Clonación posicional 285

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Clonación posicional

Lin Xu y Yefu Li

1. Introducción
Un gen de enfermedad genética puede identificarse mediante tres enfoques: (1) Clonación funcional en la que se
identifica un gen de enfermedad basándose en los antecedentes biológicos de una enfermedad y la función del gen sin
conocimiento de la posición cromosómica del gen, por ejemplo, identificación de la globina. mutaciones genéticas
responsables de ciertas formas de anemia. Esta estrategia de clonación se basa en gran medida en información detallada de
la enfermedad y el gen. Sin embargo, dicha información no está disponible para la mayoría de los trastornos de un solo gen
en humanos. (2) La clonación posicional de genes candidatos es otro enfoque que puede usarse para identificar un gen de
enfermedad. Esta técnica combina información de la ubicación cromosómica de un locus de la enfermedad y un locus de un
gen candidato. Una vez que la enfermedad y un loci de genes candidatos se colocalizan en la región cromosómica, el gen
será luego clonado y secuenciado. Recientemente, hemos mapeado dos trastornos genéticos del ratón, la condrodisplasia ( cho)
a α 1 de colágeno tipo XI ( Col11a1) locus en el cromosoma 3 y micromelia desproporcionada ( Mmm) a α 1 colágeno tipo II ( Col2a1)
locus en el cromosoma 15. Hemos identificado la mutación en cho, que es una deleción de un residuo de citosina en la
región codificante de Col11a1 ARNm ( 1). En Mmmm una deleción de tres nucleótidos en la región codificante de Col2a1 Se
encontró ARNm ( 2). ( 3) La clonación posicional es un método mediante el cual se puede clonar un gen de la enfermedad
con la única información de su ubicación física en un cromosoma. Debido a que se han desarrollado mapas de cromosomas
de alta densidad de marcadores polimórficos de humanos y ratones y están disponibles bibliotecas de levaduras, bacterias y
cromosomas artificiales de fase de humanos y ratones, la clonación posicional de un gen de la enfermedad se puede lograr
en un período de tiempo razonablemente corto. En 1986, el primer gen de enfermedad genética humana, la enfermedad
granulomatosa crónica, fue identificado mediante clonación posicional ( 3). Desde entonces, el número de genes de
enfermedades clonados mediante esta técnica ha aumentado de forma espectacular. La estrategia experimental de la
clonación posicional incluye tres pasos básicos ( 4). El primer paso es establecer un mapa de ligamiento genético fino de un
locus del gen de una enfermedad mediante la identificación de marcadores que están cerca del gen. Actualmente, se han
asignado a los cromosomas 6580 marcadores polimórficos de repetición en tándem cortos de ratón y 5264 humanos y 797
marcadores polimórficos de longitud de fragmentos de restricción de ratón y están disponibles ( 5,6). Esto hace posible
mapear un gen de interés dentro de 1 cM. El segundo paso es construir un mapa físico del locus del gen. Cromosoma
artificial de levadura (YAC) ( 7,8), bacteriano

De: Methods in Molecular Biology, vol. 136: Protocolos de biología del desarrollo, vol. II
Editado por: RS Tuan y CW Lo © Humana Press Inc., Totowa, Nueva Jersey

285
286 Xu y Li

cromosoma artificial (BAC) ( 9,10), y cromosoma artificial derivado del fago P1 (PAC) ( 11-13) Muchos
laboratorios han utilizado bibliotecas para definir una región genómica que contiene genes de interés. El
tercer paso es buscar el gen en la región genómica definida mediante las técnicas de selección de ADNc ( 14-16),
atrapamiento de exones
(17-19), o búsqueda de islas GpC ( 20). Aunque los protocolos descritos en este capítulo se han desarrollado
para el ratón, también podrían adaptarse a otras especies, como ratas, peces cebra e incluso humanos, con
la excepción del plan de reproducción.

2. Materiales

2.1. Para aislamiento de ADN genómico para análisis de ligamiento genético

1. Tampón de digestión de tejidos: 100 m METRO Tris-HCl pH 8,5, dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,2%, 5 m METRO

EDTA pH 8.0, 200 m METRO NaCl, proteinasa K

2. Isopropanol
3. 10 m METRO Tris-HCl pH 8.0, 1 m METRO EDTA pH 8,0.

2.2. Para amplificación de reacción en cadena de la polimerasa para análisis de ligamiento

genético

1. Cebadores para marcadores de ADN polimórficos, disponibles comercialmente en Research Genetics (Huntsville, AL).

2. Kit de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), disponible comercialmente de Perkin Elmer (Norwalk, CT).

3. Agarosa para biología molecular de Gibco-BRL (Grand Island, NY).

2.3. Para el aislamiento de ADN de YAC

1. Biblioteca de ratón YAC, disponible comercialmente en Research Genetics.

2. Extracto de levadura, peptona, dextrosa (YPD) medio, 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 900 ml de agua y esterilizar en

autoclave durante 20 min, luego agregar 100 ml esterilizados de dextrosa al 20% (p / v) Sorbitol, citrato de sodio, EDTA (SCE ), 1 METRO

3. sorbitol, 100 m METRO citrato de sodio, 60 m METRO

EDTA pH 8.0
4. Solución # 1, SCE, 14 m METRO β- mercaptoetanol, 80 unidades / mL de líticasa 50 m METRO Tris-HCl
5. pH 8.0, 20 m METRO EDTA pH 8.0 SDS al 20%
6.
7. 5 METRO acetato de potasio pH 4,8
8. Isopropanol
9. Etanol
10. 10 m METRO Tris pH 8.0, 1 m METRO EDTA pH 8.0 RNasaA

11.
12. 3 METRO Acetato de sodio

2.4. PCR inversa

1. Enzimas de restricción de endonucleasas
2. Fenol y cloroformo
3. 3 METRO Acetato de sodio

4. etanol

5. Ligasa de ADN de grado de biología molecular de

6. agarosa

7. Pares de cebadores de PCR inversos del kit de amplificación de PCR de los brazos

8. derecho e izquierdo de YAC

9. Kit de secuenciación de ADN (si es necesario)

Clonación posicional 287

2.5. Selección de ADNc

1. Kit de amplificación por PCR

2. Un par de cebadores de PCR que flanquean el Eco Sitio de subclonación RI de λ gt10 Centricon
3. 100 (Amicon [Millipore, Bedford, MA])
4. Agarosa para biología molecular
5. Kit de purificación de ADN de Bio-Rad (Hercules, CA)
6. 20X SSC (175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio, pH 7,0, en 1 L de agua) Filtro
7. Hybond-nylon + (Amersham, Arlington Heights, IL)
8. 0,5 METRO NaOH, 1,5 METRO NaCl

9. 0,5 METRO Tris-HCl pH 7.5, 1.5 METRO NaCl

10. 50X Denhardt's (10 g de Ficoll, 10 g de poli (vinilpirrolidona), 10 g de albúmina de suero bovino en 1 L de agua)

11. SDS al 0,5%

12. 2X SSC / SDS al 0,1%

13. 1X SSC / SDS al 0,1%
14. 0.2X SSC / 0.1% SDS
15. 0.1X SSC / 0.1% SDS
dieciséis.
Kit de amplificación por PCR

17. Agarosa para biología molecular

18. Un par de cebadores dentro del primer par de cebadores que flanquean el Eco Sitio de subclonación de RI del λ gt10 (si es
necesario)
19. Kit de clonación TA de Invitrogen (Carlsbad, CA)

2.6. Atrapamiento de exones

Consulte el protocolo proporcionado por Gibco-BRL para sistemas de captura de exones.

2.7. Identificación de fragmentos de cDNA de interés

Zoo Blot de Clontech (Palo Alto, CA).

3. Métodos
3.1. Establecimiento de un mapa de vínculos genéticos de alta resolución de un lugar de
interés

El primer paso en la clonación posicional de un gen de interés es establecer un mapa de ligamiento genético de
alta resolución del locus del gen. Se puede lograr un mapa de enlace de alta resolución con al menos 300 meiosis
informativas en el mouse; ciertamente, cuantas más meiosis y marcadores polimórficos tenga, mayor será la
resolución del mapa que obtendrá. Para tener un número suficiente de marcadores polimórficos, es necesario
establecer un plan de reproducción de ratones ( ver Nota 1). Por ejemplo, si se quiere identificar un gen mutante
recesivo que surgió originalmente de la cepa de ratón C57BL / 6j, el mejor plan de reproducción es el siguiente:

F 0 C57BL / 6j / C57BL / 6j × Reparto / Ei / Reparto / Ei F 1 C57BL /

6j / CAST / Ei × C57BL / 6j / CAST / Ei F 2 C57BL / 6j / C57BL / 6j
(fenotipo mutante)
Esto se debe a que el nivel de polimorfismo de los marcadores de ADN entre C57BL / 6j y CAST / Ei es
aproximadamente del 93%, lo que significa que el 93% de los marcadores de ADN entre estas dos cepas son polimórficos.
Este plan de reproducción se llama entrecruzamiento interespecífico. La base para utilizar el plan de reproducción cruzada
para identificar un gen mutante recesivo
288 Xu y Li

es que la mutación es recesiva y ambos padres F1 heterocigotos son fértiles y los ratones mutantes F2
homocigotos pueden identificarse fácilmente poco después del nacimiento. Otra ventaja de esta
reproducción es que cada animal mutante F2 proviene de dos eventos meióticos informativos con
frecuencia recombinante promediada por sexo. Esto proporcionará el doble de información recombinante
de cada animal en comparación con la reproducción retrocruzada. En algunos casos, la cepa de ratón
CAST / Ei apenas se reproducirá con otra cepa de ratón. Alternativamente, se puede hacer un plan de
reproducción entre C57BL / 6j y una de las cepas de ratón endogámicas, como DBA. Teniendo en cuenta
el nivel de polimorfismo de los marcadores de ADN entre C57BL / 6j y DBA (aproximadamente el 50%),
se podrían utilizar dos cruces interespecíficos diferentes para compensar un nivel de polimorfismo
relativamente bajo.

En la cría de ratones, si los padres homocigotos son fértiles, también se podría hacer un plan de retrocruzamiento
entre uno de los padres homocigotos y la descendencia F1 heterocigótica.
F 0 C57BL / 6j / C57BL / 6j × CAST / Ei / CAST / Ei (fenotipo mutante) F 1 C57BL / 6j / CAST /
Ei × F 0 C57BL / 6j / C57BL / 6j (fenotipo mutante) F 2 C57BL / 6j / C57BL / 6j (fenotipo
mutante)
Hay dos ventajas en esta reproducción: (1) el 50% de los F2 serán homocigotos informativos y (2) debido a
que existe una interferencia genética durante la recombinación cromosómica, el orden de los marcadores en
los cromosomas debería ser más confiable.
En este capítulo, usamos una mutación recesiva de ratón como ejemplo para describir las estrategias
experimentales. Para una mutación dominante en el ratón, los procedimientos experimentales son los mismos si los
heterocigotos pueden reproducirse entre sí. Sin embargo, si los heterocigotos no pueden reproducirse entre sí, el plan de
retrocruzamiento o una tercera cepa de ratón endogámico podría usarse en la reproducción:

F 0 C57BL / 6j / C57BL / 6j × CAST / Ei / CAST / Ei (fenotipo mutante) F 1 C57BL / 6j /

CAST / Ei × DBA / DBA (fenotipo mutante) F 2 C57BL / 6j / DBA (fenotipo mutante)

En este caso, cada mutante F2 (heterocigoto) representa solo una meiosis informativa.

3.1.1. Aislamiento de ADN genómico para análisis de ligamiento genético

1. Recolecte 0,5-1 cm de cola de animales mutantes F2 recortando la cola.

2. Coloque la cola en un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contenga 0,5 ml de la solución, 100 m METRO de Tris pH 8.5, 5 m METRO
de EDTA pH 8.0, 0.2% de SDS, 200 m METRO de NaCl, y 100 μ g de proteinasa K / mL.

3. Incubar el tubo a 55 ° C 6 h hasta la noche. Centrifugue el tubo a 10,000 gramo con la centrífuga Eppendorf a 4 ° C
4. durante 15 min. Transfiera la solución a un tubo Eppendorf limpio y fresco que contenga 0,5 ml de isopropanol. Mezcle
5. la solución y el isopropanol inmediatamente.
6.
7. Deje el tubo a temperatura ambiente durante al menos 30 min. Saque el ADN
8. precipitado con una punta de pipeta limpia. Transfiera el ADN a un nuevo tubo que
9. contenga 100 μ Tampón L TE.
10. Cuantifique las muestras de ADN y haga alícuotas de trabajo para PCR, 50 ng / mL

3.1.2. Marcadores polimórficos para análisis de ligamiento genético

La mayoría de los marcadores están disponibles comercialmente en Research Genetics ( ver Nota 2
y 3). Inicialmente, el número de marcadores utilizados para una búsqueda de todo el genoma dependerá
Clonación posicional 289

sobre cuántos animales mutantes F2 (meiosis informativas) se seleccionarán mediante PCR. Por ejemplo, se puede comenzar a
genotipar 20 animales mutantes F2 (40 meiosis informativas) y usar aproximadamente 70 marcadores de ADN, cubriendo
uniformemente todo el genoma del ratón, lo que corresponde a aproximadamente 3000 cM (hay un marcador en cada 40 cM).

El análisis de PCR se realizará en 20- μ L volumen de reacción de tampón de PCR 1X que contiene 100 ng de ADN
genómico, 1 μ METRO de cada imprimación, 0,2 μ METRO de cada dNTP, y
0,25 U de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Las condiciones de amplificación serán 94 ° C
durante 2 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 45 s, 72 ° C durante 45 s, y una extensión final de 10
minutos a 72 ° C. Los productos de la PCR se someterán a electroforesis en un gel de agarosa al 4% (Gibco-BRL).

Debería identificarse un marcador o varios marcadores que representen un locus procedente originalmente de la
cepa de ratón mutante (es decir, portado por la mayoría o todos los ratones mutantes F2). En otras palabras, en la
mayoría o en todos los animales mutantes homocigotos F2 sólo debe observarse un tamaño de banda de ADN que
represente a la cepa de ratón mutante. Para el análisis de heterocitos F2 en un trastorno dominante, se observan
dos tamaños diferentes de marcadores de ADN en todos los heterocitos F2. Sin embargo, deben identificarse uno o
varios marcadores originarios de la cepa mutante. Una vez que se definen el marcador o marcadores, se
examinarán más marcadores que rodean el locus y más animales mutantes F2 para buscar un marcador o
marcadores que se acerquen más a la mutación.

3.2. Construcción de un mapa físico (YAC Contig) de un locus

Un mapa físico de un locus en un cromosoma consta de varios fragmentos de ADN superpuestos. El
tamaño de un locus puede ser de hasta un millón de pares de bases. Por lo tanto, se requiere una biblioteca
genómica construida usando un vector que sea capaz de transportar un inserto de ADN grande. La
disponibilidad de las bibliotecas YAC, BAC y PAC lo ha hecho posible. Los tamaños medios de las
inserciones de ADN son diferentes en las bibliotecas: 1 millón de pares de bases en el YAC, 500 mil pares de
bases (500 kb) en BAC y 100 kb en PAC. Cada uno de ellos tiene ventajas y desventajas. Por ejemplo,
aunque el YAC tiene insertos de ADN más grandes, existe un porcentaje relativamente alto (10-60%) de
clones de ADN quimérico en las bibliotecas de YAC. Una de las ventajas de BAC y PAC es que el número de
clones de ADN quimérico es mucho menor, porque los tamaños de los insertos de ADN son más pequeños.
Por lo tanto, ver Nota 4).

Una vez que se definen los marcadores / marcadores más cercanos a un locus de enfermedad, se
deben usar para buscar la información de los contigs YAC de varios centros de investigación del
genoma; por ejemplo, el Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research. Si no existen contigs
de YAC, entonces se deben usar los marcadores más vinculados para examinar las bibliotecas de YAC
y / o BAC de ratón para construir un mapa físico del locus mutante. Las bibliotecas de ratón YAC y BAC
están disponibles comercialmente en Research Genetics. Los clones YAC o BAC correspondientes a los
marcadores se aislarán de las bibliotecas mediante PCR siguiendo el protocolo detallado proporcionado
por Research Genetics. Para construir un contig YAC (varios clones YAC superpuestos), es necesario
identificar los extremos de los clones YAC, que luego deben usarse como sondas para buscar clones
superpuestos. Finalmente, 21) y caracterizado por mapeo de enzimas de restricción de endonucleasas.
290 Xu y Li

3.2.1. Aislamiento de ADN de YAC

1. Cultivar el clon YAC en 5 mL de YPD a 30 ° C, agitando a 250 rpm durante la noche. Transfiera los 5 mL del cultivo
2. a un matraz con deflectores que contenga 50 mL de YPD. Continuar incubando a 30 ° C, agitando a 250 rpm
3. durante 1 o 2 d. Centrifugue el cultivo de 50 mL a 1500 gramo con una centrífuga de mesa durante 10 min.
4. Resuspender el sedimento en 20 mL de SCE en un tubo de 50 mL.
5.
6. Centrifugue los 20 mL del SCE a 1500 gramo con una centrífuga de mesa durante 10 min. Resuspenda el sedimento
7. en 4,5 ml de solución 1.
8. Incubar a los 37 ° C durante 60 min. Centrifugue el tubo a 1500 gramo con una centrífuga de mesa durante

9. 5 min. Resuspender en 5 mL de 50 m METRO Tris pH 8.0 y 20 m METRO EDTA pH 8,0. Agregar 250 μ L de

10. SDS al 20% y mezclar bien para lisar las células de levadura. Incubar a los 65 ° C durante 30 min. Agregue

11. 2 mL de 5 METRO acetato de potasio, pH 4,8. Incubar en hielo durante 60 min.

12.
13.
14.
15. Centrifugar a 1500 gramo con una centrífuga de mesa durante 10 min. Transfiera el

dieciséis.
sobrenadante (aproximadamente 7 ml) a un tubo nuevo. Centrifugar el sobrenadante a

17. 1500 gramo durante 5 min.

18. Transfiera aproximadamente 6 ml del sobrenadante a un tubo nuevo (asegúrese de no tomar ninguna de las proteínas precipitadas).

19. Agregue 6 mL de isopropanol a temperatura ambiente y mezcle bien. Deje el tubo a

20. temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugue el tubo a 1500 gramo durante 5
21. min. Deseche el sobrenadante.
22.
23. Lavar el sedimento con 5 mL de etanol al 70%. Centrifugue el tubo a 4000 gramo a
24. temperatura ambiente durante 5 mi
25. Deseche el etanol y seque el sedimento a temperatura ambiente durante 5 a 10 min. Resuspender el
26. sedimento en 1 ml de tampón TE.
27. Trate el ADN de YAC con 50 μ g RNasaA a 37 ° C durante 60 min para destruir los ARN. Precipitar el ADN con 1/10 de
28. volumen de 3 METRO acetato de sodio y 2,5 volúmenes de etanol al 100%.

29. Disuelva el ADN en 1 mL de tampón TE.

El ADN de YAC está listo para la PCR inversa.

3.2.2. PCR inversa

La PCR inversa se utiliza para aislar los extremos de los clones YAC. Hay muchos protocolos experimentales de
recuperación de extremos de clones YAC o BAC ( ver Nota 5). Se ha informado que la PCR inversa tiene la mayor
eficiencia en la recuperación de los extremos ( 22). En nuestro laboratorio, hemos aislado con éxito los extremos YAC de
ratón mediante PCR inversa con una eficiencia de aproximadamente el 80%. Básicamente, se sintetizan un par de
cebadores de oligonucleótidos inversos del brazo izquierdo o derecho de YAC. Los ADN de YAC se digieren con una
combinación de dos o tres enzimas de restricción de endonucleasas ( ver Nota 6) y luego ligado en condiciones que
favorecen la circularización de los fragmentos de YAC digeridos (20-200 ng del ADN de YAC digerido y ligado a
temperatura ambiente durante la noche). Las enzimas de restricción no deberían reconocer ninguna secuencia de ADN
entre los cebadores y los sitios de clonación YAC originales. La PCR se realiza con los fragmentos de ADN
circularizados como plantillas y un par de cebadores de cada brazo de vector. Los productos de PCR contienen
Clonación posicional 291

unión de clonación entre los brazos del vector y las inserciones de ADN genómico de ratón (extremos de los clones YAC).

1. Digerir 200-500 ng del ADN YAC con una combinación de dos o tres enzimas de restricción de endonucleasas con sus
tampones apropiados a 37ºC. ° C durante la noche. Agregue agua destilada al tubo para obtener un volumen final de
2. 500 mL. Extraiga el ADN digerido con 250 μ L fenol y 250 μ L cloroformo. Transfiera la solución superior a un tubo
3. Eppendorf nuevo.
4.
5. Agregue 1/10 del volumen de 3 METRO acetato de sodio y 2,5 volúmenes de etanol. Deje el tubo a –20 ° C
6. durante la noche.
7. Centrifugar con centrífuga Eppendorf a 10.000 gramo durante 20 min. Lavar el
8. sedimento de ADN con 0,5 ml de etanol al 70%. Centrifugar con centrífuga
9. Eppendorf a 10.000 gramo durante 2 min. Disuelva los ADN en 30 μ L de agua
10. destilada.
11. Cuantificar la concentración de ADN mediante electroforesis en gel. Use 50 ng
12. del ADN digerido para volver a ligar
condición de re ligadura: 1 μ L de ligasa (4 U)
2 μ L de tampón de ligación Agua hasta el
volumen final 20 μ L
13. Incube el tubo a temperatura ambiente durante la noche.
14. Agregue agua destilada al tubo para un volumen final de 400 μ L. Agregue 1/10 del volumen de 3 METRO
15. acetato de sodio y 2,5 volúmenes de etanol. Deje el tubo a –20 ° C durante la noche.
dieciséis.

17. Centrifugar con centrífuga Eppendorf a 10.000 gramo durante 20 min. Lavar el sedimento de ADN con 0,5
18. ml de etanol al 70%. Centrifugar con centrífuga Eppendorf a 10.000 gramo durante 2 min. Disuelva los
19. ADN en 20 μ L de agua destilada lista para amplificación por PCR.
20.
21. Sintetizar un par de cebadores oligonucleotídicos del brazo izquierdo o derecho de YAC (la dirección de los dos cebadores es
opuesta y están separados por 20 a 50 pares de bases; por eso se llama PCR inversa). Análisis de PCR: la PCR se realizará en
22. un 50- μ L volumen de reacción de tampón de PCR 1X que contiene 5 μ L del ADN circularizado, 1 μ METRO de cada cebador de
brazo YAC, 0.2 μ METRO de cada dNTP, y 0,25 unidades de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim). Las condiciones de
amplificación fueron 94 ° C durante 2 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1,5 min y
una extensión final de 10 min a 72 ° C. Los productos de la PCR se someterán a electroforesis en un gel de agarosa al 2%
(Gibco-BRL) y se analizarán mediante secuencia directa de ADN. Los productos de PCR contienen la unión de clonación entre los
brazos del vector y los insertos de ADN genómico de ratón (extremos de los clones YAC).

3.3. Clonación de un gen de interés

Cuando se identifican los clones de YAC, se debe verificar la estructura interna de cada clon de YAC. Si un
clon YAC es quimérico o no, podría examinarse mediante PCR. Por ejemplo, si el clon YAC es reconocido por
cebadores de PCR de los extremos de sus clones superpuestos, es probable que el clon YAC no sea quimérico.
Una vez definidos los clones YAC que cubren el locus mutante, se deben considerar dos métodos de clonación
molecular para identificar un gen de interés en este protocolo, la selección de ADNc y la captura de exón.

3.3.1. Selección de ADNc

El método de selección de cDNA es un enfoque para identificar secuencias de cDNA expresadas de un clon
YAC que contiene genes de interés. Aunque el principio subyacente es
292 Xu y Li

del mismo modo, hay varias formas diferentes de identificar los ADNc del YAC. A continuación, describimos el
procedimiento de selección de híbridos con un disco de filtro de nailon. Brevemente, los ADNc de doble hebra hechos a
partir de ARNm de embriones de ratón normales se subclonan en
λ gt10. Los ADNc se amplifican luego por PCR con un par de cebadores que flanquean el Eco Sitio de clonación de RI. Los
ADNc se hibridan con los fragmentos del YAC definido en un disco de filtro de nailon. Después de la hibridación, los
ADNc hibridados se eluyen y amplifican mediante PCR. Los detalles de este protocolo son los siguientes.

3.3.1.1. PAGS REPARACIÓN DE C ADN S CON K NOWN S EQUENCIAS EN mi NDS

ADNc bicatenarios ( ver Nota 7 y 8) originalmente cebados con cebadores aleatorios se subclonan en λ gt10 para
construir una biblioteca de ADNc. Un procedimiento para construir la biblioteca de ADNc aleatorio se ha descrito bien en árbitro.
23. El sitio de subclonación de λ gt10 es el Eco Sitio de restricción de RI. Una vez que se crea la biblioteca, los ADNc se
amplifican mediante PCR. Las condiciones de la PCR son las siguientes: La PCR se lleva a cabo en un tubo de PCR de 0,2
mL que contiene 100 μ L volumen de reacción de 1 X tampón de PCR que contiene 20 ng de ADN de fago, 1 μ METRO de
cada cebador (un par de cebadores que flanquean el sitio de clonación EcoRI, cada cebador a 30 pares de bases del sitio
de subclonación y de un tamaño entre 18 y 24 meros y), 0,2 μ METRO de cada dNTP, y 0,25 unidades de Taq polimerasa
(Boehringer Mannheim). Las condiciones de amplificación son 94 ° C durante 2 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 1
min, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min y una extensión final de 10 min a 72 ° C. Para obtener suficientes productos de
PCR, se pueden configurar de 5 a 10 reacciones de PCR. A continuación, los productos de PCR se concentran mediante
Centricon 100 (Amicon), seguido de electroforesis en un gel de agarosa al 2% (Gibco-BRL) y la recolección de fragmentos
de ADN entre 0,5 y 2 kb utilizando un kit de purificación de ADN (Bio-Rad).

3.3.1.2. PAGS URIFICACIÓN DE ADN de YAC

Debido a que el ADN de YAC aislado por el protocolo descrito anteriormente también contiene ADN genómico de
levadura, el ADN de YAC debe purificarse antes de la hibridación. Esto podría lograrse mediante electroforesis en gel de
campo pulsado. Para un procedimiento detallado de purificación de YAC por electroforesis, uno puede referirse al
capítulo 5 en Current Protocols in Human Genetics.

3.3.1.3. yo MOVILIZACIÓN DEL ADN de YAC EN norte YLON re ISKS

1. Caliente el tubo que contiene 5-10 μ L de ADN YAC purificado (20 ng / μ L) a los 95 ° C durante 3 min. Enfriar sobre hielo.
2.
3. Agregue 20X SSC pH 7 para hacer una solución final de 6X SSC. Corte el filtro Hybond-nailon + (Amersham) en 5 mm × Cuadrados
4. de 5 mm. Transferencia 1 μ L de la solución de ADN en el disco de filtro (haga un marcador para distinguir el lado de unión del
5. ADN).

6. Seque el disco a temperatura ambiente durante 5 min.

7. Desnaturalice el ADN haciendo flotar el disco en la solución de 0,5 METRO NaOH, 1,5 METRO NaCl durante 2 min.

8. Neutralizar el disco en la solución de 0.5 METRO Tris, pH 7,5 y 1,5 METRO NaCl durante 1 min. Lave el disco flotando
9. en una solución de 5X SSC durante 2 min.
10. Inmovilice el disco dejándolo al vacío a 80 ° C durante 30 min.

El disco está listo para la prehibridación.

Clonación posicional 293

3.3.1.4. Q DESACTIVANDO EL norte YLON re ISK CON EL Y ESTE GRAMO ENÓMICO ADN S
POR PAGS REHIBRIDACIÓN

1. Prepare la solución de prehibridación: 6X SSC

5X Denhardt's
SDS al 0,5%

ADN genómico de levadura 40 ng / μ L (El ADN genómico de una cepa de levadura utilizada para la construcción de la
biblioteca YAC puede aislarse mediante el procedimiento descrito anteriormente. El ADN genómico debe cortarse
utilizando una jeringa con una aguja de calibre 18).
2. Precaliente la solución a 65 ° C durante 30 min.
3. Coloque el disco en un tubo Eppendorf que contenga 50–100 mL de la solución.
4. Incubar el tubo a 65 ° C durante al menos 1 h.
5. Lave el disco brevemente con 6 X SSC.

El disco está listo para la hibridación.

3.3.1.5. H BRIDIZACIÓN DEL re ISKS CON LA C ADN L IBRARIO

1. Transfiera el disco a un tubo nuevo que contenga 50 μ L de la solución de prehibridación.

2. Agregue al tubo los ADNc de doble hebra preparados anteriormente (un total de 250 a 500 ng).
3. Hibridar a los 65 ° C durante 24 a 48 h con rotación.
4. Lava el disco.
2X SSC / 0.1% SDS, dos veces a temperatura ambiente 2X SSC / 0.1%
SDS, dos veces a 65 ° C durante 15 min 1X SSC / SDS al 0,1%, una vez a
los 65 ° C durante 15 min
0.2X SSC / 0.1% SDS, una vez a los 65 ° C durante 15 min
0.1X SSC / 0.1% SDS, dos veces a 65 ° C durante 15 min
5. Transfiera el disco a un nuevo tubo de PCR de 0,2 ml que contenga 50 μ L de agua destilada.
6. Caliente el PCR a 95 ° C durante 5 min.
7. Enfríe y haga girar el tubo.
8. Mantener en hielo.

La solución está lista para la reacción de PCR.

3.3.1.6. PCR A MPLIFICACIÓN U CANTA norte ESTED PAGS LLANTAS

Las condiciones de la PCR son las siguientes: La PCR se puede realizar en un tubo de PCR de 0,2 mL que contenga 50 μ L de
volumen de reacción de tampón de PCR 1X que contiene 25 μ L de la solución eluida de arriba, 1 METRO de cada cebador
flanqueando Eco Sitio de subclonación de RI, 0,2 μ METRO
de cada dNTP, y 0,25 unidades de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim). Las condiciones de amplificación incluyen
94 ° C durante 2 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min y una
extensión final de 10 min a 72 ° C. Los productos de la PCR deben someterse a electroforesis en gel de agarosa al 2%
(Gibco-BRL).
En algunos casos, el producto de la PCR puede no ser detectado por un gel de agarosa debido a la baja cantidad
del producto de ADN. Por lo tanto, será necesaria una segunda ronda de PCR (PCR anidada) para generar suficiente
ADN. Porque hay una distancia de 30 pares de bases entre cada cebador y Eco En el sitio de subclonación de RI, podría
sintetizarse otro par de cebadores para la segunda ronda de PCR dentro del primer par de cebadores. Entonces, 5 μ L de
la primera ronda de PCR podría usarse para la amplificación de la segunda ronda de PCR. El producto final de la PCR
se podría subclonar en el vector TA para su análisis adicional.
294 Xu y Li

3.3.2. Atrapamiento de exones

Es posible que los ADNc no sean detectados por la selección de ADNc, especialmente si la cantidad de
transcripciones de ARNm de un gen es muy baja. Alternativamente, la captura de exones podría ser otro método
para identificar un gen de interés. Recientemente, Gibco-BRL ha establecido un sistema de captura de exones.
Básicamente, el método se divide en tres pasos: (1) Los ADN genómicos YAC se subclonan como Bam Hola y Bgl II
digiere en el vector de captura de exón pSPL3. (2) Se transfectan ADN de grupos de clones de pSPL recombinantes
seleccionados o minibibliotecas de escopeta completas en células COS-7 usando el procedimiento descrito en el
Sistema de captura de exones. Si la secuencia insertada tiene un exón en la orientación adecuada, el exón se
retiene en el ARN maduro flanqueado por la secuencia conocida de exones, tat de VIH y β- globina. (3) Los ARN
totales se aíslan 1-3 días después de la transfección y se realiza la RT-PCR del ARN mediante el uso de
oligonucleótidos correspondientes al flanco β- secuencia de globina.

1. Digerir 200 ng del ADN YAC purificado con una de las siguientes enzimas de restricción de endonucleasas: Eco RHODE ISLAND, Xho YO,
No YO, Xma III, Pst Yo y Bam HOLA. Incubar a los 37 ° C durante al menos 3 h.
2.
3. Extraiga el ADN con fenol / cloroformo una vez. Lave el sedimento
4. de ADN con 200 μ L de etanol al 70%. Disuelva el ADN en 10 μ L de
5. tampón TE.
6. Digerir 100 ng de ADN de vector pSPLs con la enzima utilizada en la digestión del ADN de YAC.

7. Trate el ADN de pSPL digerido con fosfatasa para la desfosforilación. Purificar el ADN mediante
8. electroforesis en gel de agarosa.
9. Reúna 100 ng del YAC digerido y 100 ng de los ADN del vector digerido para la ligación.
100 ng del YAC 100 ng del vector 2 μ L
de tampón de ligación 10 X 1 μ L de
ligasa (4 unidades) Agua hasta 20 μ L
Incubar a los 16 ° C durante la noche.

10.
11. Transfiera el plásmido YAC / pSPL3 a DH10B (Gibco-BRL). Amplificar y purificar los ADN del plásmido YAC / pSPL3
12. mediante miniprep. Transfectar 1 μ g de los ADN del plásmido YAC / pSPL3 en células COS-7 usando el reactivo Lipofectace
13. como se describe en el Sistema de captura de exones.

14. Aislar el ARN total con el reactivo Gibco-BRL Trizol después de 24 h de transfección. Utilice 2-4 μ g del ARN total para
15. la síntesis de ADNc de primera cadena. Realice la amplificación por PCR como se describe en el Sistema de captura
de exones
dieciséis.

3.3.3. Identificación de fragmentos de cDNA de interés

Cada uno de los productos de PCR obtenidos a partir de la selección de ADNc o de la captura de exón debe
secuenciarse y compararse con la información de la secuencia en las bases de datos de ADN utilizando el servicio
de red BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Los ADNc de los supuestos exones deben
marcarse como sondas para hibridar con ARNm de una variedad de especies (transferencia de zoo). Las
secuencias de los exones conservados deben hibridarse con la mayoría de las especies, incluido el ratón. Para
identificar la mutación, se determinarán las secuencias de ADN de los exones y se compararán entre los ratones
normales y mutantes.
Clonación posicional 295

4. Notas
1. Si uno planea identificar un gen mutante de una cepa de ratón distinta de las 12 cepas de ratón endogámicas (consulte el
catálogo de Research Genetics), debe determinar el nivel de polimorfismo de los marcadores de ADN entre las cepas de ratón
antes de la reproducción. Se pueden seleccionar varios marcadores de ADN distribuidos aleatoriamente en el genoma del
ratón y aislar los ADN genómicos de varias cepas de ratón de las 12 cepas endogámicas. Luego, el nivel de polimorfismo de
los marcadores de ADN debe determinarse realizando una PCR con los ADN genómicos y los marcadores de ADN. Para la
reproducción, se debe usar una cepa de ratón endogámica que proporcione un nivel de polimorfismo más alto entre la cepa
endogámica y la mancha mutante.

2. Los polimorfismos de los marcadores de ADN proporcionados por Genetic Research Inc. se basan en los tamaños de los
fragmentos de ADN (polimorfismo de longitud de secuencia simple [SSLP]). Si el tamaño de los marcadores es inferior a 4 pb, la
diferencia entre los marcadores debe detectarse en un gel de secuencia de poliacrilamida.

3. Algunos de los marcadores polimórficos solo pueden detectarse mediante polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP).

4. Para obtener tantos clones de YAC como sea posible para construir un mapa físico, se deben buscar los clones de
varias bibliotecas de YAC diferentes.
5. Se pueden combinar varios enfoques para recuperar los extremos de los clones YAC. En nuestro laboratorio utilizamos
también Alu PCR para buscar los extremos. Los cebadores que usamos para la PCR son CTTCTGGAGTGTCTGAAGAC,
GACTGCTCTTCCGAAGGTCC, CTGGAACTCAC TCTGAAGAC, GTTTACCACTTAGAACACAG y
TTTGCCGCACAAGATTCTGG. En la PCR inversa, se debe tener en cuenta que las enzimas de restricción utilizadas para
6. digerir los ADN no deben reconocer ninguna secuencia de ADN entre los cebadores y los sitios de clonación YAC originales.
Para la selección de ADNc, son muy importantes las fuentes de ARNm utilizadas para hacer una biblioteca de ADNc de
7. cebado aleatorio. Para identificar el gen de interés, los ARNm del gen deberían ser relativamente abundantes en la
población de ARNm.

8. Para construir una biblioteca de ADNc aleatoria para la selección de ADNc, se deben usar ARN totales para la síntesis de ADNc,
porque muchos ARNm se podrían perder durante el aislamiento de ARNm.

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a la National Arthritis Foundation, Atlanta, GA; la Fundación Médica Charles Hood,
Boston, MA; y Fundación de Crecimiento Humano, Falls Church, VA; por su generoso apoyo a este trabajo.

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