UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

Nº 1 PRÁCTICA
“ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S”

CURSO:
BIOTECNOLOGIA

DOCENTE:
Dr. Hebert H. Soto Gonzales

ESTUDIANTES:
Juan Carlos Bustinza Coila

ILO – PERU
2021
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

I. INTRODUCCION

La secuenciación de ADN es el proceso de la determinación de una secuencia de nucleótidos de

ciertas moléculas de ADN - desde un segmento corto de una sola molécula, tal como una región
reguladora o un gen, hasta colecciones de genomas enteros. Es una técnica utilizada para
determinar la secuencia exacta de las bases (A, C, G y T) en una molécula de ADN. La secuencia
de bases de ADN lleva la información que una célula necesita para ensamblar proteínas y
moléculas de ARN. La información de la secuencia de ADN es importante para los científicos
que investigan las funciones de los genes. En la década de 1970, las primeras secuencias de ADN
se obtuvieron a través de técnicas extremadamente laboriosas. Un ejemplo es la secuenciación de
un par de docenas de bases del lac operator (Gilbert y Maxam, 1973). La primera revolución en
el campo de la secuenciación del ADN se llevó a cabo en la segunda mitad de la década de 1970
con métodos diseñados por Allan Maxam y Walter Gilbert (Maxam y Gilbert, 1977) así como por
Frederick Sanger y colaboradores (Sanger, 1977). Ambas técnicas incrementaron en gran medida
el rendimiento de la secuenciación del ADN. El método de Maxam Gilbert y colaboradores, sin
embargo, era más complejo e implicó el uso de productos químicos riesgosos. El método de
Sanger, por otra parte, ofrece una mayor eficiencia global después de una serie de optimizaciones,
en particular por la sustitución de material radioactivo para teñir los nucleótidos por el uso de la
electroforesis capilar en lugar de geles. Esta técnica dominó la secuenciación de ADN en las
siguientes décadas y condujo a la determinación de una secuencia de referencia del genoma
humano completo al comenzar el nuevo milenio (El Genoma Humano Consorcio Internacional
de Secuenciación 2001; Venter, 2001).

Bioedit es un programa gratuito para edición de alineamientos y análisis de secuencias que

funciona únicamente sobre ambiente MS/Windows. Es, sin lugar a duda, uno de los programas
más conocidos para edición de secuencias para dicho sistema operativo. BioEdit cuenta con varias
herramientas que van desde la creación de alineamientos hasta la anotación de plásmidos. En esta
oportunidad utilizaremos este programa para manipular parcialmente nuestro alineamiento recién
creado.

Sin embargo poder realizar un análisis de las secuencias de ADN, necesitamos de diversas
herramientas o programas como el BioEdit, este programa es gratuito y el más conocido, que nos
sirve para la edición de alineamiento y análisis de secuencia. BioEdit cuenta con varias
herramientas que van desde la creación de alineamientos hasta la anotación de plásmidos.
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

Utilizaremos este programa para manipular parcialmente el alineamiento de las secuencias a

revisar en este trabajo y poder observar la calidad de las mismas.

El Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) es parte de la Biblioteca Nacional

de Medicina de Estados Unidos, una rama de los Institutos Nacionales de Salud. El cual Almacena
y constantemente actualiza la información referente a secuencias genómicas en GenBank, un
índice de artículos científicos referentes a biomedicina, biotecnología, bioquímica, genética y
genómica en PubMed, una recopilación de enfermedades genéticas humanas en OMIM, además
de otros datos biotecnológicos de relevancia en diversas bases de datos.

Dentro de sus aplicaciones encontramos el BLAST, el cual usa una matriz de sustitución de
aminoácidos o nucleótidos para calificar sus alineamientos. Dicha matriz contiene la puntuación
(score), que se le da al alinear un nucleótido o un aminoácido. El cual es muy útil para poder
alcanzar nuestros objetivos de conocer la calidad de las secuencias estudiadas.
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

II. OBJETIVOS

 Revisar los fundamentos de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos.

 Efectuar el análisis y la selección de electroferogramas automatizados de secuenciación

mediante la aplicación de software libre BIOEDIT en específico el estudio del gen
ribosomal 16S.
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

III. MARCO TEORICO

3.1. BIO-EDIT

Bioedit es un programa gratuito para edición de alineamientos y análisis de

secuencias que funciona únicamente sobre ambiente MS/Windows. Es, sin lugar a
duda, uno de los programas más conocidos para edición de secuencias para dicho
sistema operativo.
BioEdit cuenta con varias herramientas que van desde la creación de alineamientos
hasta la anotación de plásmidos.

3.2. NCBI (National Center For Biotechnology Information)

El Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) es parte de

la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos, una rama de los Institutos
Nacionales de Salud. Está localizado en Bethesda (Maryland) y fue fundado el 4 de
noviembre de 1988 con la misión de ser una importante fuente de información
de biología molecular. Almacena y constantemente actualiza la información referente
a secuencias genómicas en GenBank, un índice de artículos científicos referentes

a biomedicina, biotecnología, bioquímica, genética y genómica en PubMed, una

recopilación de enfermedades genéticas humanas en OMIM, además de otros datos
biotecnológicos de relevancia en diversas bases de datos.

Todas las bases de datos del NCBI están disponibles en línea de manera gratuita, y
son accesibles usando el buscador Entrez.

El NCBI ofrece además algunas herramientas bioinformáticas para el análisis de

secuencias de ADN, ARN y proteínas, siendo BLAST una de las más usadas.

NCBI alberga genoma secuenciado en GenBank, y un índice de los artículos

biomédicos de investigación en PubMed Central y PubMed, así como otra
información relevante a la biotecnología. Todas estas bases de datos son accesibles
en línea con el motor de búsqueda de Entrez.

3.3. ARN Ribosomal GEN 16S

El ARN ribosomal 16S (ARNr 16S o 16S rRNA) es el componente de la subunidad

menor (30S) de los ribosomas procariotas que se une a la secuencia de Shine-
Dalgarno. Los genes que lo codifican son conocidos como genes del ARNr 16S, y
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

se utilizan para la reconstrucción de filogenias debido a sus bajas tasas de evolución.2

Carl Woese y George E. Fox fueron dos de los pioneros que se basaron en las
variaciones del 16S rRNA para establecer filogenias

3.4. METODOLOGIA Y MATERIALES

3.4.1. MATERIALES:
 NCBI
 Word
 BioEdit
 Laptop
 Excel
3.4.2. METODOLOGIA

a. Abrir la secuencia Forward o “F” con ‘BioEdit’ (FILE>OPEN). Se

abrirán dos ventanas, una mostrará el electroferograma y otra la
secuencia. Mantener ambas abiertas, ubicándolas de modo que puedan
verse en simultáneo.
b. El inicio de la lectura suele estar poco definido (“secuencia sucia”) por
lo que es necesario recortarla hasta la posición a partir de la que se
observa una lectura correcta o “confiable”. Este procedimiento se conoce
como “limpiar” la secuencia.
c. Para ello se debe comparar una a una cada base de la secuencia con la
lectura del electroferograma (los picos). Comprobar que coincidan. Las
primeras 30-40 bases en general deben eliminarse. Para ello, modificar
las opciones del menú MODE desplegable dentro de la misma ventana
(seleccionar EDIT).
d. Luego seleccionar la región que será descartada y eliminarla con SUPR).
En ocasiones, puede acontecer que, en regiones de picos claros y
definidos, haya diferencias entre el pico y la base informada o haya un
pico no informado.
e. Cuando el error sea evidente, corregir la secuencia (MODE>EDIT,
prestar atención si deseamos sobre-escribir o insertar, seleccionar
OVERWRITE o INSERT).
f. También podrá eliminarse la región final de la lectura que esté “sucia”.
Guardar la secuencia editada en un nuevo archivo, para conservar el
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

original (FILE>SAVE AS, poner un nombre que indique que

corresponde a la secuencia editada).
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

IV. RESULTADOS

CALIDAD DE LA SECUENCIA TAMAÑO

% DE
CODIGO DE LA ORGANISMO
BUENA MALA REGULAR IDENTIDAD
SECUENCIA
DIVERSOS-_A07_1H_01 x 978 Negativo
DIVERSOS-_A08_9H_02 x 725 Bacteria - Herbaspirillum seropedicae 88.73
DIVERSOS-_A09_1_01 x 280 Bacteria - Pseudomonas putida 83.21
DIVERSOS-_A10_9_02 x 674 Bacteria - Bacteria no cultivada 86.14
DIVERSOS-_A11_17_01 x 1163 Negativo
DIVERSOS-_B07_2H_03 x 629 Bacteria - Stenotrophomonas sp. UYSB32 75.78
DIVERSOS-_B08_10H_04 x 757 Bacteria - Leclercia adecarboxilata 83.45
DIVERSOS-_B09_2_03 x 631 Bacteria - Klebsiella grimontii 82.35
DIVERSOS-_B10_10_04 x 595 Bacteria - Enterobacter soli 71.76
DIVERSOS-_B11_18_03 x 617 Bacteria - Pseudomonas sp. 72.62
DIVERSOS-_C07_3H_05 x 762 Bacteria - Leclercia adecarboxilata 91.9
DIVERSOS-_C08_11H_06 x 644 Bacteria - Enterobacter sp. NA10140 94.29
DIVERSOS-_C09_3_05 x 627 Bacteria - Phytobacter diazotrophicus 86.58
DIVERSOS-_C10_11_06 x 635 Bacteria - Pseudomonas plecoglossicida 69.82
DIVERSOS-_C11_19_05 x 666 Bacteria - Klebsiella aerogenes 65.62
DIVERSOS-_D07_4H_07 x 679 Bacteria - Bacteria no cultivada 90.18
DIVERSOS-_D08_12H_08 x 678 Bacteria - Staphylococcus sp. EE.UU.13 84.27
DIVERSOS-_D09_4_07 x 625 Bacteria - Phytobacter diazotrophicus 89.67
DIVERSOS-_D10_12_08 x 525 Bacteria - Pseudomonas putida 86.26
DIVERSOS-_E07_5H_09 x 926 Negativo
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_E08_13H_10 x 634 Bacteria - Paraburkholderia silvatlantica 79.97

DIVERSOS-_E09_5_09 x 272 Bacteria - Enterobacter ludwigii 88.43
DIVERSOS-_E10_13_10 x 681 Bacteria - Bacteria no cultivada 67.47
DIVERSOS-_F07_6H_11 x 619 Bacteria - Enterobacter ludwigii 95.89
DIVERSOS-_F09_6_11 x 956 Bacteria - Klebsiella sp. 81.75
DIVERSOS-_F10_14_12 x 1204 Negativo
DIVERSOS-_G07_7H_13 x 567 Bacteria - Enterobacter sp. ICBR 189 93.18
DIVERSOS-_G09_7_13 x 935 Bacteria - Enterobacter sp. 73.78
DIVERSOS-_G10_15_14 x 692 Bacteria - Enterobacter asburiae 93.4
DIVERSOS-_H07_8H_15 x 1101 Negativo
DIVERSOS-_H09_8_15 x 1262 Negativo
DIVERSOS-_H10_16_16 x 646 Bacteria - Enterobacter sp. IICDBZ9 84.42
USER_04set2007_01-
x 855 Bacteria - Klebsiella michiganensis 74.54
419NZ_A01_01
USER_04set2007_02- Bacteria - Klebsiella sp. Cultivo de enriquecimiento clon
x 612 88.15
526NZ_B01_03 LY3
USER_04set2007_03-
x 745 Bacteria - Klebsiella sp. MPUS7 97.35
419AZ_C01_05
USER_04set2007_04-88NZ_D01_07 x 796 Bacteria - Klebsiella pneumoniae 94.39
USER_04set2007_05-88AZ_E01_09 x 665 Bacteria - Klebsiella pneumoniae 95.18
USER_04set2007_06-
x 351 Bacteria - Klebsiella pneumoniae 95.91
526Y1_F01_11
USER_04set2007_07-
x 293 Bacteria - Enterobacter sp. WF14-6 98.61
419Y1_G01_13
USER_04set2007_08-375H_H01_15 x 300 Bacteria - Klebsiella oxytoca 73.75
USER_04set2007_09-
x 329 Bacteria - Enterobacter sp. CB7 95.81
419YZ_A02_02
USER_04set2007_10-88H_B02_04 x 345 Bacteria - Endosimbionte de Sphenophorus levis 72.46
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

USER_04set2007_11-
449 Bacteria - Bacteria no cultivada 75.43
375NZ_C02_06
USER_04set2007_12-
x 339 Bacteria - Klebsiella sp. BR3357 95.28
526YZ_D02_08
USER_04set2007_13-
x 687 Bacteria - Enterobacter sp. 88.89
483NZ_E02_10
USER_04set2007_14-483H_F02_12 x 526 Bacteria - Enterobacter hormaechei 88.47
USER_04set2007_15-
x 775 Bacteria - Bacilo turingiensico 91.54
456NZ_G02_14
user_12set2007_01_A03_01 x 680 Bacteria - Kosakonia radicincitans 81.6
user_12set2007_02_B03_03 x 340 Bacteria - Bacteria del suelo no cultivada 71.52
user_12set2007_03_C03_05 x 400 Bacteria - Bacteria Enterobacteriaceae no cultivada 76.92
user_12set2007_04_D03_07 x 567 Bacteria - Kosakonia oryzae 81.93
user_12set2007_05_E03_09 x 921 Bacteria - Klebsiella pneumoniae 85.05
user_12set2007_06_F03_11 x 1347 Negativo
user_12set2007_07_G03_13 x 1185 Negativo
user_12set2007_08_H03_15 x 991 Bacteria - Bacteria no cultivada 72.15
user_12set2007_09_A04_02 x 1163 Negativo
user_12set2007_10_B04_04 x 731 Bacteria - Achromobacter sp. 76.67
user_12set2007_11_C04_06 x 959 Bacteria - Enterobacter cloacae 72.58
user_12set2007_12_D04_08 x 860 Bacteria - Bacteria enterobacteriaceae HGH0104 85.71
user_12set2007_13_E04_10 x 928 Bacteria - Pantoea stewartii 71.86
user_12set2007_14_F04_12 x 977 Bacteria - Pantoea deleyi 75.82
user_12set2007_15_G04_14 x 714 Bacteria - Klebsiella variicola 89.24
user_12set2007_16_H04_16 x 556 Bacteria - Kosakonia sacchari 79.21
usuarios_12set2007_1Y2_F04_12 x 423 Bacteria - Kosakonia radicincitans 79.2
usuarios_12set2007_2Y2_G04_14 x 407 Bacteria - Herbaspirillum sp. 86.75
usuarios_12set2007_3Y2_H04_16 x 413 Bacteria - Klebsiella sp. MB42 79.04
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

usuarios_12set2007_17_A04_02 x 812 Bacteria - Rhizobium lusitanum 71.09

usuarios_12set2007_18_B04_04 x 708 Bacteria - Enterobacter sp. 78.88
usuarios_12set2007_19_C04_06 x 520 Negativo
usuarios_12set2007_20_D04_08 x 608 Bacteria - Klebsiella pneumoniae 73.8
usuarios_12set2007_21_E04_10 x 277 Negativo

Como resultado del análisis de orden de nucleótidos de los diferentes microorganismos, se obtuvo que las 71 muestras son bacterias, sin embargo,
difieren en el tipo de especie (enterobacteria, protobacteria, etc.), resultando la mayoría de las secuencias analizadas una calidad regular (51), y en
menor cantidad las secuencias fueron 9 buenas y 11 malas, tomando como referencia el porcentaje de identidad de cada una de ellas y buscando al
momento de recortar la secuencia, una lectura confiable, guiada por las lecturas electroferogramas. En las secuencias que se obtuvieron resultados,
el BLAST nos muestra diferentes organismos, por lo cual tomamos la de mayor puntuación y porcentaje de identidad, siendo las que se muestran
en el cuadro anterior.

Cabe resaltar que hay casos donde los organismos se repiten y/o son especies no conocidas (como las no cultivadas), en el segundo caso se da
porque son especies nuevas, las cuales recién están registradas en el NCBI y su base de datos es poco conocida.
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

V. CONCLUSIONES

 Los microogranismos que cuentan con secuencias buenas, tienen un porcentaje de

identidad mayor a 95%
 La mayoría de los microorganismos analizados cuentan con una secuencia de
nucleótidos regular.
 Los softwares utilizados como el Bioedit son de mucha utilidad para el análisis de
los cromatogramas.

VI. BIBLIOGRAFIA
 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearc
h&LINK_LOC=blasthome
 https://bioedit.software.informer.com/Descargar-gratis/
 http://bioinf.ibun.unal.edu.co/documentos/multAlignmentCBIB.pdf
 https://es.wikipedia.org/wiki/Centro_Nacional_para_la_Informaci%C3%B3n_Biotecno
l%C3%B3gica
 https://www.genome.gov/es/about-genomics/fact-sheets/Secuenciacion-del-ADN
 https://es.wikipedia.org/wiki/ARN_ribosomal_16S
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

VII. ANEXOS

DIVERSOS-_A07_1H_01

DIVERSOS-_A08_9H_02

DIVERSOS-_A09_1_01
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_A10_9_02

DIVERSOS-_A11_17_01

DIVERSOS-_B07_2H_03
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_B08_10H_04

DIVERSOS-_B09_2_03

DIVERSOS-_B10_10_04
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_B11_18_03

DIVERSOS-_C07_3H_05

DIVERSOS-_C08_11H_06
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_C09_3_05

DIVERSOS-_C10_11_06

DIVERSOS-_C11_19_05
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_D07_4H_07

DIVERSOS-_D08_12H_08

DIVERSOS-_D09_4_07
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_D10_12_08

DIVERSOS-_E07_5H_09

DIVERSOS-_E08_13H_10
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_E09_5_09

DIVERSOS-_E10_13_10

DIVERSOS-_F07_6H_11
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_F09_6_11

DIVERSOS-_F10_14_12

DIVERSOS-_G07_7H_13
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_G09_7_13

DIVERSOS-_G10_15_14

DIVERSOS-_H07_8H_15
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

DIVERSOS-_H09_8_15

DIVERSOS-_H10_16_16

USER_04set2007_01-419NZ_A01_01
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

USER_04set2007_02-526NZ_B01_03

USER_04set2007_03-419AZ_C01_05

USER_04set2007_04-88NZ_D01_07
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

USER_04set2007_05-88AZ_E01_09

USER_04set2007_06-526Y1_F01_11

USER_04set2007_07-419Y1_G01_13
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

USER_04set2007_08-375H_H01_15

USER_04set2007_09-419YZ_A02_02

USER_04set2007_10-88H_B02_04
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

USER_04set2007_11-375NZ_C02_06

USER_04set2007_12-526YZ_D02_08

USER_04set2007_13-483NZ_E02_10
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

USER_04set2007_14-483H_F02_12

USER_04set2007_15-456NZ_G02_14

user_12set2007_01_A03_01
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

user_12set2007_02_B03_03

user_12set2007_03_C03_05

user_12set2007_04_D03_07
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

user_12set2007_05_E03_09

user_12set2007_06_F03_11

user_12set2007_07_G03_13
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

user_12set2007_08_H03_15

user_12set2007_09_A04_02

user_12set2007_10_B04_04
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

user_12set2007_11_C04_06

user_12set2007_12_D04_08

user_12set2007_13_E04_10
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

user_12set2007_14_F04_12

user_12set2007_15_G04_14

user_12set2007_16_H04_16
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

usuarios_12set2007_1Y2_F04_12

usuarios_12set2007_2Y2_G04_14

usuarios_12set2007_3Y2_H04_16
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

usuarios_12set2007_17_A04_02

usuarios_12set2007_18_B04_04

usuarios_12set2007_19_C04_06
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

usuarios_12set2007_20_D04_08

usuarios_12set2007_21_E04_10