfase existente entre el esfuerzo y la deformación, siendo un parámetro

60
indicativo de la relación entre la energía disipada y la almacenada por el material, y del carácter
viscoelástico del mismo.

Se realizaron barridos de frecuencia de los yogures en un reómetro oscilatorio dinámico Paar

Physica MCR 300 con esfuerzo de corte controlado (Figura 2-10). Se utilizó un sistema de platos
paralelos (PP30/S) separados por un espacio (gap) de 2 mm a una temperatura de 10 °C
(temperatura habitual de consumo de yogur), controlada mediante un sistema Peltier y un baño
termostatizado (thermoscientific NESLAB RTE7).

Figura 2-10. Fotografía del reómetro Paar Physica MCR 300 con sistema de platos paralelos (PP30/S).

Las mediciones se realizaron en la región viscoelástica lineal (RVL), lo cual implica el

testeado de la estructura de la muestra de una manera no destructiva para mantener la relación lineal
entre esfuerzo y deformación. Este tipo de deformaciones no son las que se realizan en la boca, ni
tampoco son comparables a las realizadas en el texturómetro, donde se llevan a cabo deformaciones
irreversibles. Sin embargo, se supone que las propiedades viscoelásticas pueden dar una idea de la
experiencia inicial del consumidor (Sendra, Kuri, Fernández-López, Sayas-Barberá, Navarro &
Pérez-Alvarez, 2010).

En estudios preliminares, se encontraron las condiciones de amplitud y frecuencia de

deformación que permitirían trabajar en RVL. En dicha zona, las propiedades reológicas no son
dependientes de la deformación. Las condiciones del barrido de frecuencia fueron las siguientes:

61
  Frecuencia: 0,1 – 10 Hz
 Deformación: 1 %

La caracterización reológica para yogures debe responder al siguiente patrón (Almdal, Dyre,
Hvidt & Kramer, 1993): el módulo G’ es considerablemente mayor a G” (predomina el carácter
elástico) y ambos deben ser independientes de la frecuencia en un rango amplio.

A su vez, el comportamiento del módulo elástico con la frecuencia (f) puede caracterizarse
por medio de la ley de la potencia (Ikeda & Foegeding, 1999):

G ' A f n Ecuación 2-7

Aplicando logaritmo, la Ecuación 2-7 se transforma en:

log G '  n log f  K Ecuación 2-8

donde, G’ es el modulo elástico, f la frecuencia de oscilación y K una constante. El grado de

dependencia de G’ con la frecuencia puede ser expresado por medio de la constante n. Dicha
dependencia brinda información sobre el tipo de estructura que presenta el gel (Stading, Langton &
Hermansson, 1992).

Las mediciones se hicieron por duplicado para los días 7 y 21 de almacenamiento.

Microestructura
La microestructura de un material refleja las propiedades del material. Se caracteriza por el
número de fases, su proporción y su distribución dentro del sistema. Depende del número de
componentes, de la concentración de cada uno de ellos, de los defectos y de la historia del material
(Aguilera, 2005).

Para analizar la microestructura de utilizó un Microscopio Olympus (Olympus Corp. Tokyo,

Japón) modelo BX61 y una cámara de adquisición de imágenes Lumenera (Figura 2-11).

Las imágenes se capturaron a los 7 días de almacenamiento de los yogures.

62
 Figura 2-11. Fotografía del microscopio óptico Olympus.

Viabilidad de bacterias lácticas

Un microorganismo viable es aquel que al ser aislado en un medio puede generar
descendencia. La viabilidad de las bacterias ácido lácticas se realizó por medio del método de
recuento en placa, que es un método directo que se utiliza para conocer el número de células
capaces de dividirse y formar colonias. Para esto, una muestra de 0,1 ml se extendió sobre la
superficie de una placa de Petri conteniendo medio de cultivo sólido y se incubó durante 48 a 72
horas en anaerobiosis. Se calculó la cantidad de células viables en la muestra original contando el
número de colonias, ya que se considera que cada colonia se origina de una única célula.

Este estudio se realizó mediante los siguientes pasos:

1) haciendo diluciones seriadas al décimo (1 mL en 9 mL de agua peptonada) de las muestras
a evaluar,
2) sembrando aquellas diluciones seleccionadas en los medios de cultivo correspondientes
(MRS para Lactobacillus bulgaricus y M17 para Streptococcus thermophilus),
3) incubando en las condiciones óptimas para cada microorganismo (42 °C en anaerobiosis
para Lactobacillus bulgaricus y 37 °C en aerobiosis para Streptococcus thermophilus),
4) el tamaño poblacional se determinó según la Ecuación 2-9:

UFC N
 Ecuación 2-9
mL vol  dil

donde UFC/mL es el valor de unidades formadoras de colonias por mL; N es el número

63
promedio de colonias obtenidas para una dilución dada; vol es el volumen de inóculo (ml); dil es la
dilución en la cual se cuentan las colonias.

El recuento se realizó al día 0 y transcurridos 7 y 21 días de almacenamiento, por duplicado,

y se informó como Log UFC/mL.

Polifenoles totales
Para determinar el contenido de polifenoles presentes en las formulaciones, se utilizó el
método de Folin-Ciocalteau descripto por Singleton & Rossi (1965). En el mismo se construyó una
curva de calibración con ácido gálico (AG) por lo que los resultados obtenidos de cada muestra son
expresados como miligramos equivalentes de AG por litro de solución. Las muestras se diluyeron
para obtener mediciones de absorbancia dentro del rango de la curva de calibración. Luego se
agregaron en forma secuencial el reactivo de Folin-Ciocalteau (Reactivos Carlo Erba, Italia) y la
solución saturada de Na2CO3. Luego de incubar las muestras durante media hora a 40 ºC, se midió
la absorbancia a 765 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.

Cada muestra se analizó por triplicado a los 7 días de elaborado el yogur. El contenido de
polifenoles totales se informa como el promedio ± la desviación estándar (SD).

Actividad antioxidante
Aunque no existe un único método capaz de proveer una imagen completa del perfil
antioxidante de una determinada muestra, una estimación rápida de la capacidad neutralizante de
radicales libres mediante el uso de 2,2-difenil-picrilhidrazilo (DPPH·), podría proveer información
preliminar sobre la capacidad antioxidante de estos sistemas. DPPH· es uno de los pocos radicales
libres orgánicos estables que existen y ha sido ampliamente utilizado para determinar la capacidad
secuestradora de radicales libres de muchas muestras conteniendo polifenoles. Este radical libre es
susceptible de reaccionar con compuestos antioxidantes a traves de un proceso caracterizado por la
cesión de un atomo de hidrógeno proporcionado por el agente antioxidante. Por ello, para
determinar la capacidad antioxidante se utilizó la estimacion por medio del DPPH·, el cual se
obtuvo de Sigma-Aldrich®, (Buenos Aires, Argentina). En el ensayo se mezclaron 5,0 μL de la
muestra con 2,0 mL de una solución metanólica de DPPH 0,1 mM preparada en el día. Luego de 30
minutos de incubación en oscuridad, se midió la absorbancia a 517 nm contra un blanco de metanol
en un espectrofotómetro Uv-Vis. El porcentaje de inhibición del radical DPPH· se calculó por

64
medio de la Ecuación 2-10:

A0  ( Am  Ab )
Capacidad neutraliza nte del radical DPPH  Ecuación 2-10
A0  100
donde A0 es la absorbancia de la solución control (conteniendo sólo DPPH), Am es la
absorbancia de la solución de DPPH· en presencia de la muestra y Ab es la absorbancia de la
muestra sin DPPH·.

Cada muestra se analizó por triplicado a los días 0, 7 y 21 de elaborado. La actividad

antioxidante se informa como el promedio ± la desviación estándar (SD).

Digestión gastroduodenal in vitro de los yogures

Con el objetivo de evaluar de manera adicional la actividad antioxidante y el contenido de
polifenoles totales del yogur ya digerido, condición en que los polifenoles serán absorbidos, se
sometieron a los yogures a una digestión gastroduodenal in vitro.

Fluidos que simulan las condiciones de digestión gástrica y duodenal

Las condiciones de digestión gástrica fueron simuladas a partir de la utilización de un fluido

gástrico simulado (FGS) que representa las condiciones de pH y fuerza iónica características del
estómago humano (Kalantzi, Goumas, Kalioras, Abrahamsson, Dressman & Reppas, 2006). El
mismo consiste en una mezcla de sales formadas por: NaCl (100 mM), CaCl2 (3 mM), NaH2PO4 (5
mM) y KCl (22 mM), ajustada a pH 2,5 con cantidad suficiente de HCl (1 M). En el FGS se diluyen
los componentes característicos del medio gástrico como fosfatidilcolina (PC, P3556 Sigma
Aldrich®) y pepsina (mucosa gástrica porcina, P7000 Sigma Aldrich®) a concentraciones
fisiológicas (Macierzanka, Sancho, Mills, Rigby & Mackie, 2009).

Por otra parte, las condiciones de digestión duodenal fueron simuladas a partir de la
utilización del fluido intestinal simulado (FIS), consistente en una mezcla compleja de iones (39
mM de K2HPO4, 150 mM de NaCl y 30 mM de CaCl2) ajustada a pH 7, según el protocolo
reportado por Sarkar, Horne y Singh (2010). En el FIS, se llevó a cabo la dilución de los diferentes
componentes fisiológicos que participan en la digestión duodenal, entre ellos: sales biliares
(Páncreas bovino, B3883 Sigma Aldrich®), tripsina (Páncreas bovino, T8003 Sigma Aldrich®), α-
quimotripsina (Páncreas bovino, C4129 Sigma Aldrich®) y lipasa pancreática tipo II (Páncreas
porcino, L0382 Sigma Aldrich®), todos a concentración fisiológica.

65
Proceso de simulación de la digestión gastroduodenal in vitro

Las muestras de yogur se sometieron a un proceso de digestión gastroduodenal in vitro,

consistente en una etapa gástrica (1 hora a pH 2,5) seguida de una etapa duodenal (1 hora a pH 7,0).
Este proceso se llevó a cabo a temperatura fisiológica (37 °C), bajo agitación constante en un vaso
de vidrio con doble camisa (Figura 2-12). En primer lugar, se colocaron 10 gramos de yogur en el
recipiente de reacción, donde fueron termostatizados a 37 °C durante 10 min. A continuación se
incorporaron 10 ml FGS en presencia de concentraciones fisiológicas de PC (proteína (1):PC (1,2))
y pepsina (182 U/mg de proteína) (Macierzanka et al., 2009). De ser necesario, la mezcla resultante
se ajustó a pH 2,5 utilizando HCl 1 M. Finalizada la digestión gástrica (1 h), la mezcla resultante se
ajustó a pH 7 con NaOH 1 M. El aumento de pH (de 2,5 a 7) pone fin a la etapa gástrica de la
digestión, originando la inactivación de la pepsina (Piper & Fenton, 1965).
Agua (37 ºC)

Muestra
Agua (37 ºC) Buzo magnético

Agitador magnético

Figura 2-12. Esquema del recipiente utilizado para llevar a cabo el proceso de digestión in vitro.

A continuación, la etapa intestinal de la digestión comenzó con la incorporación a la mezcla

de 10 ml de FIS en presencia de concentraciones fisiológicas de SB (5 mg/ml), lipasa pancreática
(200000 U) y las proteasas, tripsina y α-quimotripsina en una proporción de 34,5 U y 0,44 U de
enzima por mg de proteína, respectivamente. La mezcla se mantuvo por 1 hora en condiciones de
digestión duodenal, manteniendo el pH en un valor constante (pH 7) a partir de la adición de
cantidad necesaria de NaOH (0,5 M) (Jiménez-Saiz, Ruiz-Henestrosa, López-Fandiño & Molina,
2012; McClements & Li, 2010; Sarkar, Goh, Singh & Singh, 2009; Sarkar et al., 2010). Para detener
las reacciones y finalizar con el proceso de digestión in vitro, las enzimas fueron inactivadas
empleando concentraciones adecuadas de inhibidores: inhibidor de tripsina y quimotripsina, para las
proteasas intestinales (Proteína de soja, T9777 Sigma Aldrich®) y Orlistat (O4139 Sigma Aldrich®)
para detener la actividad de la lipasa pancreática.

66
Análisis estadístico
Todos los experimentos fueron realizados al menos por duplicado. Los datos obtenidos fueron
sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) (p < 0,05) utilizando el programa estadístico
Statgraphics Centurion XV / Statgraphic Plus 5.1 para determinar diferencias estadísticamente
significativas entre muestras.

67
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69
Resultados y Discusión
Caracterización de las partículas proteicas

Las interacciones entre componentes fenólicos y proteínas ocurren muy frecuentemente en

alimentos y bebidas, afectando en algunos casos las propiedades funcionales de los alimentos (von
Staszewski, 2011). Como se mencionó en la introducción, debido a la natural afinidad entre las
proteínas y los polifenoles, estos dos tipos de moléculas pueden unirse espontáneamente para
formar agregados proteína-polifenol a los que nos referiremos, de aquí en adelante, como partículas
proteicas. Estas partículas pueden involucrar unas pocas moléculas y mantenerse en la escala
nanométrica, o experimentar una extensa agregación y producir partículas micrométricas.

Sumada a la interacción proteína–polifenol, en nuestro caso WPC-polifenol, encontramos en

las partículas proteicas la interacción proteína-proteína que se da entre WPC y gelatina. En muchos
alimentos, las proteínas son fundamentales en la determinación de la mayoría de los atributos de
calidad del producto final. No sólo el tipo y la concentración de proteína, sino también el método
de procesamiento y las condiciones ambientales afectarán la microestructura, textura, apariencia y
estabilidad del producto final. Las operaciones unitarias de procesamiento tales como
calentamiento, altas presiones, acidificación y mezclado de proteínas son diseñadas para afectar las
interacciones proteína–proteína con el fin de obtener determinadas texturas y microestructuras. Por
medio de cambios de las condiciones ambientales y de procesamiento es posible modular la
extensión de los cambios estructurales de las proteínas y, por lo tanto, afectar la cinética de
agregación o de formación de sitios reactivos en las proteínas. Cuando se mezclan diferentes
proteínas, su compatibilidad o incompatibilidad podría causar la formación de diferentes texturas y
microestructuras (Martinez, 2010).

Para caracterizar las partículas proteicas se procedió a analizar el potencial zeta y la

distribución de tamaño de partículas de las mismas.

Potencial zeta

El potencial zeta (ζ) es una propiedad física que posee cualquier partícula en suspensión. Es
una medida de la magnitud de repulsión o atracción entre las partículas. Su evaluación se utiliza
para determinar la carga neta superficial de las partículas en solución, y proporciona una idea
detallada de los mecanismos de dispersión y de la estabilidad de sistemas coloidales.

Se considera que una suspensión es estable cuando tiene valores de potencial zeta mayores a
30 mV en valor absoluto (+30 mV o -30 mV). Si las partículas tienen, en cambio, bajos valores de

71
potencial zeta, las fuerzas que previenen que las partículas se acerquen serán más débiles y la
tendencia a agregarse será mayor. El factor más importante que afecta el potencial ζ es el pH. A pH
alto, el potencial ζ será negativo y a pH bajo, positivo. El pH en el cual el potencial ζ se hace cero
se conoce como punto isoeléctrico (Malvern-Instruments, 2014).

Con el objetivo de determinar las condiciones óptimas de interacción WPC-gelatina para la

formación de las partículas proteicas, se determinó el potencial ζ de cada solución proteica
individualmente entre pH 2,5 y 7. En estudios previos se determinó que la presencia de polifenol, a
las concentraciones utilizadas en este trabajo, no afecta el potencial ζ de WPC, por lo que en este
ensayo no se incluyó al polifenol. Los resultados de potencial ζ de las soluciones de WPC y de
gelatina se muestran en la Figura 3-1, donde es posible observar los puntos isoeléctricos (pI) de
ambas proteínas, siendo 4,5 para WPC y 5,75 para gelatina.

Figura 3-1. Variación de potencial ζ (mV) en función del pH de WPC ( % p/p a 25 ºC.

Se sabe que el pH óptimo para promover la unión de dos biopolímeros, en este caso dos
proteínas, se encuentra dentro del rango de pHs localizado entre los valores de pIs, donde las
cargas de estos biopolímeros son opuestas y la unión electrostática es más probable. Sin embargo,
en este trabajo, para promover la unión entre las partículas de WPC y gelatina, se optó por mezclar
las soluciones a pH 6 por dos razones principales:

72
 a) es un valor de pH más próximo al de la leche (6,6-6,8) y de esta manera no se modificaría
en gran medida el pH del medio donde ocurrirá la fermentación. Con esto se busca que los cambios
de pH que ocurran sean debidos al proceso de fermentación, ya que son los microorganismos
starter los que deben bajar el pH del yogur hasta 4,5-4,6;

b) se ha reportado que las caseínas de la leche comienzan a agregarse a un pH por debajo de

6 hasta alcanzar un mayor grado de asociación y finalmente gelificar al alcanzar su pI (~ 4,6)
(Morales, 2017), por lo que con el objetivo de que las partículas queden incluidas en dicha red
gelificada se requiere iniciar el proceso a un pH ≥ 6.

De todos modos, a pesar de que el pH 6 es un valor levemente superior al pI de la gelatina, el

potencial ζ de esta última a dicho pH es cercano a 0 (Figura 3-1). Es decir que esta proteína se
encuentra más bien neutra y es factible que pueda interactuar con las proteínas del suero aunque
éstas se encuentren con carga neta negativa. Esto se debe a que las proteínas también tienen
regiones hidrofóbicas en su superficie que están dispersas entre las regiones más hidrofílicas o
polares. Estos “parches” hidrofóbicos se deben a la presencia de cadenas laterales de aminoácidos
hidrofóbicos o no polares como fenilalanina, triptófano, alanina y metionina. Entonces, dado que al
pH elegido la gelatina se encuentra con carga neta cercana a cero, existe una menor repulsión
electrostática con el WPC y las interacciones hidrofóbicas entre ambas proteínas se verán
favorecidas y contribuirán a las de tipo electrostático que puedan generarse.

Distribución de tamaño de partículas

En estudios previos de nuestro grupo, se determinó la distribución de tamaño de soluciones

de partículas WPC-polifenol (von Staszewski, 2011) y de las soluciones de gelatina a diferentes
concentraciones y se determinaron las condiciones óptimas para la obtención de partículas estables
a cambios de pH (en el rango de 4,5 a 6,5) (Rodríguez, von Staszewski & Pilosof, 2015). En el
presente trabajo se caracterizó el tamaño de las partículas proteicas completas (WPC + polifenol +
gelatina) obtenidas mediante las condiciones optimizadas en dichos ensayos preliminares.

En el gráfico de la distribución expresado en volumen (Figura 3-2) se puede observar que se

obtuvieron distintos picos según la concentración de polifenol utilizada. La mezcla WPC-gelatina
sin agregado de polifenol (0 % polifenol) presentó un pico principal con un valor máximo en 0,3
µm y un segundo pico, muy pequeño, con un valor máximo en 8 µm. Las soluciones con agregado
de polifenol presentaron también un pico principal en tamaños pequeños, pero los valores máximos
se ubicaron en tamaños levemente superiores al de la mezcla WPC-gelatina sin agregado de
polifenol. El valor máximo del primer pico en los 3 casos (0,25 %, 0,5 % y 1 % polifenol) se

73
observó en 0,45 µm. El segundo pico de estas 3 muestras fue más importante en cantidad respecto
a la muestra sin polifenol y se encontró entre 3 – 6 µm. Adicionalmente, la solución con mayor
concentración de polifenol (1 % polifenol) presentó, además, un hombro a tamaños mayores (30
µm).

Si bien, el tamaño de las partículas se encontró mayoritariamente entre 0,3 µm sin polifenol
y 0,45 µm en presencia de polifenol, se hace visible que a medida que se incorpora polifenol hay
mayor cantidad de partículas de mayor tamaño, lo que sugeriría que la incorporación de polifenol
aumenta el tamaño de las partículas proteicas.

Figura 3-2. Distribución de tamaño de partícula para las partículas proteicas. WPC 3 % - gelatina 0,25 % y
polifenol: 0 % (), 0,25 % (), 0,5 % () y 1 % ().

Las micropartículas proteicas han sido utilizadas como reemplazantes de grasa comerciales
(por ejemplo, Simplesse®) en diversos alimentos (Ipsen, 2017). Pero para lograr el efecto de
cremosidad deseado, las micropartículas deben tener un tamaño menor a 5 µm, para simular las
gotas de aceite de una emulsión; partículas más grandes que 5 µm causarían una textura gruesa y
arenosa en el producto final. Aunque nuestro objetivo no sea el de reemplazar la grasa en un
producto, es muy importante medir el tamaño de las partículas obtenidas y seleccionar aquellas
condiciones que aseguren que la fortificación no causará efectos indeseables en la textura o en
otros parámetros sensoriales de los productos en los que se desee incluir, en nuestro caso yogures,
aún tratándose de un bajo porcentaje de partículas incorporadas.

74
 Como se explicó en el apartado Caracterización del tamaño de las partículas proteicas de
Materiales y Métodos, el parámetro D3,2 brinda una medida del diámetro promedio en donde se
encuentran la mayoría de las partículas y el D4,3 está relacionado con cambios en el tamaño de
partículas que involucran procesos de desestabilización. Los valores de estos dos parámetros
obtenidos para las soluciones evaluadas se muestran en la Tabla 3-1.

En general, se puede observar un tamaño de partícula mayor en presencia de polifenol; sin

embargo, dicho aumento sólo fue significativo en presencia de las mayores concentraciones de
polifenol (1 % polifenol para el parámetro D3,2 y 0,5 % y 1 % polifenol para el parámetro D4,3).

Tabla 3-1. D3,2 y D4,3, obtenidos por SLS, de las partículas proteicas solas y con el agregado
de diferentes concentraciones de polifenol.

Concentración de
D3,2 (µm) D4,3 (µm)
polifenol (%)
0 0,164 ± 0,001 a 2,640 ± 0,966 A
0,25 0,205 ± 0,004 ab 4,246 ± 0,493 AB
0,5 0,184 ± 0,013 a 4,920 ± 0,558 B
1 0,236 ± 0,065 b 8,293 ± 1,961 C

Promedio ± desvío estándar de duplicados. Letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) entre mediciones de D3,2. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas (p<0,05) entre mediciones de D4,3.

Estos resultados son congruentes con los modelos que proponen que los complejos de
proteína y polifenol se forman por múltiples interacciones débiles entre las cadenas laterales de los
aminoácidos y los anillos aromáticos de los polifenoles, por lo que al aumentar la concentración de
polifenoles, se favorecerían las interacciones aumentando así el tamaño de las partículas. Es decir
que cada molécula de proteína forma un complejo soluble con los polifenoles y luego comienza a
unirse a otros complejos, formando agregados, donde las interacciones débiles cooperativas
intermoleculares también son llevadas a cabo por polifenoles (Charlton et al., 2002; Jöbstl,
O´Connell, Fairclough & Williamson, 2004; Lin, Chen, Cheng & Chen, 2004; Poncet-Legrand,
Edelmann, Putaux, Cartalade, Sarni-Manchado & Vernhet, 2006; Richard, Lefeuvre, Descendit,
Quideau & Monti, 2006; Shafaei et al., 2017; Siebert, Troukhanova & Lynn, 1996).

75
Caracterización del yogur

El yogur es un producto lácteo que se obtiene mediante la fermentación que realizan las
bacterias ácido lácticas (BAL), que consumen la lactosa de la leche produciendo ácido láctico, lo
que induce la disminución del pH hasta un valor menor o igual a 4,6 (Luquet & Carrieu, 2005).
Esta disminución del pH reduce la carga superficial de las micelas de caseína hasta llegar a su
punto isoeléctrico lo que permite que se formen agregados a través de enlaces hidrofóbicos y
electrostáticos formando la red que constituye el gel.

Las características físico-químicas y organolépticas son un parámetro de calidad del yogur.

La calidad depende de las técnicas de elaboración empleadas, de la higiene personal, de los
utensilios utilizados y de la calidad de la materia prima.

Algunos de los defectos más habituales son: sinéresis, debido a un contenido insuficiente de
sólidos no grasos, alta temperatura de incubación o encogimiento del gel; presencia de burbujas,
por una posible contaminación microbiana; textura granulosa, debido a materia prima en polvo sin
disolver, entre otros (Robinson & Itsaranuwat, 2007). La superficie de un yogur debe ser lisa,
pareja, brillante y libre de suero, y su interior debe presentar una apariencia homogénea (Robinson
et al., 2007). A su vez, los compuestos responsables del flavour, como el ácido láctico, el ácido
acético y el acetaldehído, son generados por las BAL a medida que se desarrolla la fermentación
(Marsili, 2011). Por lo tanto, la obtención de un yogur que sea del agrado del consumidor, se basa
en lograr un balance entre acidez, textura y flavour.

Con los ensayos de caracterización se busca realizar un seguimiento y control, tanto del
proceso de elaboración como del almacenamiento del yogur. Además, dado que la incorporación de
nuevos ingredientes en la composición de un yogur contribuye a modificar las propiedades y
características de este producto lácteo, es importante analizar las consecuencias derivadas de dichas
modificaciones. En este caso particular, se estudia el efecto del agregado de polifenol de té verde
mediante dos formas de adición: de manera directa o incluidas en partículas proteicas que
contienen, a su vez, distintas concentraciones de polifenol.

Evolución del pH durante el proceso de fermentación

En la Figura 3-3 se muestra la evolución del pH durante el proceso de fermentación para las
distintas formulaciones. Como se mencionó en Materiales y Métodos, las distintas formulaciones
de yogures se rotularon de la siguiente manera:

76
  0 % sp: sin partículas - sin polifenol
 0 %: con partículas – sin polifenol
 0,025 %: con partículas – con 0,025 % de polifenol
 0,05 %: con partículas – con 0,05 % de polifenol
 0,1 %: con partículas – con 0,1 % de polifenol
 0,1 % sp: sin partículas – con 0,1 % de polifenol

El pH inicial de todas las formulaciones fue 6,1-6,2, un poco inferior al pH de la leche (6,6-
6,8). Esto es debido principalmente a que en este punto ya se realizó el agregado del cultivo starter
que se encontraba a un pH cercano a 4,2 y además, en el caso particular de las formulaciones con
partículas, también las partículas proteicas que se encontraban a pH 6 pueden contribuir a la
disminución del pH de la mezcla. Posteriormente, durante el tiempo de fermentación, el pH
desciende hasta alcanzar un valor final de 4,6, momento en el cual se da por finalizado el proceso y
se refrigeran las muestras (Figura 3-3).

Las curvas presentan un primer tramo marcado por un rápido descenso del pH, asociado a la
fase de crecimiento exponencial de las BAL, seguido por una segunda etapa de desaceleración,
durante la cual el nivel de acidez se torna limitante para el desarrollo de las mismas (Shaker, Jumah
& Abu-Jdayil, 2000). El cambio de pendiente, aproximadamente a pH 5, también puede deberse al
incremento en la capacidad buffer debido al pKa del ácido láctico (pKa 3,95) (Lucey, 2004) y a la
solubilización del fosfato de calcio coloidal (McCarthy, 2011; Peng, Serra, Horne & Lucey, 2009).
Cuanto mayor es la capacidad buffer, mayor es la resistencia al cambio de pH y, por ende, menor la
velocidad de acidificación.

En la Figura 3-3 se puede observar además un leve descenso del tiempo de fermentación
entre la muestra 0 sp (4 h) respecto a las otras formulaciones con agregado de partículas proteicas
(4,5 h) e incluso de 0,1 sp. Sin embargo, dicho aumento de tiempo no resulta significativo en el
proceso total.

Por otro lado, no se observaron diferencias en el tiempo de fermentación entre las diferentes
formulaciones con concentraciones variables de polifenol.

77
 Figura 3-3. Evolución del pH durante el proceso de fermentación a 43 ºC, para todas las formulaciones.

Evolución del pH durante el almacenamiento

Durante el almacenamiento, las bacterias acido lácticas continúan lentamente su actividad

metabólica produciendo ácido láctico, a pesar de que la temperatura de almacenamiento es baja (<
5 °C), lo que provoca que el medio continúe acidificándose levemente. En la Figura 3-4 se muestra
la evolución del pH a lo largo del tiempo de almacenamiento de las distintas formulaciones.

El pH mostró una tendencia general a disminuir su valor durante el almacenamiento

principalmente durante las primeras dos semanas. Luego se mantuvo constante o en algún caso
aumentó levemente. Beal, Skokanova, Latrille, Martin y Corrieu (1999) reportaron que hay una alta
tasa de producción de ácido láctico y galactosa en los primeros 14 días debido a la alta actividad
metabólica bacteriana asociada con el consumo de lactosa. Esto produce una disminución del pH
que puede mantenerse a lo largo de la vida útil del yogur o no. Por otro lado, existen estudios en los
que se registró un incremento de pH entre los días 14 y 21, que fue atribuido a la capacidad de S.
thermophilus de producir ciertos metabolitos básicos (Ramchandran & Shah, 2010).

78
 Figura 3-4. Evolución del pH de los yogures durante el tiempo de almacenamiento.

Con respecto a las diferentes formulaciones, no se observaron grandes diferencias

relacionadas a la presencia de partículas proteicas ni a las diferentes concentraciones de polifenol.
De manera similar, se reportó que la incorporación de té verde en yogur (Najgebauer-Lejko, Sady,
Grega & Walczycka, 2011) o de extractos de semillas de uva (con un importante contenido de
polifenoles) en yogur (Chouchouli, Kalogeropoulos, Konteles, Karvela, Makris & Karathanos,
2013), no produjo cambios significativos en el pH.

Color

El color del producto es un parámetro muy importante para el marketing y la aceptación del
consumidor. Es el primer parámetro sensorial percibido y tiende a modificar otras percepciones
como sabor y aroma. La incorporación de cualquier soluto puede alterar las propiedades ópticas de
los alimentos, debido a que pueden presentar un índice de refracción diferente con respecto al
medio que las rodea. El impacto en la apariencia del producto dependerá también de la
concentración y tamaño de las mismas (Jones, Decker & McClements, 2009; McClements, 2002).

Los polifenoles del té verde comprenden el grupo de los flavonoides, ricos en catequinas, los

79
cuales presentan un color característico rojizo o amarillento aún disueltos en agua. Por ello es que
se pretende evaluar si su incorporación traerá aparejado un cambio en la coloración de los yogures.

No se observaron diferencias significativas en el parámetro L* durante el almacenamiento

para ninguna formulación (Figura 3-5). Por el contrario, en otros estudios se reportó un aumento
de L* durante el almacenamiento que fue atribuido a la compactación de sólidos de la matriz y al
incremento de la sinéresis (Vargas, Cháfer, Albors, Chiralt & González-Martínez, 2008). La
expulsión de agua tendería a concentrar el color y, por ende, aumentar L* (Ramírez-Sucre &
Vélez-Ruiz, 2013).

Figura 3-5. Valores del parámetro L* para cada formulación durante el tiempo de almacenamiento. Los
asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en una misma formulación durante
el almacenamiento. Letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
entre mediciones realizadas el día 7. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) entre mediciones realizadas el día 21.

Por otro lado, las diferentes formulaciones evaluadas a un mismo tiempo de almacenamiento
presentaron, en general, un leve aumento del parámetro L* en presencia de polifenoles respecto a la
muestra 0 sp. Sin embargo, dicho aumento no resultó significativo en todos los casos y no se ve
una correspondencia con las concentraciones de polifenol utilizadas, por lo que dicho efecto no es
atribuible al aumento de la concentración de polifenol. A su vez, tampoco se observaron

80
diferencias significativas entre las formulaciones en las que los polifenoles fueron adicionados en
partículas proteicas y en la que se incorporó de manera directa.

Por lo tanto, a pesar de las sutiles diferencias, se puede sugerir que el agregado de polifenol y
de partículas proteicas no afectó la luminosidad del yogur ya que dicho parámetro se mantuvo en
un valor entre 74 y 83 en todos los casos.

En la Figura 3-6 se muestran los valores del parámetro a*. Cuanto más positivo sea a*,
mayor es la intensidad del color rojo de la muestra, mientras que valores negativos, señalan una
tendencia hacia el verde.

Figura 3-6. Valores del parámetro a* para cada formulación durante el tiempo de almacenamiento. Los
asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en una misma formulación durante
el almacenamiento. Letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
entre mediciones realizadas el día 7. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) entre mediciones realizadas el día 21.

En primer lugar se puede observar que las formulaciones 0 sp, 0, 0,025 y 0,05 presentaron
valores negativos, mientras que las dos formulaciones con 0,1 % de polifenol (ya sea con o sin
partículas proteicas) presentaron valores positivos. El WPC presenta, aunque leve, una coloración
verde en solución, por lo que es de esperarse que cuando es incorporado en el yogur (formulación
0) genere una disminución del parámetro a* respecto a 0 sp (sin WPC) mostrando una tendencia a
la tonalidad verdosa. Por otro lado, el agregado de polifenol le otorga al yogur una coloración

81
rojiza, la cual aumenta proporcionalmente con la concentración. A medida que aumenta la
concentración de polifenol éste podría contrarrestar la tonalidad verde propia del yogur más la
otorgada por el WPC hasta llegar a los valores más positivos (tonalidad más rojiza) observados en
las formulaciones 0,1 y 0,1 sp. El agregado de polifenol tiene un efecto mayor en la coloración que
el agregado de WPC, lo que se puede observar ya que no hay diferencias entre las formulaciones
0,1 y 0,1 sp, las que difieren por contener o no partículas proteicas (Figura 3-6). Otros autores
también observaron un comportamiento similar del parámetro a*, virando desde valores negativos
hasta valores positivos al incorporar extractos de té verde en el yogur (Najgebauer-Lejko,
Zmudzinski, Ptaszek & Robert Socha, 2014).

Con respecto a la variación del parámetro a* durante el tiempo de almacenamiento, se

observaron diferencias significativas para el yogur control y las formulaciones 0,1 y 0,1 sp. Sin
embargo, teniendo en cuenta que todos los valores se encuentran entre -1,5 y 0,75 de a, se puede
asumir que dichas diferencias no resultarían relevantes con respecto a la percepción del
consumidor.

El parámetro b* indica la tendencia al color amarillo (positivo) o azul (negativo) y los

valores de dicho parámetro para las diferentes formulaciones se muestran en la Figura 3-7. En
general, no se observaron diferencias significativas en el parámetro b*, ni durante el tiempo de
almacenamiento ni tampoco por el agregado de partículas, ni de polifenol y nuevamente este
parámetro sufrió variaciones en un rango acotado de valores (valores de b* entre 10 y 11), por lo
que tampoco serían perceptibles. Esto puede deberse a que ni los polifenoles, ni las partículas
proteicas incorporan tonalidades que afecten a este parámetro.

82
 Figura 3-7. Valores del parámetro b* para cada formulación durante el tiempo de almacenamiento. Los
asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en una misma formulación durante
el almacenamiento. Letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
entre mediciones realizadas el día 7. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) entre mediciones realizadas el día 21.

Capacidad de retención de agua

La capacidad de retención de agua (WHC) es una de las cualidades más importantes de los
yogures. Cuanto mayor sea su valor, mejor es la estabilidad del gel. WHC se relaciona
inversamente con la sinéresis. Un gel con una estructura bien formada tendrá una alta capacidad de
retención y por ende, poca sinéresis (Ramchandran et al., 2010). La sinéresis es la contracción del
gel, que conduce a la separación del suero de leche (Lucey, 2004; McCann, Fabre & Day, 2011;
Ramchandran et al., 2010). Es la aparición espontánea de líquido en la superficie del yogur sin la
aplicación de ninguna fuerza externa y está relacionada con la inestabilidad de la red proteica, es
decir, grandes reestructuraciones, resultando en la pérdida de la capacidad para retener la fase
acuosa durante el almacenamiento (Everett & McLeod, 2005; Lucey, 2002; Zare, Boye, Orsat,
Champagne & Simpson, 2011).

Algunas posibles causas de aparición de sinéresis en yogures son: la baja calidad de la leche,

83
el bajo contenido de sólidos no grasos, un insuficiente calentamiento y homogeneización de la
leche, la baja acidez, o una temperatura de incubación muy alta. La sinéresis en el yogur también se
ve afectada por la presencia de aditivos como pueden ser gomas y por la adición de minerales
disminuyendo el porcentaje de sinéresis (Tamime & Robinson, 2007). La tendencia a la sinéresis es
menor en aquellos yogures que exhiben poros chicos, alta firmeza y alto módulo elástico, entre
otras características (Lucey, 2004).

Para medir esta propiedad, se somete el yogur a fuerzas externas como la centrifugación a
altas velocidades. La liberación de suero bajo estas condiciones está relacionada con la rigidez de
la red, es decir, la habilidad para resistir grandes fuerzas externas (Lucey & Singh, 1997). En la
Figura 3-8 se muestran los valores de WHC de todos los yogures durante el almacenamiento. Se
puede observar que, en general, los valores de WHC aumentaron con el agregado de partículas.
Dicha diferencia resultó significativa a los 21 días de almacenamiento, donde el yogur 0 sp mostró
un valor de WHC significativamente menor al resto de las formulaciones, incluso menor al yogur
con agregado de polifenol, pero sin partículas (0,1 sp). Se sabe que el aumento del contenido de
proteína en el yogur disminuye la cantidad de agua expulsada por el gel cuando se somete a una
fuerza centrífuga externa, sin embargo, este resultado depende de la composición y del proceso de
desnaturalización aplicado (Torres, Amigo, Knudsen, Tolkach, Mikkelsen & Ipsen, 2018). Si bien
en los yogures con agregado de partículas se mantuvo constante el número de solidos totales, las
partículas proteicas agregadas podrían proporcionar una mayor capacidad de retención de agua. La
gelatina es usada ampliamente en la industria de alimentos por su gran capacidad de retención de
agua. A pesar de que la cantidad empleada de gelatina en este trabajo es inferior a la usualmente
empleada para actuar como estabilizante, es posible que igualmente proporcione un efecto
estabilizante, sobre todo a lo largo de la vida útil, ya sea por sí sola o en mezclas con proteínas
lácteas (Sarbon, Badii & Howell, 2015).

Por otro lado, el yogur 0,1 sp, si bien inicialmente (7 días de almacenamiento) presentó un
valor de WHC similar a 0 sp, se observó un incremento en dicho valor con el tiempo de
almacenamiento, a pesar de no contener partículas proteicas. Esto puede explicarse por el hecho de
que los polifenoles serían capaces de interactuar con las proteínas de la leche (von Staszewski,
2011), reordenando la estructura y generando una matriz menos susceptible a la pérdida de agua.
Najgebauer-Lejko et al. (2014) reportaron que la incorporación de té verde en yogur producía una
mayor acidez valorable, mejores propiedades mecánicas y menor susceptibilidad a la sinéresis.
Muchos modelos sugieren una interacción entre proteína-polifenol principalmente como un
fenómeno superficial; sin embargo, a veces, estas interacciones pueden ser complementadas por
enlaces de hidrógeno, que refuerzan y estabilizan los complejos (Charlton et al., 2002; Oliveira,

84
Alexandre, Coelho, Lopes, Almeida & Pintado, 2015). Los complejos estables con enlaces internos
fuertes pueden conducir a una reducción de la transposición de proteínas durante el
almacenamiento, proporcionando redes de caseína, con mayor capacidad de mantener el agua y
reduciendo así la sinéresis de los yogures.

Figura 3-8. WHC (%) de cada formulación durante el tiempo de almacenamiento. Los asteriscos (*) indican
diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en una misma formulación durante el almacenamiento.
Letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre mediciones
realizadas el día 7. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
entre mediciones realizadas el día 21.

Atributos mecánicos asociados a la textura

La textura involucra un grupo de propiedades físicas que se derivan de la estructura del

alimento y de la manera en que interactúan sus ingredientes (Pereira, Singh, Munro & Luckman,
2003). El agregado de nuevos componentes durante la elaboración de yogur conduce a la
formación de geles con estructura y propiedades diferentes (Domagała, Wszołek, Tamime &
Kupiec-Teahan, 2013). En particular, se ha reportado que el agregado de proteína de suero de leche
provoca, en general, un aumento de la fuerza del gel del yogur (Puvanenthiran, Williams &
Augustin, 2002). Sin embargo, otros autores no encontraron efecto (Jelen, Buchheim & Peters,
1987; Morris, Ghaleb, Smith & Bastian, 1995); o incluso reportaron una disminución en la firmeza

85
del mismo (Guzmán-González, Morais, Ramos & Amigo, 1999; Lucey, Munro & Singh, 1999;
Modler & Kalab, 1983) según las condiciones de proceso, composición y concentración en las que
se adicione.

En la Figura 3-9 se muestran los valores de firmeza para las formulaciones a los 7 y 21 días
de almacenamiento. En primer lugar, se puede observar que si bien existe un aumento de la firmeza
durante el almacenamiento para todas las formulaciones, dicho cambio en general no fue
significativo.

Figura 3-9. Valores de firmeza para cada formulación a los 7 y 21 días. Los asteriscos (*) indican diferencias
estadísticamente significativas (p<0,05) en una misma formulación durante el almacenamiento. Letras
minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre mediciones
realizadas el día 7. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
entre mediciones realizadas el día 21.

Al comparar entre formulaciones, aquellas que contienen partículas proteicas presentaron

una firmeza significativamente mayor que 0 sp, lo que puede ser atribuido a la adición de las
mismas. Como se mencionó anteriormente, las mezclas de gelatina con proteína de leche son
ampliamente utilizadas en productos alimenticios, ya que juegan un papel esencial en la textura y la
estabilidad de muchos sistemas alimentarios (Sarbon et al., 2015). El aumento en el contenido de
proteínas conduce a redes más fuertes y apretadas debido a una reducción de la distancia entre las

86
partículas de proteína en la matriz, lo que resulta en productos que son más firmes (Chever,
Guyomarc'h, Beaucher & Famelart, 2014; Purwanti, van der Goot, Boom & Vereijken, 2010). Del
mismo modo que lo explicado en el análisis de los resultados de WHC, se podría sugerir que las
partículas proteicas agregadas, aunque en baja proporción, podría contribuir a aumentar la firmeza
de los yogures.

Por otro lado, al comparar 0,1 sp con el yogur 0 sp, siendo ambas formulaciones sin
partículas proteicas, se puede observar que la firmeza es mayor en la que tiene polifenol, lo que
también coincide con la mayor WHC obtenida en esta misma formulación, como se mostró
previamente. Por lo tanto, puede observarse que la fortificación con polifenoles podría afectar la
textura de productos lácteos (O’Connell & Fox, 2001), y el aumento de la firmeza del yogur 0,1 sp
respecto al yogur 0 sp podría atribuirse al efecto del polifenol en la interacción con las proteínas
lácteas. De manera similar, Avci, Yuksel y Erdem (2010) observaron una mayor firmeza en
yogures enriquecidos con extractos de té verde y explicaron este fenómeno debido a la reticulación
de proteínas y flavonoides.

En las Figura 3-10 A y B se muestran los valores de cohesividad y adhesividad,

respectivamente, para las formulaciones a los 7 y 21 días de almacenamiento. La cohesividad
representa la fuerza con la que está unida la estructura del material, es decir, el límite hasta el cual
se puede deformar antes de romperse (Szcsesniak, 2002); mientras que la adhesividad está
relacionada con el trabajo necesario para despegar el cabezal de la muestra, es decir, el trabajo
necesario para vencer las fuerzas de atracción entre la superficie del alimento y la superficie de
otros materiales en contacto, como por ejemplo, el paladar. Por lo que ambos parámetros están
relacionados.

La cohesividad y la adhesividad de los yogures presentaron valores y comportamientos

similares. El agregado de partículas y de polifenoles dio como resultado valores más negativos de
ambos parámetros, siendo este efecto más evidente en los yogures con mayor contenido de
polifenoles (0,05 y 0,1) e incorporados en partículas proteicas (Figura 3-10). Najgebauer-Lejko et
al. (2014) incorporaron té verde en yogures y reportaron un aumento significativo de los valores de
cohesividad en los yogures suplementados comparados con el control y atribuyeron este efecto a la
existencia de interacciones entre las proteínas de la leche y los polifenoles del té ya que este
parámetro está relacionado con la fuerza de los enlaces internos de los alimentos.

87
 Figuras 3-10. Valores de cohesividad (A) y adhesividad (B) para cada formulación a los 7 y 21 días. Los
asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en una misma formulación durante
el almacenamiento. Letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
entre mediciones realizadas el día 7. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) entre mediciones realizadas el día 21.

88
 Comportamiento viscoelástico

La reología es la ciencia que se ocupa del estudio de la deformación y el flujo de materia.

Las propiedades reológicas de los alimentos son importantes para el procesamiento, el control de
calidad, el almacenamiento y para la predicción de la textura (Shaker et al., 2000).

Los alimentos generalmente no son ni completamente líquidos ni completamente sólidos,

sino que se caracterizan por presentar una combinación del comportamiento viscoso (líquido) y
elástico (sólido). Cuando el alimento es sometido a un esfuerzo, su componente elástico es capaz
de absorber la energía aplicada, transformándola durante la deformación, en energía potencial, de
forma que cuando ésta cesa, la deformación vuelve a su estado inicial. Mientras que el componente
viscoso absorbe la energía aplicada transformándola en calor y fluyendo (Rojas, Briceño &
Avendaño, 2012).

Los ensayos oscilatorios están ampliamente aceptados para la evaluación de las

características reológicas del yogur (Ozer, Robinson, Grandison & Bell, 1997; Sendra, Kuri,
Fernández-López, Sayas-Barberá, Navarro & Pérez-Alvarez, 2010), el cual es un típico ejemplo de
gel viscoelástico débil (Rohm & Kovac, 1994). En un producto gelificado, el módulo elástico
debería predominar por sobre el viscoso (Robinson et al., 2007), por lo cual éste se constituye en
un parámetro para el control de calidad. Para caracterizar este parámetro se realizaron barridos de
frecuencia entre 0,1 y 10 Hz para todas las formulaciones.

La Figura 3-11 muestra, a modo de ejemplo, la dependencia de G’ y G’’ con la frecuencia

de algunos de los yogures, para las formulaciones a los días 7 y 21 de almacenamiento. Se observa
que no existe cruce de los módulos G’ y G’’ en todo el rango de frecuencia estudiados,
evidenciando la existencia de un gel verdadero. Todas las formulaciones exhibieron propiedades
viscoelásticas usualmente observadas para geles débiles: predominancia de la respuesta elástica
(G’) sobre la viscosa (G’’) y poca dependencia de ambos módulos con la frecuencia, lo que
concuerda con estudios realizados por otros autores (Bayarri, González-Tomás & Costell, 2009;
Sendra et al., 2010).

89
Figura 3-11. Barridos de frecuencia a los 7 y 21 días de almacenamiento. Temperatura: 10 °C. Datos
expresados como promedio ± desviación estándar de mediciones repetidas.

90
 A continuación, en la Figura 3-12 se muestran a modo comparativo, los valores de G’
medidos a 1 Hz.

Figura 3-12. Valores promedio de G’ tomados a 1 Hz para cada formulación a los 7 y 21 días de
almacenamiento. Temperatura: 10 °C. Los asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas
(p<0,05) en una misma formulación durante el almacenamiento. Letras minúsculas diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre mediciones realizadas el día 7. Letras mayúsculas
diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre mediciones realizadas el día 21.

A partir del gráfico, es posible observar que el tiempo de almacenamiento provocó un

aumento de los valores de G’ con el tiempo, aunque dicho cambio sólo fue significativo para
algunas formulaciones, sin mostrar una tendencia relacionada a la presencia de partículas o a la
concentración de polifenoles.

El agregado de partículas proteicas generó un aumento significativo de G’ respecto al yogur

0 sp. Este efecto fue significativo a los 21 días de almacenamiento y está relacionado con el
aumento observado en la firmeza de estos yogures (Figura 3-9), que fue atribuido a la posible
contribución de la presencia de las partículas proteicas en fortalecer la estructura de los yogures. El
mayor valor de G’ del yogur 0,1 sp con respecto a 0 sp, siendo que ninguna de las dos
formulaciones contiene partículas proteicas, podría explicarse por el efecto ya mencionado que
tienen los polifenoles de interactuar con las proteínas lácteas. No se observaron diferencias
significativas por la presencia de diferentes concentraciones de polifenol, ya sea con o sin

91
 partículas.

El valor de G’ de un material elástico es independiente de la frecuencia. Sin embargo, los

geles alimentarios tienen, aunque pequeña, cierta contribución de la componente viscosa (G’’) lo
que resulta en valores de G’ dependientes de la frecuencia reflejando la relajación de estos
componentes (Clark & Ross-Murphy, 1987). Así, la dependencia de G’ con la frecuencia es un
parámetro característico del tipo de gel. Como se puede ver en la Figura 3-11 el valor de G’,
aunque levemente, aumentó con el incremento de la frecuencia.

Como se mención en el apartado de Materiales y Métodos, la dependencia del módulo

elástico con la frecuencia da información sobre el tipo de estructura que presenta el gel (Stading &
Hermansson, 1992), puede ser expresado por medio de la constante n (Ecuación 2-8 de Materiales
y Métodos). El valor de n se considera un indicador de la naturaleza viscoelástica de los geles: este
valor es cero en geles puramente elásticos y aumenta su valor con el incremento de la contribución
de la componente viscosa (menos elástico) (Ikeda & Foegeding, 1999).

En la Tabla 3-2 se muestran los valores de n para las distintas formulaciones. Se indican
también los coeficientes de correlación (R2), los cuales surgen del cálculo de n por regresión lineal.
Los valores de n se mantuvieron en valores entre 0,15 y 0,17, mostrando una tendencia a aumentar
con el agregado de partículas proteicas y el aumento de la concentración de polifenol. Sin embargo,
comparando los valores con el yogur 0 sp, dicho aumento fue significativo sólo para la formulación
con polifenol sin partículas, indicando una dependencia levemente mayor del valor de G’ con la
frecuencia en este yogur. En esta misma formulación también se observó una disminución
significativa del n durante el almacenamiento.

Tabla 3-2 Valores de n obtenidos a 10 ºC para las distintas formulaciones.

7 días 21 días
2
Formulaciones N R n R2
0 sp 0,156 ± 0,001 ab (0,9997) 0,151 ± 0,011 a (0,9998)
0 0,156 ± 0,001 ab (0,9998) 0,154 ± 0,002 a (0,9997)
0,025 0,157 ± 0,005 ab (0,9999) 0,156 ± 0,004 ab (0,9982)
0,05 0,162 ± 0,003 bc (0,9998) 0,155 ± 0,004 ab (0,9999)
0,1 0,161 ± 0,003 b (1,0000) 0,159 ± 0,002 ab (0,9998)
0,1 sp 0,169 ± 0,002 c (0,9989) 0,161 ± 0,001 *b (0,9998)

Promedio ± desvío estándar de triplicados. Los asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) en una misma formulación durante el almacenamiento Letras minúsculas diferentes en
una misma columna indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).

92
 A pesar de las sutiles diferencias observadas en el valor de n entre formulaciones y en el
tiempo de almacenamiento, los valores obtenidos se encuentran en el rango de los reportados por
otros autores para este tipo de yogur (McCann et al., 2011; Peng et al., 2009; Yonaha, Martinez,
Allievi, Coluccio Leskow & Perez, 2018).

Microestructura

Los alimentos son materiales complejos cuyas características y propiedades deseadas

dependen frecuentemente de su microestructura, esto es, del arreglo espacial de los elementos
estructurales a niveles micro y submicroscópicos. La microestructura determina, entre otros, la
apariencia, la percepción del gusto, la reología y la vida útil, y forma el puente entre las
propiedades moleculares de los componentes individuales y las propiedades macroscópicas
deseadas del producto (Blonk & Van Aalst, 1993).

Desde el punto de vista microestructural los geles se pueden clasificar en geles formados por
una red de filamentos finos y geles agregados o particulados (Pilosof, 2000). Los geles de
filamentos finos están formados por una asociación ordenada de moléculas de proteína y el grosor
de los filamentos es muy pequeño de tal forma que estos geles son transparentes. Mientras que los
geles particulados se forman a partir de una agregación desordenada, son opacos y tienen menor
capacidad de retención de agua (Stading et al., 1992).

La Figura 3-13 muestra la micoestructura de los diferentes yogures a los 7 días de

almacenamiento donde se evidencia la existencia de una densa red compuesta de agregados
proteicos y de grasa como fue reportado por otros autores que también estudiaron geles lácteos,
pero acidificados con glucono δ lactona (Lucey, Tamehana, Singh & Munro, 1998).

93
 Figuras 3-13. Microestructura de los yogures transcurridos 7 días de almacenamiento (aumento 200x).

La incorporación de partículas proteicas en las formulaciones genera un gel en el que se

pierde la homogeneidad, comparado con el yogur 0 sp, observándose una estructura más abierta
donde se distinguen agregados proteicos más grandes. Esta diferencia puede observarse
comparando las formulaciones que contienen partículas con las que no contienen. De igual manera,
Vasbinder, van de Velde & de Kruif (2004) estudiaron la microestructura de geles de proteína de
suero y caseína mediante microscopia confocal y observaron estructuras heterogéneas y poros más
grandes en aquellos geles con una mayor concentración de proteína de suero. Como se mencionó
en la Introducción, el calentamiento de la leche induce el despliegue de las proteínas del suero de la
leche, la agregación y por lo tanto la formación de complejos con κ-caseína a través de
interacciones hidrofóbicas y enlaces disulfuro que juegan un papel clave en la estructura del yogur
(Famelart, Tomazewski, Piot & Pezennec, 2003; Guyomarc'h, Jemin, Le Tilly, Madec & Famelart,
2009). En el caso de las formulaciones con partículas proteicas, además de las proteínas del suero
propias de la leche, hay un aumento en su contenido por el agregado de las partículas proteicas, lo
que explica la formación de agregados más grandes, y una red más heterogénea. Otros estudios
mostraron que el efecto del calentamiento en la microestructura del yogur fue más pronunciado
cuando la base de leche se enriqueció con WPC.

En cuanto a la presencia de polifenoles, comparando entre las formulaciones 0 sp y 0,1 sp,

94
no se observaron tantas diferencias como en presencia de partículas; sin embargo, el yogur 0,1 sp
parece presentar una estructura más agregada. Como se mencionó previamente, se conoce que los
polifenoles tienen una afinidad significativa por las proteínas, estos compuestos pueden combinarse
para formar complejos solubles, que pueden crecer al tamaño coloidal e incluso sedimentar. La
formación de estos complejos proteína-polifenol está profundamente influenciada por la naturaleza
de la proteína, la naturaleza del polifenol, la temperatura del sistema y la presencia de otros
componentes que pueden competir en la interacción (von Staszewski, 2011).

El mayor grado de agregación/asociación de la red proteica observado en la microestructura

de los yogures con partículas proteicas en comparación con el yogur 0,1 sp, podría explicar los
valores levemente mayores de WHC (Figura 3-8) y de los parámetros texturales (Figura 3-9 y 3-
10) que presentaron las formulaciones con partículas.

Viabilidad de bacterias ácido lácticas (BAL)

El flavour del yogur depende de la producción de compuestos aromáticos durante la

fermentación. El cultivo iniciador o “starter” (en particular, L. bulgaricus) es responsable de la
producción de estos compuestos, mayoritariamente acetaldehído (Robinson et al., 2007). Además,
el número de microorganismos viables es un factor crucial en el producto final en términos de
acidificación y beneficios nutricionales atribuidos a los cultivos starter como probióticos (Robinson
et al., 2007; Zare et al., 2011). Se considera que los cultivos lácticos del yogur, vivos y activos, son
beneficiosos para la salud humana (Shah, 2000). Por esta razón, los cultivos deben permanecer
viables por encima del nivel requerido (107 UFC/mL) y llegar activos al final del almacenamiento
(Chandan & O’Rell, 2006; Najgebauer-Lejko et al., 2011). Hay muchos factores que afectan el
número y la composición de la microflora del yogur, los más importantes son el tipo y la cantidad
de inóculo aplicado, la incubación y el tiempo de almacenamiento, la presencia de microflora
indeseable y sus enzimas y la disponibilidad de nutrientes en el medio. Además, el interés en el
estudio de la viabilidad de las BAL en estos yogures reside en la conocida actividad antimicrobiana
de los polifenoles (Daglia, 2012; von Staszewski, 2011), por lo que se requiere determinar si dicha
viabilidad es afectada por la presencia de polifenoles, en comparación a los controles sin polifenol
(0 sp y 0) y también durante en almacenamiento.

En la Tabla 3-3 se informa el logaritmo de UFC/mL para las dos bacterias ácido lácticas
utilizadas en la elaboración de los yogures, a tiempo 0 y a los 7 y 21 días de almacenamiento a 4
°C. En primer lugar, cabe mencionar que nuestros resultados concuerdan con la bibliografía, en la
cual se sugiere que al emplearse la técnica de recuento en placa, el recuento de ambas bacterias

95
debe ser de aproximadamente 106 – 108 UFC/mL en el producto final (Robinson et al., 2007).

Tabla 3-3. Recuento de BAL durante el almacenamiento de los yogures. Valores informados como Log
(UCF/mL).
Streptococos (Log UFC/mL)
Tiempo de almacenamiento (días)
0 7 21
0 sp 8,24 ± 0,01 d A 8,71 ± 0,01 ab B 9,09 ± 0,07 ab C
Formulaciones

0 7,85 ± 0,04 bc A 8,96 ± 0,01 cd A 8,97 ± 0,63 a A

0,025 7,92 ± 0,01 c A 8,85 ± 0,12 bc B 8,83 ± 0,02 ab B
0,05 7,65 ± 0,06 a A 9,12 ± 0,05 d B 9,07 ± 0,03 ab B
0,1 7,83 ± 0,02 b A 8,65 ± 0,08 a B 9,22 ± 0,01 b C
0,1 sp 7,83 ± 0,02 b A 8,88 ± 0,07 c B 9,12 ± 0,01 b C

Lactobacillus (Log UFC/mL)

Tiempo de almacenamiento (días)
0 7 21
0 sp 5,71 ± 0,01 c A 6,18 ± 0,01 c B 6,46 ± 0,03 e C
Formulaciones

0 5,36 ± 0,13 b A 6,14 ± 0,02 c C 5,70 ± 0,04 b B

0,025 4,97 ± 0,01 a A 5,87 ± 0,05 b B 6,07 ± 0,06 d C
0,05 5,80 ± 0,04 c C 5,26 ± 0,03 a B 4,88 ± 0,04 a A
0,1 5,09 ± 0,06 a A 6,20 ± 0,03 cd C 5,96 ± 0,01 c B
0,1 sp 5,09 ± 0,06 a A 6,25 ± 0,01 d C 6,03 ± 0,01 cd B

Promedio ± desvío estándar de duplicados. Letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) entre las formulaciones para mediciones realizadas a un mismo tiempo de
elaboración. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
durante el almacenamiento.

En particular, el recuento de Streptococcus en nuestros yogures fluctuó en el rango de 107 y

109 UFC/mL El número de Streptococcus aumentó notablemente durante la primer semana de
almacenamiento y luego se observó una estabilización o leve aumento. Este comportamiento podría
ser el resultado de la leve acidificacion que continúa durante el almacenamiento. El crecimiento y
el metabolismo de S. thermophilus es generalmente inhibido alrededor de un pH de 4,3 a 4,5
(Robinson, 2002), valores que la mayoría de los yogures alcanzaron después de las primeras
semanas de almacenamiento en frío (Figura 3-4). Por otro lado, el recuento de estas bacterias no
fue fuertemente afectado por la composición de los yogures (presencia de partículas y/o polifenol),
ya que no se observaron grandes diferencias en el recuento de Streptococcus entre las distintas
formulaciones.

El número de L. delbrueckii subsp bulgaricus fluctuó en un rango de 105 y 106 UFC/mL

96
durante el almacenamiento para todas las formulaciones. Se observó un aumento significativo en la
primera semana, a excepción de la formulación 0,05. Luego se observaron aumentos o
disminuciones en la viabilidad indistintamente de las características de la formulación. Tampoco se
observaron diferencias importantes entre las diferentes formulaciones para esta BAL. Se ha
reportado que la presencia de polifenoles en yogures adicionados con extracto de propóleo
(Kalogeropoulos, Konteles, Troullidou, Mourtzinos & Karathanos, 2009) y con extractos de
semillas de uvas (Chouchouli et al., 2013) presentaron muy poca o casi ninguna actividad
inhibitoria frente a las cepas de Lactobacillus.

Aunque la proporción esperada de ambas bacterias en un cultivo starter es 1:1, raramente se

obtiene esa proporción (Robinson, (2002), las especies del género Lactobacillus poseen numerosos
requerimientos nutricionales para su crecimiento como diversos ácidos grasos, minerales, péptidos,
derivados de ácidos nucleicos y vitaminas del grupo B, por lo que es esperable que el crecimiento
de esta especie sea menor en comparación con el crecimiento del estreptococo (Tamime et al.,
2007). De todas maneras, vale aclarar que el recuento del día 0 de Lactobacillus fue inferior en dos
ciclos logarítmicos respecto a Streptococcus, y dicha diferencia se mantuvo a lo largo del
almacenamiento.

Los resultados indican que la presencia de polifenol en distintas concentraciones no afecta el

crecimiento ni la viabilidad de las BAL, aún siendo conocidos como agentes antimicrobianos, los
cuales inhiben el crecimiento de bacterias patógenas y hongos (O’Connell et al., 2001; von
Staszewski, Pilosof & Jagus, 2011). Por otro lado, en un estudio reciente (Granato, Santos, Salem,
Mortazavian, Rocha & Cruz, 2018) se ha reportado que la adición de extractos de té verde puede
mejorar la viabilidad de bacterias probióticas. Sin embargo, los aumentos en el recuento de BAL
observados en la Tabla 3-3 no pueden ser atribuidos a la presencia de polifenoles, ya que también
fue observado en las formulaciones sin polifenol.

Polifenoles Totales
Para la cuantificación de polifenoles totales se utilizó el método espectrofotométrico Folin
Ciocalteu (FC). Sin embargo, es importante tener en cuenta que esta técnica tiende a sobrestimar el
contenido de polifenoles por ser un método inespecífico, dado que muchos otros componentes
presentes en la solución a medir pueden reaccionar (Ainsworth & Gillespie, 2007; Najgebauer-
Lejko et al., 2011). Por tal motivo, con el fin de comprender la lectura del método y poder contar
con valores más específicos, se midió el contenido de polifenoles totales en distintas soluciones, las
cuales, a su vez, contenían distintas concentraciones de polifenol.

97
 Las soluciones utilizadas fueron:

 Solución de polifenol en agua (que llamaremos sc. polifenol)

 Solución de partículas proteicas (con polifenol) en agua (que llamaremos sc.

partículas proteicas)

 Formulaciones de yogur elaboradas en el presente trabajo (que llamaremos yogures)

En todos los casos se hicieron mediciones para las siguientes concentraciones de polifenol:
0; 0,025; 0,05 y 0,1 %. En el caso particular de los yogures, se realizó además la medición de 0,1 %
de polifenol sin partículas proteicas (formulación 0,1 sp). Todas las mediciones se realizaron sobre
las muestras a los 21 días de almacenamiento.

En las determinaciones del contenido fenólico de las soluciones de partículas proteicas y de

yogur, sin presencia de polifenol, no se esperaba obtener ningún valor; sin embargo, se determinó
cierto contenido que puede ser atribuido a la presencia de otras sustancias como proteínas lácteas o
compuestos reductores que responden a la medición fenólica. En el caso de los yogures, también
puede haber presencia de polifenoles en la leche, la mayoría de los cuales deriva de la alimentación
del animal (Besle et al., 2010; Lopez & Lindsay, 1993). Por tal razón, a fin de eliminar la
sobrestimación dada por los otros componentes presentes en las muestras, los valores obtenidos
para las soluciones de partículas proteicas y para los yogures con 0 % polifenol se restaron al resto
de las concentraciones de igual solución, según la siguiente fórmula:

Miliequivalentes de AG sc i, [ ]j = Miliequivalentes de AG i,j – Miliequivalentes de AG i,0

Los resultados se muestran en la Figura 3-14. El contenido fenólico cuantificado en las

soluciones de polifenol (barras blancas), aumentó de manera significativa, al aumentar la
concentración de polifenol de las soluciones. Cuando el polifenol fue incorporado en partículas
proteicas (en las soluciones y en el yogur) y cuando fue incorporado directamente al yogur (yogur
0,1 sp), se determinó un menor contenido de polifenoles totales, siendo menor aún para los
yogures.

Estos resultados indican que la encapsulación del polifenol provoca una menor lectura de
polifenoles totales y que dicho efecto es más pronunciado conforme se complejiza la matriz. La
interacción de los polifenoles con las proteínas podría explicar esta disminución en la lectura por
tener los grupos reactivos involucrados en dicha interacción (Chouchouli et al., 2013).

No se observaron diferencias significativas entre los yogures 0,1 y 0,1 sp debido a la

encapsulación con las partículas proteicas, lo que puede deberse a la ya mencionada afinidad de los
polifenoles con las proteínas (Chanphai, Bourassa, Kanakis, Tarantilis, Polissiou & Tajmir-Riahi,

98
2018; Papadopoulou, Green & Frazier, 2005; Yildirim-Elikoglu, 2018). A diferencia de la adición
directa de polifenol en el yogur (formulación 0,1 sp), en los yogures con partículas proteicas y
polifenol, el polifenol se une a las proteínas previo a ser incorporado al yogur; sin embargo, los
resultados indican que los polifenoles incorporados de manera directa interactúan también
eficientemente con las proteínas de la matriz láctea. Las interacciones de los polifenoles con las
proteínas tienen lugar particularmente con proteínas ricas en prolina tales como caseínas (Chanphai
et al., 2018).

Figura 3-14. Contenido de polifenoles totales. Letras minúsculas indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) entre las soluciones de polifenol. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas (p<0,05) entre las soluciones de partículas proteicas. Letras griegas diferentes
indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre los yogures.

Actividad Antioxidante

La actividad antioxidante y su relación con las propiedades curativas de una gran cantidad de
plantas medicinales ha sido reportada en diversas investigaciones (Lorenzo & Munekata, 2016;
Marquardt & Watson, 2014; Seifried, Harrison, Seifried, Boushey, Ferruzzi & Delahanty, 2017).
Muchos antioxidantes naturales, en especial los flavonoides, muestran un amplio rango de efectos
biológicos, entre los que se incluyen efectos antibacteriales, antivirales, antiinflamatorios,

99
antialergénicos, antitrombóticos y vasodilatadores.

El principal objetivo de la incorporacion de polifenoles en el yogur es el de lograr

incorporar, mediante el consumo de dicho alimento, las propiedades benéficas que éstos aportan.
Los polifenoles, presentes en el té en grandes cantidades, se conocen como potentes antioxidantes
naturales (Zhang, Suen, Yang & Quek, 2018). Por ello, es que resulta de importancia el análisis de
la actividad antioxidante en el producto final.

La capacidad neutralizante del radical DPPH· se muestra en la Tabla 3-4, para las diferentes
formulaciones.

Tabla 3-4. Actividad antioxidante durante el almacenamiento de los yogures. Valores informados como %.

Actividad Antioxidante (%)

Tiempo de almacenamiento (días)
0 7 21
0 sp 21 ±1 ab A 17 ± 3 a A 21 ±6 b A
Formulaciones

0 21 ±1 ab B 12 ± 3 a A 10 ±2 a A
0,025 20 ±7 a A 12 ± 4 a A 14 ±3 ab A
0,05 26 ±2 bc B 37 ± 4 b C 16 ±2 ab A
0,1 31 ±4 c A 53 ± 3 c B 36 ±1 c A
0,1 sp 52 ±1 d A 60 ± 1 c B 45 ±7 d A

Promedio ± desvío estándar de triplicados. Letras minúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (p<0,05) entre las formulaciones para mediciones realizadas a un mismo tiempo de
elaboración. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)
durante el almacenamiento.

El tiempo de almacenamiento afectó la actividad antioxidante principalmente en las

formulaciones con mayor contenido de polifenol yogures (0,05; 0,1 y 0,1 sp). Del día 0 al día 7 se
observó un aumento significativo de la actividad antioxidante de dichos yogures, lo cual puede
deberse a distintos factores:

i. por un lado, el pH desciende levemente durante el almacenamiento y, debido a que

los polifenoles son más estables a pH ácido pueden ejercer mejor su actividad
antioxidante;

ii. por otro lado, se sabe que las proteínas son los macronutrientes más efectivos en
reducir la capacidad antioxidante debido a las uniones e interacciones que generan
con los polifenoles (Arts, Haenen, Voss & Bast, 2001). Durante el almacenamiento
continúan ocurriendo reacciones de proteólisis por parte de los microorganismos y
de esta manera, una parte de los polifenoles pueden ser liberados o los grupos

100
 fenólicos que intervienen en la actividad antioxidante, pueden no encontrarse tan
comprometidos en la unión a las proteínas, aumentando así su lectura.

Otros estudios sugieren que el aumento que se observa en algunas formulaciones puede estar
relacionado con la solubilización de sustancias reductoras en la leche fermentada (Ramos, Santos,
Daguer, Valese, Cruz & Granato, 2017). A diferencia del comportamiento observado en nuestros
resultados, Karaaslan, Ozden, Vardin y Turkoglu (2011) reportaron una disminución continua de la
actividad antioxidante desde el día 1 de almacenamiento de yogures fortificados con extractos
polifenólicos de uva. En relación a esto, Wallace & Giusti (2008) también reportaron la
disminución de epicatequina, fenoles totales y actividad reductora de radicales libres, durante el
almacenamiento y fue atribuido a la degradación de estos componentes. La disminución final de la
lectura de la actividad antioxidante de nuestros yogures en el día 21 de almacenamiento Tabla 3-4
podría deberse a la degradación mencionada por estos autores.

Al comparar entre formulaciones, se puede observar que la actividad antioxidante aumentó

con el mayor contenido de polifenol, siendo dicho aumento significativo a partir de la formulación
con 0,05 % de polifenol. Teniendo en cuenta la inespecificidad del ensayo de FC, se encontró
buena correlación en la tendencia observada entre los polifenoles totales y las propiedades
antioxidantes. Los polifenoles no son los únicos componentes que reaccionan frente al radical
DPPH·, lo que puede ser observado en los valores de actividad antioxidante de las formulaciones 0
sp, 0 y 0,025 que no mostraron diferencias significativas entre ellas, incluso cuando las dos
primeras no contienen polifenol. Estos resultados pueden deberse a que, entre los componentes de
la leche, se encuentra el ácido úrico, el ascorbato, el α-tocoferol y la bilirrubina que pueden
presentar actividad antioxidante. También puede notarse, comparando los yogures 0,1 con y sin
partículas, que cuando el polifenol fue incluido en las partículas proteicas se obtuvo una menor
actividad antioxidante que cuando se agregó solo. Esto concuerda con estudios realizados por von
Staszewski, Jagus & Pilosof (2011) en los que se reportó que la interacción entre proteína-polifenol
influye desfavorablemente en la lectura de la actividad antioxidante de los polifenoles. La unión de
los polifenoles con las proteínas puede afectar la actividad antioxidante de los polifenoles mediante
la reducción del número de grupos hidroxilo libres o también porque las interacciones entre
polifenoles y proteínas pueden llevar a la precipitación de los complejos y, por lo tanto, restringir la
interacción mediante difusión de los polifenoles unidos y los oxidantes libres en solución (Arts et
al., 2001; Arts et al., 2002; Dubeau, Samson & Tajmir-Riahi, 2010). Resultados similares fueron
encontrados por Arts et al. (2002), quienes además indicaron que el grado de enmascaramiento de
la actividad antioxidante depende de la composición de los polifenoles, así como del tipo de
proteína de la leche con la que se asocie. Esta menor lectura en el yogur 0,1 con partículas

101
proteicas, respecto al 0,1 sp sugeriría que las interacciones proteína-polifenol en el primero podrían
ser más fuertes o más eficientes en proteger la actividad antioxidante del polifenol.

Digestión gastroduodenal in vitro de los yogures

La digestión es un proceso fisiológico que permite la liberación de nutrientes y no nutrientes

(por ejemplo, polifenoles) de la matriz de alimentos. En humanos, el proceso digestivo comienza
en la boca donde la degradación inicial de polisacáridos y triglicéridos se lleva a cabo debido a la
masticación y la acción de las enzimas salivales (α-amilasa y lipasa). Luego, el bolo se somete a
digestión gastrointestinal, donde las enzimas digestivas del estómago y del intestino delgado, y las
bacterias colónicas fermentativas del intestino grueso, son decisivas para hacer que los nutrientes y
los compuestos bioactivos estén disponibles para la absorción a través de la pared intestinal
(Hinsberger & Sandhu, 2004; Pedersen, Bardow, Jensen & Nauntofte, 2002). Estas condiciones
fisiológicas pueden dar lugar a cambios estructurales que afectan la estabilidad, bioaccesibilidad,
biodisponibilidad y bioactividad de los componentes alimentarios (Cilla, González-Sarrías, Tomás-
Barberán, Espín & Barberá, 2009).

Para lograr un efecto específico, los polifenoles deben estar bioaccesibles. En este sentido, el
término bioaccesibilidad se ha definido como la fracción de un compuesto que se libera de la
matriz de los alimentos en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, se vuelve disponible para la
absorción intestinal (Tagliazucchi, Helal, Verzelloni & Conte, 2016).

Estudios previos han demostrado que se producen cambios significativos en las catequinas
del té verde como resultado de cambios en el pH similar a los encontrados en el tracto
gastrointestinal. Para evaluar dicho efecto se analizaron las formulaciones 0,1 y 0,1 sp a los 21 días
de almacenamiento, a las que luego de someterlas a una digestión in vitro, se les determinó los
polifenoles totales y la actividad antioxidante, con el objetivo de evaluar el efecto del tipo de
adición de polifenoles al yogur sobre dichos parámetros.

En la Figura 3-15 se muestran los resultados obtenidos para la determinación de polifenoles

totales, pre y post digestión in vitro donde se observa un valor significativamente mayor para los
yogures evaluados luego de la digestión gastrointestinal; confirmando que en el yogur los
polifenoles se encuentran incluidos de tal manera que no es posible su cuantificación total.

102
 Figura 3-15. Polifenoles totales pre y post proceso de digestión. Letras diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas (p<0,05) entre mediciones.

A medida que avanza la digestión, las proteínas lácteas se hidrolizan y los polifenoles se
pueden liberar de las proteínas dando como resultado una mayor bioaccesibilidad (Helal &
Tagliazucchi, 2018). Se ha reportado que la presencia de matrices lácteas mejora
significativamente la recuperación de los polifenoles totales durante la digestión, gracias al efecto
protector por la interacción entre polifenoles y las proteínas de la leche (Green, Murphy, Schulz,
Watkins & Ferruzzi, 2007).

No se observaron diferencias significativas entre los yogures digeridos con y sin partículas,
indicando que la encapsulación no produjo un efecto protector adicional y/o que la inclusión en la
matriz láctea, de por sí, ya protege a los polifenoles, liberándolos de igual manera luego de la
digestión ya sea en presencia o ausencia de las partículas proteicas.

En la Figura 3-16 podemos observar los resultados obtenidos para la determinación de la

actividad antioxidante, pre y post digestión in vitro. Como se discutió en la los resultados de la
Tabla 3-4, previo a la digestión hay una diferencia significativa entre las formulaciones con y sin
partículas, percibiéndose una mayor actividad antioxidante para la formulación en la que el
polifenol no se encuentra encapsulado. Luego de someter las muestras al proceso de digestión, se
puede ver una diferencia significativa entre pre y post digestión para 0,1, lo cual puede ser el
resultado de la liberación del polifenol de la unión con las proteínas. Sin embargo, esta diferencia

103
no fue significativa en la formulación 0,1 sp, lo que indicaría que en este caso sí parece existir una
diferencia entre el polifenol encapsulado y el libre. De todas formas, como se manifestó
previamente, luego de la digestión, que es cuando resulta de interés evaluar dicho valor, no se
observaron diferencias relativas a la encapsulación, con lo cual a los efectos de su actividad
antioxidante y en un producto como el yogur, sería lo mismo incorporarlos tal cual, debido a que la
matriz láctea ya actuaría como ¨protectora¨ de estas moléculas.

Figura 3-16. Actividad antioxidante pre y post proceso de digestión. Letras diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas (p<0,05).

De todos modos, durante el procesamiento de otro tipo alimentos sin tanta concentración de
proteínas podría tenerse en cuenta la posibilidad de adicionar los polifenoles en partículas proteicas
con el objetivo de aumentar su bioaccesibilidad. Lo importante a destacar es que, luego de la
digestión, los polifenoles se encuentran altamente bioaccesibles y mantienen su actividad
antioxidante.

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111
Conclusiones
 El presente trabajo demostró la factibilidad de fortificar yogures con polifenoles de té
verde sin cambios sustanciales en las características del producto.

Para la fortificación se utilizaron dos métodos: adición directa del polifenol o adición
del polifenol vehiculizado en partículas proteicas WPC-gelatina. Las partículas proteicas con
polifenol fueron diseñadas en condiciones en las cuales se favorece la interacción proteína-
polifenol (en nuestro caso, WPC-polifenol) y también las interacciones proteína-proteína
(WPC-gelatina). Se lograron obtener partículas proteicas con un tamaño tal que no
perjudique la percepción de cremosidad del yogur (tamaños menores a 5 μm).

La adición de polifenoles al yogur (mediante los dos métodos empleados) no alteró la

dinámica del proceso de fermentación mediado por las bacterias ácido lácticas, ni tampoco la
viabilidad de las mismas durante la vida útil del yogur.

Teniendo en cuenta la coloración rojiza propia de los polifenoles, un desafío

importante a la hora de incluirlos en el yogur era el de no afectar el color de este último. En
relación a esto, sólo se observaron diferencias significativas para el parámetro a* (tendencia
al color rojo, cuando se obtienen valores positivos, a verde cuando se obtienen valores
negativos) dando valores más positivos conforme aumentó la concentración de polifenol en
el yogur. Sin embargo, tampoco estos cambios resultaron tan importantes ya que estaban
acotados a un rango de valores de a* muy pequeño y no fueron detectables a simple vista.

Otro aspecto importante a evaluar fueron las propiedades relacionadas a la estructura

del producto gelificado (la capacidad de retención de agua, los parámetros texturales, el
comportamiento viscoelástico y la microestructura). En primer lugar, cabe destacar que la
adición de polifenoles de manera directa, generó un yogur con una estructura más
interconectada que el yogur control, lo que fue atribuido a la capacidad de los polifenoles de
interactuar con las proteínas lácteas. Esta estructura más interconectada podría explicar la
mayor capacidad de retención de agua y los mayores valores de firmeza, adhesividad y
cohesividad observados en este yogur. Por otro lado, la incorporación de partículas proteicas
incrementó más aún estos parámetros. Sin embargo, dicho efecto estaría más relacionado al
mayor (aunque leve) contenido proteico de dichos yogures, y a la capacidad de las proteínas
presentes en las partículas de interactuar con las proteínas de la leche.

Finalmente, más allá del impacto del agregado de polifenol sobre las características
físicas y estructurales del yogur, la mayor motivación a la hora de fortificar este producto
con este componente fue su alta capacidad antioxidante.

En relación a esto, la capacidad antioxidante de los polifenoles en el yogur durante el

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almacenamiento, no se vió afectada por el modo de adición. Pero sin duda el resultado más
relevante, es que estos compuestos bioactivos se encuentran altamente bioaccesibles y
mantienen su actividad antioxidante luego de la digestión gastroduodenal sin mostrar
diferencias entre el agregado de manera directa o vehiculizado en partículas proteicas. Esto
podría explicarse debido a que la matriz láctea ya actuaría como ¨protectora¨ de estas
moléculas.

Por lo tanto, teniendo en cuenta el costo adicional que implicaría el uso de las
partículas proteicas, el método de adición de polifenol encapsulado no sería necesario en el
caso de un producto como el yogur y sólo se justificaría en un alimento con menor contenido
proteico.

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