UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Curso:
BIOQUÍMICAS DE ALIMENTOS
Título de la práctica:
PRÁCTICA 6: CARACTERIZACIÓN DE POLIFENOLOXIDASA
Grupo:
Viernes: 17:30 – 19:00
Alumno:
CHACON HUAMANÍ, Alvaro Fernando
Docente:
ROMERO VARGAS, Frey Francisco

Arequipa – Perú
2020
 P6: CARACTERIZACIÓN DE POLIFENOLOXIDASA

1. INTRODUCCIÓN

El color en los alimentos es un parámetro de gran importancia para el consumidor.

Al menos cinco causas han sido detectadas como responsables del cambio de color
en frutas y vegetales frescos: pardeamiento u oxidación enzimática de polifenoles,
reacciones de Maillard, oxidación de ácido ascórbico, caramelización y formación de
polímeros oscurecidos por la acción oxidativa de lípidos (1)

Las enzimas que catalizan el pardeamiento pertenecen a las óxido-reductasas, y se

conocen con diferentes nombres: monofenol oxidasa, tirosinasa y fenolasa; esta
última es la más aceptada y cuyo nombre corresponde a la o-difenol-oxígeno-óxido-
reductasa (E.C. 1.14.18.1 usualmente llamada, PPO) (2). La PPO cataliza el paso
inicial de la oxidación de o-fenoles a o-quinonas, los cuales sufrirán más adelante
polimerización para producir pigmentos insolubles y oscuros reconocidos como
melaninas responsables del color (3).

El pardeamiento enzimático también está involucrado con la pérdida en el valor

nutricional debido a la oxidación del ácido ascórbico
2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

- Determinar los parámetros cinéticos de pardeamiento enzimático
- Determinar los parámetros cinéticos de la inhibición de pardeamiento
enzimático

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Extraer la enzima Polifenol Oxidasa (PPO)
- Ensayo de la actividad de la enzima PPO
- Determinar los parámetros cinéticos de inhibición por medio de actividad
térmica
- Determinar la actividad de inhibidores

3. MATERIALES
3.1. INSTRUMENTOS
- Fruta
- Matraz
- Bureta
- Pipeta
- Vaso precipitado
-

3.2. SOLUCIONES
- Polietilenglicol
- Fosfato diácido de potasio tri hidrato (K2HPO4.3H2O)
- Fosfato de sódio monohidrato (NaH2PO4.H2O)
- Ácido ascórbico, sulfato de amonio (NH4)2SO
- Hidrocloruro de dopamina 10-2M
- Buffer fosfato 0.1M pH 7.0
- Enzima o-difenol-oxígeno-óxido-reductasa E.C. 1.14.18.1
4. METODOLOGÍA
4.1. Extracción de la enzima
La extracción parcial se realizó con base en el procedimiento de Palmer (4) con
algunas modificaciones en la centrifugación y el detergente usado: en un
homogenizador (marca B. Braun) se mezclaron 2 g de la fruta madura y pelada
con 18 ml de buffer fosfato (0,1 M, pH 7.0), el cual, contenía detergente Triton
100X al 1%.

El homogenato fue centrifugado (centrífuga marca Heraeus) durante 25

minutos a 16.060 g y 4°C; el sobrenadante fue filtrado con papel filtro Schleicher
& Schuell 589/1. El filtrado se constituyó en el extracto enzimático utilizado en
el trabajo cinético. Durante todas las operaciones de extracción, las
temperaturas fueron inferiores a 4°C.

4.2. Ensayo de actividad de la PPO

La actividad de la enzima fue determinada siguiendo el método de Pizzocaro
modificado (5) ; se usó un espectrofotómetro Shimadzu UV-160ª y se hizo el
monitoreo a 420 nm y a 30°C. La mezcla de reacción consistió en 1 ml de buffer
fosfato 0.1 pH 6.0, 0.5 ml de dopamina (0.18 mol/L) y 0.25 ml de extracto de
enzima. El cambio en absorbancia fue registrado cada 15 s durante 3 min. La
porción lineal obtenida del gráfico de absorbancia en función del tiempo fue
usada para el cálculo de la actividad de la PPO. Una unidad de la actividad de
PPO fue definida como 0.001 DA420/min/ml. Todos los extractos fueron
analizados por triplicado.

4.3. Parámetros cinéticos de actividad térmica

El conocimiento de área tiene importancia práctica debido a que la decoloración
de las frutas y vegetales procesados puede ser evitada por inactivación térmica
de PPO.
Para esto se incubó soluciones de enzima a temperatura de 40 a 95°C por
minuto, luego se ensayó la actividad a 25°C. Los datos de la relación tiempo-
temperatura para la inactivación térmica ilustra el concepto de alta
temperatura, corto tiempo de procesamiento, la cual inactivo las enzimas al
tiempo que se evitó el crecimiento significativo del alimento. La temperatura
también puede ser determinada si se dispone de celdas termoestables.

4.4. Efecto de inhibidores

Se estudió la inhibición de la enzima usando ácido ascórbico (como referencia
comercial), isoespintanol, el compuesto bromado y el demetilado. Las
concentraciones del inhibidor fueron: 500 (máximo recomendado por la
norma)156, 1000 y 1500 ppm (concentraciones antes usadas para evaluar
inhibición de pardeamiento en frutas)157,158. En todos los casos el sustrato
oxidable fue dopamina 0,18 M en buffer fosfato 0,1 M. La actividad enzimática
se determinó mediante el método colorimétrico a 420 nm y una temperatura
de 30°C.
5. RESULTADOS
5.1. Actividad de la enzima

Para comprender el papel protector de los antioxidantes, se han propuesto dos

mecanismos principales. En el primero, los radicales libres remueven un átomo de
hidrógeno del antioxidante (ArOH) que, a su vez, se convierte en radical:

La alta estabilidad del radical ArO. corresponde a una mejor eficacia del antioxidante
ArOH.
El segundo mecanismo es la transferencia de un electrón, donde el antioxidante
puede dar un electrón al radical libre y convertirse en un catión radical.

En este caso, el radical catión es más estable y no reacciona con las moléculas del
sustrato.

5.2. Determinación de la inhibición

Para determinar el porcentaje de inhibición (% Inh) de la PPO se determinó

mediante la siguiente ecuación.

Donde, mx corresponde a la pendiente de la recta trazada para cada compuesto

a evaluar y mb corresponde a la pendiente de la recta trazada para cada
compuesto en el experimento enzima+sustrato sin inhibidor.
6. DISCUCIÓN

Controlar el pardeamiento es un desafío en la industria de frutas y verduras. Los

fabricantes de alimentos prefieren ahora los suplementos naturales, especialmente
los antioxidantes sin sulfito, debido a los riesgos para la salud que presentan,
especialmente para los pacientes con asma30. Así, existe una tendencia a
incrementar la sustitución de antioxidantes sintéticos por antioxidantes naturales
sin efecto tóxico. (6). En los últimos años, los compuestos fenólicos de origen vegetal
han sido objeto de estudio (7) y se ha identificado un gran número de sustancias con
amplio espectro de actividades funcionales, principalmente por su potencial
benéfico para la salud debido a su actividad antioxidante (8), por la presencia de
algunos de sus productos de degradación que son multifuncionales y pueden actuar
como agentes reductores, reaccionantes con radicales libres, quelantes y acciones
antimicrobianas (9) que los convierte en una nueva alternativa antioxidante.

Es importante enfatizar la necesidad de una caracterización PPO individual de cada

fruta. Como puede verse en los resultados, existen diferencias estadísticamente
significativas en la cinética y la inhibición de ambas fuentes del extracto enzimático
y, por lo tanto, no se puede suponer que el inhibidor de PPO en la matriz alimentaria
funcionará de la misma manera en la otra. Esto está en línea con informes recientes
de que se logró en una pequeña porción de frutas comestibles (manzana, pera,
melocotón, plátano y aguacate) para conocer el comportamiento de la PPO y sugerir
estrategias para inhibirla. (10)

Como parte de las recomendaciones, creemos que se necesitan estudios más

detallados de estas enzimas, determinando parámetros cinéticos que brinden mayor
información. Asimismo, es importante avanzar en la investigación sobre la
depuración y determinación de la estructura de la enzima, así como su funcionalidad
en relación con otros sustratos e inhibidores. También es importante determinar la
calidad nutricional de los alimentos después de su procesamiento a mediano y largo
plazo.

7. CONCLUSIONES
- Se logro se conseguir los objetivos de Extraer la enzima Polifenol Oxidasa
(PPO), ensayo de la actividad de la enzima PPO, determinar los parámetros
cinéticos de inhibición por medio de actividad térmica y determinar la
actividad de inhibidores mediante la metodología propuesta
8. CUESTIONARIO
a. Describa el mecanismo de acción de la PPO
Las enzimas que catalizan el pardeamiento y coloración de las frutas y
vegetales pertenecen a las óxido-reductasas, la PPO, es la más aceptada y su
nombre corresponde a la o-difenol-oxígeno-óxido-reductasa, usualmente
llamada PPO (2)
b. De qué manera influye la PPO en el procesamiento de alimentos.
La PPO cataliza el paso inicial de la oxidación de o-fenoles a o-quinonas, los
cuales sufrirán más adelante polimerización para producir pigmentos
insolubles y oscuros reconocidos como melaninas responsables del color (3).
El pardeamiento enzimático también está involucrado con la pérdida en el
valor nutricional debido a la oxidación del ácido ascórbico
c. Qué sustancias químicas son capaces de inhibir la actividad de la PPO.
Explique su acción
El uso de inhibidores es restringido teniendo en cuenta consideraciones
relevantes como la toxicidad, el efecto sobre las características
organolépticas y el costo. Los inhibidores de pardeamiento pueden ser
clasificados según el modo de acción en seis categorías, como:
• Agentes reductores: agentes sulfhídricos, ácido ascórbico y sus análogos,
cisteína, glutatión, etc.
• Acidulantes: ácido cítrico y fosfórico.
• Agentes quelantes: fosfatos, EDTA, ácidos orgánicos, etc.
• Agentes acomplejantes: ciclodextrina
• Inhibidores de enzimas: ácidos carboxílicos aromáticos, alcoholes alifáticos,
aniones, péptidos, resorcinol sustituido.
• Tratamientos enzimáticos: oxigenasas, o-metil transferasas, proteasas.
d. Diga qué moléculas puede utilizar como sustrato la PPO
Dependiendo de su especificidad sobre sus sustratos, se pueden agrupar en
tres tipos de enzimas:
• Cresolasa (EC. 1.14.18.1 monofenol monooxigenasa): Cuando hidroxila
monofenoles, y la segunda.
• Catecolasa o fenolasa (EC. 1.10.3.1, o-difenol: oxígeno óxido-reductasa):
Cuando oxida difenoles a quinonas
• p-difenoloxidasa o laccasa
e. Describa la función fisiológica de las PPO
La enzima cataliza dos reacciones porque en el estado nativo se encuentra
en dos formas distintas: la llamada met-tirosinasa, que es activa solamente
sobre monofenoles, y la oxi-tirosinasa. Estas formas se interconvierten entre
ellas, de forma acoplada al desarrollo de las reacciones que catalizan (11). La
característica estructural más importante de estas enzimas es la presencia en
su centro activo de dos iones de cobre, Cu1+ (figura 1), unidos cada uno de
ellos a dos (12). En su entorno se sitúa una serie de aminoácidos hidrofóbicos,
con anillos aromáticos, que también son importantes en su actividad, para la
unión de los sustratos (11)
INVESTIGACIÓN DE APLICACIÓN
CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DEL ENZIMA POLIFENOL OXIDASA EN FRUTAS
TROPICALES: IMPLICACIONES EN SU PROCESO DE INDUSTRIALIZACIÓN (13)
En este trabajo se hace una caracterización preliminar del enzima Polifenol Oxidasa
(PPO), responsable del deterioro nutricional de Physalis peruviana L (uchuva) y Solanum
hirtum X Solanum quitoense (lulo), frutas de alto potencial en mercados internacionales.
Para ello, se evalúan la cinética de reacción de un extracto enzimático concentrado y la
capacidad inhibitoria de compuestos obtenidos a partir de fuentes naturales. Las
diferencias entre los PPO del extracto enzimático de lulo y uchuva, con valores de
velocidad de reacción de 1,32x10- 4 ±1,15x10-51 y 9,83x10-3 ±1,49x10-4
respectivamente, podrían estar relacionadas con una mayor cantidad del enzima en lulo.
Por otra parte se hace un análisis del porcentaje de inhibición y una medición de
absorbancia a punto final, para determinar no solo la capacidad inhibitoria sino también
tener una aproximación a la duración de su efecto en el tiempo.
9. BIBLIOGRAFÍA
1. Pizzocaro D, Gilardi G. Inhibition of apple polypheoloxidase (PPO) by ascorbic acid, citric
and sodium chloride. Journal. 1993; 17: p. 21-30.

2. YANG S, et al. Purification and characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa
sapientum L,) pulp. Agric. Food Chem. 2000; 48: p. 2732-2735.

3. Marshall M, Kim J, Cheng-I W. Enzymatic browning in fruits, vegetables and seafoods.

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Plant Extracts Containing. Agric. Food Chem. 1999; 47: p. 3954-3962.

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oxidative mechanisms in fruit and vegetables. Oxford: Clarendon Press. 1997;: p. 51-85.

10. Rocha M, Morais AM. Characterization of polyphenoloxidase (PPO) extracted from

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11. Calvo M. Bioquímica de los alimentos. Acribia, S. A. 2002.

12. Belitz H, Schieberle P. Food Chemistry. Segunda ed. Zaragoza: Zaragoza: Acribia; 2004.

13. Muñoz Durango K, Bravo Muñoz K, Zapata Ocampo P, Londoño Londoño J. Caracterización
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14. Badui Deral S. Química de alimentos. Naucapal de Juaréz:; 2013.