LABORATORIO 5.

TOMA DE MUESTRA, PREPARACIÓN DILUCIONES Y

MÉTODOS DE RECUENTO

TANIA MARCELA VILLEGAS LEON – 1950058

DOCENTE: CRISTINA VILLA

MICROBIOLOGÍA Y LABORATORIO

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

QUÍMICA INDUSTRIAL
CÙCUTA
OBJETIVOS
 Aprender diluciones, siembra y método de reencuentro para análisis microbiológicos
de alimentos.
 Realizar análisis microbiológico a un alimento asignado utilizando lo aprendido
teóricamente.

INTRODUCCIÓN
La finalidad del muestreo es obtener una muestra representativa del alimento para su análisis
inmediato y conseguir resultados fiables sobre su estado higiénico-sanitario.
Los métodos de toma de muestra tenderán del tipo de alimento y la cantidad de cada unidad
deberá ser determinada, con minucioso cuidado, aplicando principios estadísticos que
aseguren cumplir con los objetivos del examen; es necesario que el producto reúna las
mismas condiciones microbiológicas en el momento del muestreo por eso se debe tener en
cuenta lo siguiente:
a) Realizar muestreo aséptico empleando recipiente de instrumentos estériles.
b) Pero deberíamos de contaminación externa y mantenerla bajo condiciones que no
permitan la muerte ni la multiplicación de su flora original.
c) Mantener bajo congelación las muestras que se mantengan en estado en el momento
de procesarla deben descongelarse envase original en una nevera entre 2 y 5 grados.
d) Refrigerar las muestras procedentes entre 0 y 5 grados.

Una vez tomadas las muestras se empacan según su naturaleza para evitar su deterioro.
Etiquetado de las muestras:
 Nombre del producto
 Marca
 Características organolépticas: Color, olor, aspecto.
 Temperatura
 pH
 Tipo y estado del envase
 Dirección
 Número de Registro sanitario
 Número de lote
 Razón por la cual se solicita al análisis: Rutina, intoxicación ETC.
 Método de muestreo utilizado.
 Forma de transporte, condiciones de envío laboratorio.

La cantidad mínima de muestra para realizar los análisis es de 200 gramos aproximados.
Unos 100g se utilizan y los otros 100gr sirven de reserva por si es necesario repetir el análisis.
Cuando se trata de alimentos sólidos es necesario meterlos previamente a una suspensión
utilizando un diluyente estéril. Si el alimento es líquido se agita en su envase original y sepas
sépticamente a un recipiente estéril.
Los diluyentes más utilizados son: Agua triptona con 5 grados sal, solución de ringer 1/4,
agua de peptona tamponada.

MATERIALES
 Alimento asignado:(Queso) con sus condiciones de conservación y su empaque
intacto.
 Erlenmeyer con 90 ml de agua peptona y tubos tapa rosca con 9 milímetros de agua
peptona, gradilla, balanza.
 Pipetas estériles, placas estériles.
 Agar plate count (para aerobios mesófilos), agar sabouraud 4% (para hongos y
levaduras), agar chromocoult (para coliformes totales y coliformes fecales).

RUTA METODOLÓGICA
Para cada dilución:
CUESTIONARIO
1. Defina inoculo microbiano y bioindicador.
 Inoculo microbiano: Es una preparación solida o líquida la cual contiene una gran
cantidad de microorganismos. Tiene ciertas características:
 La cepa o cultivo a utilizar debe ser genéticamente estable.
 La cepa o cultivo debe estar libre de contaminantes.
 El microorganismo a usar debe ser de fácil conservación sin pérdida de sus
características.
 El inoculo puede ser un consorcio de diversas especies microbianas, como las
que se encuentran en lodos aerobios (aguas residuales).
 Un inoculo debe tener la capacidad de crecer e invadir rápidamente el sustrato
(velocidad de crecimiento alta).
 El inoculo implica obtener una suspensión de microorganismos viables y
aptos para reproducirse y producir metabolitos a escala industrial.
 Si el objetivo es obtener un producto, este debe ser obtenido en altas
concentraciones.

 Bioindicador: Es un indicador consistente en una especie vegetal, hongo o animal; o

formado por un grupo de especies (grupo eco-sociológico) o agrupación vegetal cuya
presencia (o estado) nos da información sobre ciertas características ecológicas,
(físico-químicas, micro-climáticas, biológicas y funcionales), del medio ambiente, o
sobre el impacto de ciertas prácticas en el medio. Se utilizan sobre todo para la
evaluación ambiental (seguimiento del estado del medio ambiente, o de la eficacia de
las medidas compensatorias, o restauradoras).

2. Describa el fundamento de las siguientes técnicas para calificación microbiana:

Muestra espectrofotometría y cuantificación ácidos grasos de membrana.
 Muestra espectrofotometría: Es un método científico utilizado para medir cuánta luz
absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz
luminoso pasa a través de la solución muestra, con base en la ley de Beer-Lambert.
Esta medición también puede usarse para medir la cantidad de un producto químico
conocido en una sustancia.
 Cuantificación ácidos grasos de membrana: Para la determinación de ácidos grasos
bacterianos por cromatografía de gases hay que tener en consideración ciertos
aspectos. En primer lugar, si se quiere realizar un análisis cuantitativo de los ácidos
grasos hay que tener en cuenta el medio que se utilizó para su crecimiento, porque
puede inducir a errores por los ácidos grasos que el medio contiene. Existen ciertos
factores puntuales que influencian el contenido de ácidos grasos y son acetato,
glicerol, carbohidratos, lípidos y sustancias nitrogenadas presentes en el medio,
oxígeno suplementario, pH y tiempo del cultivo.
Los ácidos grasos, entre 9 y 20 átomos de carbono, de acuerdo a su naturaleza
química, pueden ser empleados como un criterio de clasificación en bacterias,
especialmente en las gram negativas no fermentadoras. Con el gran avance que ha
tenido la cromatografía gaseosa, se ha podido lograr una buena resolución de estos
ácidos grasos, incluyendo los hidroxiácidos, y se ha convertido en una herramienta
práctica para un amplio rango de bacteria.
La mayor ventaja de este método es que a partir del perfil de ácidos grasos permite
identificar microorganismos tanto a nivel intraespecie como interespecie, además
permite analizar un amplio rango de muestras distintas ya que utiliza el mismo
procedimiento. Este método es rápido, porque la muestra ambiental o de alimento
previamente tratada según procedimientos microbiológicos, puede ser sembrada en
agar TCBS y después del período de incubación, se toma una colonia y se siembra
directamente en caldo TSB, con contenido variable de cloruro de sodio, de acuerdo a
la especie que se quiera investigar.

3. Revisar el anexo que encuentra en la presente guía y realizar en su agenda informe:

Tres ejercicios de diluciones y tres ejercicios de cada uno de los casos de recuento.

CASO 1.
 Hongos y levaduras: Rango entre 10 – 100 colonias por placa:
100 = 40 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
100 = 15 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
𝑆𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 = 28 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿

 Coliformes totales y fecales: Rango entre 20 – 200 colonias por placa:

100 = 120 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
 100 = 180𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠

𝑆𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 = 150 𝑈𝐹𝐶/𝑔

 Aerobios mesófilos: Rango entre 30 – 300 colonias por placa:

100 = 280 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠

100 = 230 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
𝑆𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 = 255 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿

CASO 2.
 Hongos y levaduras: Rango entre 10 – 100 colonias por placa:
10−2 = 50 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
10−2 = 80 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
50 + 80
= 65𝑥102 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 = 6500 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿
2

 Coliformes totales y fecales: Rango entre 20 – 200 colonias por placa:

10−2 = 130 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
10−2 = 200 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
130 + 200
= 165𝑥102 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 = 16500 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿
2

 Aerobios mesófilos: Rango entre 30 – 300 colonias por placa:

10−3 = 220 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
10−3 = 260 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
220 + 260
= 240𝑥103 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 = 240000 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿
2
CASO 3.
 Hongos y levaduras: Rango entre 10 – 100 colonias por placa:
10−3 = 20 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 = 20𝑥103 = 20000
10−2 = 70 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 = 70𝑥102 = 7000
20000 70𝑥102 𝑈𝐹𝐶
> 2 → 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜 =
7000 𝑚𝐿

 Coliformes totales y fecales: Rango entre 20 – 200 colonias por placa:

10−4 = 40 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 = 40𝑥104 = 400000
10−2 = 130 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 = 130𝑥102 = 13000
 400000
> 2 → 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜 = 130𝑥102 𝑈𝐹𝐶/𝑔
13000

 Aerobios mesófilos: Rango entre 30 – 300 colonias por placa:

10−3 = 160 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 = 160𝑥103 = 160000
10−4 = 240 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 = 240𝑥104 = 2400000
2400000
> 2 → 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜 = 160𝑥103 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿
160000
CASO 4.
 Hongos y levaduras: Rango entre 10 – 100 colonias por placa:

10−3 = 30 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 45 colonias (45000)
10−3 = 60 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 Promedio: 45 colonias (45000)
−4
10 = 20 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 55 colonias (550000)
10−4 = 90 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 Promedio: 45 colonias (45000)
550000
> 2 → 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜 = 45𝑥103 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿
45000

 Coliformes totales y fecales: Rango entre 20 – 200 colonias por placa:

10−3 = 115 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 123 colonias (123000)
10−3 = 130 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 45 colonias (45000)
−2
10 = 160 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 173 colonias (17300)
10−2 = 185 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 45 colonias (45000)

123000
> 2 → 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜 = 173𝑥102 𝑈𝐹𝐶/𝑔
17300

 Aerobios mesófilos: Rango entre 30 – 300 colonias por placa:

10−3 = 180 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 205 colonias (205000)
10−3 = 230 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 45 colonias (45000)
−2
10 = 270 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 285 colonias (28500)
10−2 = 300 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
Promedio: 45 colonias (45000)
 205000
> 2 → 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜 = 285𝑥102 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿
28500

CASO 5.
 Hongos y levaduras: Rango entre 10 – 100 colonias por placa:
−1
101 𝑈𝐹𝐶
10 : 0 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 → 𝑅𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜: < 𝐶𝐸
𝑚𝐿
 Coliformes totales y fecales: Rango entre 20 – 200 colonias por placa:
−3
103 𝑈𝐹𝐶
10 : 0 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 → 𝑅𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜: < 𝐶𝐸
𝑔
 Aerobios mesófilos: Rango entre 30 – 300 colonias por placa:
10−2 : 0 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑦 10−4 : 0 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
102 𝑈𝐹𝐶
𝑅𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜: < 𝐶𝐸
𝑚𝐿
CASO 6.
 Hongos y levaduras: Rango entre 10 – 100 colonias por placa:
−4
1600𝑥104 𝑈𝐹𝐶
10 : 𝐼𝑛𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 → 𝑅𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜: > 𝐶𝐸
𝑚𝐿
 Coliformes totales y fecales: Rango entre 20 – 200 colonias por placa:
10−2 : 𝐼𝑛𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 𝑦 10−3 : 𝐼𝑛𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒
1600𝑥103 𝑈𝐹𝐶
𝑅𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑜: > 𝐶𝐸
𝑚𝐿

 Aerobios mesófilos: Rango entre 30 – 300 colonias por placa:

10−1 : 𝐼𝑛𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 → 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑏𝑜𝑟𝑎𝑡𝑜𝑟𝑖𝑜

ANALISIS Y DISCUSIONES
Se evaluaron algunos de los métodos más utilizados para el recuento de microorganismos
determinando así las ventajas y desventajas de cada uno. Aunque existan muchos tipos
de recuento de células, algunos mejores que otros, la gran mayoría siempre tendrá
desventajas. Unas de las desventajas del recuento por el método de siembra en
profundidad y en superficie son: el tiempo prolongado que se necesita para la preparación
de los medios y el riesgo de contaminación por otros microorganismos que pueden afectar
el medio de cultivo.
Una de las ventajas del recuento de células viables es precisamente que forman UFC.
Mientras que en recuentos microscópicos no se tiene la certeza de si se trata de una célula
viva o muerta, a menos de que esta tenga movilidad o tinciones vitales. Sin duda una de
las ventajas del método microscópico es que por medio de este se puede brindar
información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados. En el
 método microscópico el margen de error incrementa a medida que la muestra tiene una
concentración celular alta, además de que si el tamaño de la célula del microorganismo
es muy pequeña esta será difícil de ver.
En un balance general se puede decir que dependiendo del tipo de microorganismo que
se vaya a cultivar, se debe investigar acerca de cuál método presenta mejores
características para un recuento sin tanto margen de error, que sea de manera fácil y
económica.

BIBLIOGRAFIA
A, R. S. (s.f.). Análisis de recuentro. Obtenido de Análisis de técnicas de recuento de
Microorganismos:
https://repository.unilibre.edu.co/bitstream/handle/10901/17610/1.An%C3%A1lisis%20d
e%20recuentro.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Anonimo. (s.f.). Wikipedia . Obtenido de Espectrofotometría:

https://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometr%C3%ADa#Aplicaciones

Fernández, R. V. (01 de 08 de 2012). v4n4a03.pdf. Obtenido de Determination of fatty acid of

Vibrio bacteria by gas chromatography:
http://www.iicweb.org/scientiachromatographica.com/files/v4n4a03.pdf