Participación de la Reparación por escisión de nucleótidos en una Ruta

Independiente de la Recombinación y Propensa a sufrir Errores para la

Reparación de los entrecruzamientos inter-hebras en el ADN

Los agentes alquilantes están entre los primeros compuestos que resultaron ser
eficaces en el tratamiento del cáncer y siguen siendo un importante componente de
muchos regímenes modernos de quimioterapia (38). Muchos miembros de esta clase
de medicamentos tienen grupos bifuncionales que pueden reaccionar con las dos
hebras de la hélice de ADN y por lo tanto forman enlaces cruzados inter e intra-hebra.
Como bloqueos profundos, tanto para la replicación del ADN como para la
transcripción, los entrecruzamientos inter-hebra (ICL) parecen representar la lesión
primaria citotóxica inducida por la mayoría de los agentes alquilantes bifuncionales.

La reparación de los ICL en el ADN se ha estudiado extensamente en Escherichia

coli (11, 12). Las evidencias genéticas y bioquímicas han establecido una reparación
mecanismo combinado de recombinación–reparación por escisión de nucleótidos
(NER) para la reparación libre de errores de los ICL, en la cual el hueco creado por la
excinucleasa Uvr(A)BC, se repara a través de la recombinación mediada por recA,
teniendo como donante a un cromosoma homólogo libre de lesiones (10, 37, 41).
Aunque la vía de recombinación–NER parece ser el principal mecanismo de
reparación de los entrecruzamientos en E. coli, evidencia reciente ha sugerido una
ruta independiente de la recombinación para la reparación de dichos
entrecruzamientos, en la cual el hueco creado por la excinucleasa Uvr(A)BC es
reparado derivando la trans-lesión, a fin de evitar una deficiencia en la recombinación
o que falten secuencias homólogas donantes (4, 5). En la levadura Saccharomyces
cerevisiae, los miembros del grupo de epistasis RAD52 presentan hipersensibilidad
frente a los agentes que producen entrecruzamiento y la radiación ionizante, lo que
indica que la reparación de los ICL requiere una recombinación homóloga. Los
miembros del grupo de epistasis RAD3, los cuales carecen de la NER, también son
muy sensibles a los daños por entrecruzamiento (21, 29, 36). En conjunto, estas
observaciones confirman la combinación de un mecanismo de recombinación–NER
para la reparación de los ICL en los eucariotas inferiores. Tal como en el caso de los
mecanismos independientes de la recombinación en E. coli, también pueden
desempeñar un papel en la eliminación de los entrecruzamientos en las células
eucariotas. La levadura mutante pso1 se caracteriza por ser hipersensible a los ICL
inducidos por el psoraleno (19), y el análisis genético ha demostrado un alelismo
entre el mutante pso1-1 y el mutante rev3-1 (9). El gen REV3 codifica a la subunidad
catalítica de la ADN polimerasa ζ para la trans-lesión en las levaduras, cuya función
es necesaria para la mutagénesis inducida (30, 33). Un estudio más reciente ha
indicado que rev3p es importante para el procesamiento de los productos intermedios
de la reparación de los ICL en las células no replicantes, fundamentando más
adelante de un mecanismo de reparación de ICL en las levaduras, el cual es
independiente de la recombinación y que se basa en la derivación de la lesión (28).
Un posible papel para la rev3p-polimerasa ζ en la reparación de los
entrecruzamientos es la síntesis de la trans-lesión más allá de la lesión durante el
desacoplamiento de un entrecruzamiento.
En los mamíferos, se desconocen los mecanismos de reparación de los ICL. El
modelo combinado de recombinación–NER no parece ser el principal mecanismo de
reparación ya que la mayoría de los mutantes NER sólo muestran una moderada
sensibilidad a los agentes de entrecruzamiento, a pesar de que los mutantes que son
defectuosos en el gen ERCC1 o en el gen XPF presentan una extrema sensibilidad
(2, 20). Sin embargo, varias líneas de evidencia han sugerido la participación de la
recombinación homóloga en la reparación de los ICL (39). In vivo, han sido bien
documentados los niveles elevados de intercambio de cromosomas hermanos,
inducidos por agentes alquilantes bifuncionales y que se conectan con la reparación
de los ICL (7, 14, 25). Empleando un entrecruzamiento triple mediado por el
psoraleno como modelo de daño, se ha reportado que la recombinación homóloga
intramolecular se produce a través de la ruta de hibridización no conservativa en una
sola hebra y de la ruta conservadora de intercambio recíproco (15, 16).
Recientemente, ha surgido evidencia más convincente de la reparación por
recombinación de los ICL, a través de la caracterización de dos mutantes de hámster,
IRS1 e irs1SF, los cuales muestran una extrema sensibilidad a los agentes de
entrecruzamiento (17, 24). Tanto el gen XRCC2 como el gen XRCC3, que suplen la
deficiencia de reparación de los mutantes irs1 e irs1SF, respectivamente, presentan
una estructura similar a la familia de la recombinasa hRad51 (27). Los estudios
realizados por Johnson et al. (23) y Pierce et al. (34), han indicado que las dos líneas
celulares albergan un defecto en la recombinación homóloga, marcado por una
severa reducción en la actividad de conversión de los genes. Por otra parte, las
células madre embrionarias de los ratones deficientes de RAD54, también son
hipersensibles a la mitomicina C como un resultado aparente de la reducción de la
recombinación homóloga conservadora (14). Además, Li et al. (26) han demostrado,
in vitro, que la presencia de un ICL en un plásmido sustrato estimula la síntesis
reparadora en los extractos de células de mamíferos y que esta síntesis estimulada
también se observa en un plásmido intacto co-incubado con el mismo extracto, lo que
sugiere que los ICL pueden inducir una síntesis reparadora por recombinación. En
conjunto, estos resultados proporcionan pruebas sólidas de que los factores de
recombinación participar en la reparación de los ICL y es probable que participen en
una importante ruta de eliminación de los ICL.

Para investigar los mecanismos por los cuales los ICL se reparan en las células de
los mamíferos en ausencia de secuencias donantes homólogas, se empleó un
ensayo de reactivación de genes en el cual se introdujo un solo ICL definido por el
psoraleno en un plásmido reportero con el fin de bloquear la transcripción del gen
reportero. En consecuencia, la expresión del gen reportero se convirtió en
dependiente de la eliminación del LCI. En el presente artículo reportamos que la
reparación del presente ICL en el plásmido sustrato fue observada en células del tipo
salvaje y que los mutantes defectuosos en el NER eran deficientes en la reactivación,
mientras que los mutantes defectuosos en la recombinación homóloga no lo eran. El
rescate y la secuenciación de los plásmidos reparados, indican una alta tasa de
mutagénesis en el sitio de entrecruzamiento por el psoraleno. Estos resultados
indican que en las células de los mamíferos existe una ruta de reparación de los ICL,
la cual es independiente de la recombinación, pero es propensa a sufrir errores.