Replicación del Material

Genético en Procariontes

Dr. Hugo Ramírez Saad

DOGMA CENTRAL DE LA
BIOLOGÍA MOLECULAR
REPLICACIÓN
DNA
TRANSCRIPCIÓN
TRANSCRIPCIÓN
INVERSA

RNA

TRADUCCIÓN

PROTEINA
 Modelos de replicación del DNA

En 1958 M. Meselson y F. Stahl establecieron que el

modelo de replicación del DNA es semiconservativo.
 La horquilla de replicación
En 1963, John Cairns proporcionó la primera evidencia de
que la replicación era un proceso altamente coordinado, en
que las cadenas parentales se desenrollaban y replicaban
simultáneamente.

esquemas

autoradiografías
 La replicación puede ser
unidireccional o bidireccional
n En la unidireccional, una
horquilla de replicación
parte del origen y avanza
a lo largo del DNA en un
solo sentido.
n En la bidireccional, se
forman dos horquillas de
replicación que avanzan
en sentidos opuestos.
 Sitio del orígen de replicación en
Procariontes
(E. coli como modelo)
n La replicación comienza en un punto de
origen (ori C, en E. coli) fijo y luego
progresa bidireccionalmente finalizando en
un punto denominado término (Ter).
n Este punto de origen único se llama ori C
n El sitioTer se localiza en el lado opuesto
de ori C
Mapa genético de E. coli mostrando la ubicación de genes
involucrados en Replicación, Recombinación y Reparación
 Características del locus ori C
Apertura de la doble hélice

•Involucra aproximadamente 260 pb

• Regiones ricas en AT (cluster AT y 3 repeticiones en
tándem de 13 mer)
• 5 sitios de unión para DnaA al lado del tándem
• Acción cooperativa de varias moléculas de DnaA
• Participación de otras proteínas accesorias (IHS, Fis) y
factores de control (IciA, Rob, H-NS)
• Apertura de la doble hélice por DnaB (helicasa inicial)
FASES DE LA REPLICACIÓN
1.INICIO
• Apertura de la doble hélice
• Ensamblaje del replisoma
2.ELONGACIÓN

3.TERMINACIÓN
• Reunión de las horquillas de
replicación
• Resolución del DNA
 Inicio de la replicación 1.
Apertura de la doble hélice
Inicio de la
replicación 2.

Ensamblaje del
replisoma
 Enzimas involucradas en la replicación
n Topoisomerasas: Eliminan y generan los superenrollamientos.
n Helicasas: Rompen los puentes de H
n DNA Polimerasas:
n pol I: completa la síntesis de la cadena entre los
fragmentos de Okazaki en la cadena retardada
n pol II: corrige errores y repara daños del DNA.

n pol III: funciona en la horquilla de replicación, es la que

cataliza la mayor parte de la elongación de la cadena y es
la más procesiva. SINTETIZA SIMULTÁNEAMENTE LAS
CADENAS RETRASADA Y CONTINUA.
n Primasa: (RNApol-DNA depen) sintetiza al cebador de RNA.
n Ligasa: cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre
los extremos 5’ fosfato y 3’ OH adyacentes.
REPLICACIÓN: Iniciación y elongación
n Apertura de la doble hélice
n Cebado por un tramo corto de RNA
(primasa).
n Ataque al 3´OH del RNA cebador por el
fosfato alfa del primer dNTP entrante
(pol III)
n Liberación de pirofosfato.
n El extremo 3´OH del nucleótido queda
libre y ataca a otro dNTP (pol III)
POLIMERIZACIÓN DEL DNA
Horquilla de replicación o Replisoma
 Horquilla de replicación

RNA
DNA
Polimerización en
alternancia de ambas
cadenas por la DNA polIII
 DNA polimerasa III
(PM aprox, de la holoenzima 600,000D)
.
Replicación en Eucariotas
n Velocidad de POLIMERIZACIÓN: En levaduras es de ± 60 nt/s,
en Drosophila de ± 40 nt/s y en ratón de ± 30 nt/s. En E. coli la
velocidad de alargamiento es de 1000 nt/s.
n Origen de replicación: Varios cromosomas, con varios replicones
c/u. Por ejemplo, en levadura existen 500 replicones, en Drosophila
3500, en ratón 25000 y en plantas 35000.
n No existen rondas de replicación solapadas: En E.coli debido
al solapamiento de las rondas de replicación se generaban tiempos
de generación muy cortos. Esto en eucariotas NO ocurre, la división
celular tiene lugar una vez que el DNA se ha replicado, dicha
replicación tiene lugar durante la fase S del ciclo celular.
n Los fragmentos de Okazaki son mas cortos.
El control es mucho más complejo.
Los cebadores están compuestos por RNA (aproximadamente
10 bases) y DNA (iDNA, aproximadamente 20-30 bases).
n Enzimas involucradas en el proceso
n Diez clases de polimerasas, algunas participan en la replicación del
DNA (las polimerasas a, d, e nucleares, g mitocondrial) y otras
están involucradas en mecanismos de reparación del material
genético (polimerasas b, h,i,z y k)
 REPLICACIÓN DE GENOMAS
PROCARIONTES Y EUCARIONTES
PROCARIONTES EUCARIONTES

Número de
2 103-104
replisomas por célula
Tiempo de replicación 0.67
del genoma (h) 8
(40 min)

Tiempo de duplicación 0.33

celular (h) 24
(20 min)

Tamaño del genoma

4.8 6000
(Mega pb)
Número de variable en pares
1 (Diploide)
cromosomas
Forma del Circular lineales
cromosoma
 Tiempo de replicación del DNA
en algunos tipos de células

n E. coli 40 min
n Levaduras 1.4 h
n Células animales en cultivo 24 h,
pudiendo llegar hasta las 100 o
200 h
 Transcripción

Proceso que permite el flujo

de información genética
desde el DNA hasta el RNAm
FASES DE LA TRANSCRIPCIÓN
1. INICIO
• Reconocimiento de promotores
• Ensamblaje de la holoenzima

2. ELONGACIÓN

3. TERMINACIÓN
• Formación de tallo
• Terminación por la proteína rho
 Síntesis del RNAm

n Es sintetizado por la RNA polimerasa, esta

enzima requiere:
n DNA molde
n Un pool de los cuatro ribonucleótidos
trifosfato (NTP) como precursores de las
cadenasss nucleotídicas del RNA
n Presencia de Mg2+
 Características de la transcripción
en procariontes
n El factor σ puede actuar acoplado o
separado del resto de la RNA pol
n El proceso incluye inicio, elongación y
terminación
n Cualquier etapa de la transcripción puede
estar regulada, principalmente las etapas
de inicio y de unión de la RNA polimerasa
n La transcripción y la traducción ocurren de
manera simultánea
 Colinearidad del gen
De las dos hebras de DNA:
n Una sirve de molde para la transcripción, se
denomina hebra molde
n La hebra de DNA complementaria de denomina
hebra codificante, su secuencia es colinear con
el RNAm recién sintetizado
 RNA POLIMERASA o TRANSCRIPTASA
SUBUNIDADES:
a - (36.5kD x2)
b’ ensamblaje de la
holoenzima, unión a
bb secuencias y proteínas
a reguladoras
b - (151kD) centro
catalítico liga NTPs, se
une a s
b’ - (155kD) se une a
DNA molde
s s - (subunidad disociable
de tamaño variable)
reconocimiento de los
promotores
 La síntesis de RNAm empieza con el
reconocimiento de los promotores
n El factor sigma (σ) de la RNA polimerasa se
une a secuencias reguladoras de DNA
denominadas promotores, localizados al
inicio de todos los genes u operones
n Estas secuencias no son idénticas en todos
los promotores bacterianos.
n Algunos promotores se extienden de las
posiciones -70 a +30.
Secuencias de algunos promotores
n Secuencias consenso en las posiciones -10, -35
n Up element, corriente arriba de algunos promotores.
n Los cambios de nucleótidos en la secuencia consenso
afectan la eficacia de unión del factor σ y con esto el
inicio de la transcripción
Inicio de la transcripción
ELONGACIÓN
 Regulación y terminación de la
transcripción
n Cualquier etapa de la transcripción puede estar
regulada, principalmente ocurre en las etapas de inicio
y de unión de la RNA polimerasa.

E. coli posee 2 clases

de señales de
terminación:

1. Formación de tallo

2. Terminación por la
proteína rho
 Terminación de la transcripción
E. coli posee 2 clases de señales de terminación:
Formación de Terminación por la
tallo terminador proteína rho
Maduración del RNA
 Gran parte de las moléculas de RNA de las
bacterias y todas las de eucariotas son modificadas
en cierta medida después de su síntesis. Los
enzimas que catalizan estas reacciones están
constituidos por RNA (RNA catalíticos o ribozimas).
Una molécula de RNA recién sintetizada se
denomina transcrito primario. El transcrito primario
de un RNAm eucariótico contiene tanto secuencias
codificantes (exones), como no codificantes
(intrones)
 Los intrones del DNA son transcritos junto con el
resto del gen por las RNA polimerasas. Los
intrones en el transcrito primario de RNA son
cortados a continuación y los exones empalmados
para formar un RNA maduro y funcional. En los
mRNA eucarióticos la mayoría de exones tienen
menos de 1000 nucleótidos de longitud, con
muchos de ellos en el intervalo de 100 a 200
nucleótidos. La tamaño de los intrones varía entre
50 y 20000 nucleótidos.
Traducción de la información
genética
 Características de la traducción
§ La información codificada en el RNAm es
transformada en proteínas, en forma de una
secuencia de aminoácidos.
Es realizada por un complejo de RNAr-
proteínas llamado ribosoma.
Los aminoácidos están especificados por
codones del mRNA (tripletes), conforme el
código genético
Los tRNA reconocen los codones e insertan
los aminoácidos en las posiciones apropiadas
de la secuencia del polipéptido.
 Características del código genético
El código genético es: universal, su codificación
es válida para todos los seres vivos; degenerado,
varios codones codifican para el mismo aa
(redundante).
La tercera posición en cada codón es menos
específica que la primera y la segunda.
El apareamiento codón-anticodón se dice que
balancea.
El aminoácido iniciador, N-formilmetionina en
procariontes, y metionina en eucariontes, en
ambos casos esta codificado por AUG.
 El ribosoma
Los ribosomas bacterianos están formados
por 65% de rRNA y 35% de proteína.
La variedad de proteínas ribosómicas es
sumamente grande, con masas moleculares
que van de 6000 a 75000D.
Los rRNA sirven de armazón sobre el cual se
unen las proteínas ribosómicas.
Las subunidades ribosómicas se identifican
por su valor de sedimentación S (Svedberg).
Ribosoma bacteriano
Formado por 2 subunidades: 50S y
30S unidas 70S

• Subunidad mayor o 50S:

• rRNA 5S (120nt)
• rRNA 23S (3200nt)
• 34 proteínas

• Subunidad menor o 30S:

• rRNA 16S (1550nt)
• 21 proteínas
 RNA de transferencia
Los RNA de transferencia son
relativamente pequeños (72-
78nt). La mayor parte de los nt
forman tallos
autocomplementarios,
plegándose en forma de trébol
En el tallo poseen la secuencia
CCA3’, a la que se esterifican los
aa
Los brazos laterales son críticos
para su función de adaptador,
poseen nt modificados que los
identifican
El brazo anticodón se aparea
con el codón respectivo.
n RNA de transferencia

D = DihidroUridina ψ = pseudoUridina
Etapas de la traducción o síntesis
de proteínas
n Activación de tRNAs (aa)
n Inicio
n Elongación

n Terminación y liberación
n Plegamiento y
modificación
postraduccional
Componentes necesarios para la
activación de tRNA (aa)
n 20 aminoácidos
n 20 aminoacil-tRNA sintetasas
n 20 o mas tRNA
n ATP
n Mg2+
 Activación de tRNAs (aa)
La síntesis de polipéptidos exige el cumplimiento de 2
requerimientos químicos fundamentales. (1) El grupo
carboxilo de cada aminoácido debe ser activado para
facilitar la formación del enlace peptídico, y (2) cada nuevo
aminoácido debe ser incorporado de acuerdo con la
información contenida en el mRNA. Ambos requerimientos
están garantizados por la unión del aminoácido al tRNA en
la primera etapa de la síntesis de proteínas. La reacción
tiene lugar en el citosol, es catalizada por aminoacil tRNA
sintetasas específicas para cada aa.
Para activar alanina se requiere la Alanina-tRNA sintetasa
Componentes requeridos en la fase
de inicio
n mRNA
n N-Formilmetionil-tRNA
n Codón de iniciación en el mRNA (AUG)
n Subunidad ribosómica 30S
n Subunidad ribosómica 50S
n Factores de iniciación (IF-1, IF-2, IF-3)
n GTP
n Mg2+
 Inicio de la Traducción

El mRNA recién transcrito se una a la subunidad

menor del ribosoma y al tRNA-fMet iniciador
(activado). La subunidad ribosómica mayor se
une a continuación para formar el complejo de
inicio. El tRNA iniciador se aparea con el codón
AUG del mRNA, que señala el principio del
polipéptido. Este proceso, que requiere GTP, es
promovido por proteínas citosólicas especificas
denominadas factores de iniciación
Complejos de iniciación
 Complejos de iniciación de la traducción

La secuencia de Shine-Dalgarno (6-7nt), es reconocida por el 16S rRNA de la

subunidad 30S, que junto con los otros elementos (Ifs, GTP y tRNA-fMet ),
forman el complejo de iniciación 30S. Al unirse la subunidad 50S, se forma el
complejo 70S que puede iniciar la elongación de la cadena polipeptídica
 Componentes requeridos en la
elongación
n Ribosoma 70S funcional (complejo de
inicio)
n Aminoacil-tRNA especificados por codones
n Factores de elongación (EF-Tu, EF-Ts, EF-
G)
n GTP
n Mg2+
 Elongación

La cadena polipeptídica naciente se alarga mediante

la unión covalente de sucesivas unidades de
aminoácidos, transportada cada una al ribosoma y
posicionada correctamente por su tRNA, que se
aparea con su correspondiente codón en el mRNA.
La elongación requiere proteínas citosólicas
denominadas factores de elongación. La fijación de
los aminoacil-tRNA entrantes y el desplazamiento de
los ribosomas a lo largo del mRNA están facilitados
por la hidrólisis de GTP, a medida que los residuos
son añadidos al polipéptido en crecimiento.
Elongación
 Terminación y liberación
La finalización de la cadena polipeptídica esta señalada por
un codón de terminación del mRNA. A continuación, la
cadena polipeptídica nueva se desprende del ribosoma con
la ayuda de proteínas llamadas factores de liberación.
 Componentes requeridos
Terminación y liberación Codón de terminación en el
mRNA
Factores de liberación de
polipéptidos (RF1, (RF2, RF3)
ATP

Plegamiento y modificación Enzimas y cofactores específicos

postraduccional y otros componentes para la
eliminación del aa de inicio y
secuencias señal, modificación
proteolítica adicional,
modificación de residuos
terminales, unión de grupos
fosfatos, metilo, carboxilo,
glúcidos o grupos prostéticos.
 Plegamiento y modificación
postraduccional
Para adoptar su forma biológicamente activa, el
polipéptido nuevo plegarse en su conformación
tridimensional adecuada. Antes o después del
plegamiento, el nuevo polipéptido puede
experimentar modificaciones enzimáticas, incluida
la eliminación de uno o más aminoácidos del
extremo amino terminal; la adición de grupos
acetilo, fosforilo, metilo, carboxilo u otros grupos
a ciertos residuos de aminoácidos; el corte
proteolítico, la unión de oligosacáridos o grupos
prostéticos.