PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE

FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL

DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO
PROGRAMA DE POSTGRADO EN CIENCIAS DE LA AGRICULTURA
MAGISTER EN CIENCIAS ANIMALES
TESIS DE GRADO

AVANCES METODOLOGICOS ORIENTADOS A PREDECIR LA

APTITUD DE ESPECIES FORRAJERAS PARA SER ENSILADAS

ALEJANDRO TUSCHNER WALZ

ENERO 2004
SANTIAGO-CHILE
2
 PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE
FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL
DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO
PROGRAMA DE POSTGRADO EN CIENCIAS ANIMALES
MAGISTER EN CIENCIAS ANIMALES

AVANCES METODOLOGICOS ORIENTADOS A PREDECIR LA

APTITUD DE ESPECIES FORRAJERAS PARA SER ENSILADAS

Tesis presentada como requisito para optar al grado de

Magister en Ciencias Animales

por:

Alejandro Tuschner Walz

Comité de Tesis
Profesor Guía: Gastón Pichard D. Ing. Agr., Ph.D.
Profesores Informantes:
Antonio Hargreaves B. Ing. Agr., M.Sc., Ph.D.
Fernando Bas M. Ing. Agr., M.Sc., Ph.D.

Enero 2004
Santiago-Chile

3
 AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a la Pontificia Universidad Católica de Chile, especialmente al

departamento de Ciencias Animales y sus instalaciones, por haber permitido la
realización de este trabajo.

A don Gastón Pichard por haber compartido sus conocimientos y prestado el

fundamental apoyo para la formación profesional. También a Eduardo Leiva por su
ayuda en el laboratorio y a los profesores Antonio Hargreaves, Fernando Bas,
Rafael Larrain y Mónica Gandarillas por sus consejos.

4
A mis padres Luis y Sylvia
A Carolina y Alejandra
Al recuerdo de Matilde

5
INDICE
1.0 RESUMEN p 8
2.0 ABSTRACT p 9
3.0 INTRODUCCION p 10
4.0. REVISION BIBLIOGRAFICA p 12
4.1. Carbohidratos no estructurales p 12
4.1.1 Sustratos más comunes para la fermentación primaria en ensilajes. p 14
4.1.2 Concentraciones típicas de los distintos carbohidratos en los pastos. p 15
4.1.3 Factores que influencian el contenido de CS de pastos p 16
4.1.4 Cambios de los CS luego del corte p 18
4.1.4.1 Actividad de Polisacaridasas endógenas: Cambios durante el
premarchitamiento. p 19
4.1.4.2 Actividad de Polisacaridasas endógenas: Cambios durante el
período de ensilaje. p 21
4.1.4.3 Responsabilidad de la hemicelulosa en la variación de
azúcares p 22
4.1.4.4 Inhibición de actividad enzimática para medición de azúcares p 25
4.2 Poder Tampón y Caída de pH p 27
4.2.1 Generalidades del Poder Tampón o Buffer p 27
4.2.2 Fundamentos del poder Tampón. p 29
4.2.3 Responsables directos del poder buffer p 32
4.2.3.1 Proteínas y poder buffer p 36
4.2.4 Efectos de algunos manejos sobre el poder buffer: p 38
4.3.Valores de capacidad buffer de los forrajes. p 40
4.4 Microorganismos responsables de fermentaciones de los forrajes p 41
4.4.1 Contaminación epifítica de bacterias en forrajes. p 41
4.4.2 Responsables de las variaciones de bacterias epifíticas en forraje p 43
4.4.3 Variaciones de bacterias ácido lácticas en el forraje p 43
4.4.4 Variaciones de enterobacterias en el forraje p 44
4.4.5 Variaciones de clostridios en el forraje p 45
4.4.6 Hongos y levaduras en el forraje p 46
5 HIPOTESIS Y OBJETIVOS p 47
5.1 HIPOTESIS
5.2 OBJETIVO
5.3 OBJETIVOS ESPECIFICOS
6. MATERIALES Y METODOS p 48
6.1 ENSAYO 1: Metodología simplificada para la medición de la concentración de
azúcares fermentables presentes en forrajes frescos p 48
6.1.1. Metodología p 48
6.1.2. Sustratos utilizados p 49
6.1.3. Preparación de muestras p 49
6.1.4. Metodología analítica p 50
6.1.5 Comprobación de Sensibilidad de Metodología p 51
6.2 ENSAYO 2: EFECTO DEL PREMARCHITADO EN EL CONTENIDO DE
CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES p 51
6.2.1 Metodología p 51
6.2.2 Sustrato utilizado p 52
6.2.3 Equipamiento p 52
6.2.4 Tiempo de secado y muestreo p 52
6.2.5 Diseño experimental p 52

6
 6.2.6 Metodología utilizada para determinación de azúcares p 53
6.3 ENSAYO 3: EFECTO DEL PICADO Y LA INOCULACION EN LA VELOCIDAD
DE CAIDA DE pH EN DISTINTOS ENSILAJES p 53
6.3.1 Sustratos utilizados p 53
6.3.2 Elaboración de los microsilos, tamaño de picado, inoculación
y llenado p 53
6.3.3 Muestreo p 55
6.3.4 Diseño experimental p 55
6.4 ENSAYO 4: CAIDA INICIAL DE pH COMO PREDICTOR DEL pH EN EL
ENSILAJE ESTABILIZADO p 56
6.4.1 Sustratos utilizados p 56
6.4.2 Tamaño de picado, inoculación y llenado de los silos p 56
6.4.3 Equipamiento p 57
6.4.4 Muestreo p 57
6.4.5 Diseño experimental p 57
7 RESULTADOS Y DISCUSIONES p 58
7.1METODOLOGIA PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO DE
AZUCARES FERMENTABLES p 58
7.1.2 Medición de azúcares con reactivo de Somogyi p 59
7.2 EFECTO DEL PREMARCHITADO EN EL CONTENIDO DE
CARBOHIDRATOS SOLUBLES p 62
7.2.1 Medición de evolución de azúcares en premarchitado p 62
7.3 EFECTO DEL PICADO Y LA INOCULACION EN LA VELOCIDAD DE CAIDA
DE pH EN DISTINTOS ENSILAJES p 64
7.3.1 Efecto del tamaño de picado sobre la dinámica de acidificación de un
ensilaje p 64
7.3.2 Efecto del tamaño de picado y de la inoculación sobre la dinámica de
acidificación de un ensilaje p 67
pH.
7.3.3 Efecto de la inoculación con lactobacilos sobre la dinámica de
acidificación de un forraje p 70
7.4 RELACION ENTRE LA TASA DE ACIDIFICACION INICIAL Y LA
ESTABILIDAD PROLONGADA DE ENSILAJE p 72
7.4.1 Caída inicial y estabilidad del pH p 72
7.4.2 Tasas de caída de pH p 76
7.4.3 Análisis entre pH entre corte fino y grueso p 78
8 CONCLUSIONES p 81
9. BIBLIOGRAFIA p 83
10. ANEXOS p 87

7
 RESUMEN

Tuschner, A. 2004. Avances metodológicos orientados a predecir la aptitud de

especies forrajeras para ser ensiladas. Tesis, Magister en Ciencias Animales,
Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia Universidad Católica de Chile.
Santiago, Chile. 114 pp.

Este estudio caracterizó los principales aspectos que afectan la aptitud de los forrajes
para ser ensilados. Con estos datos se planteó como objetivo determinar metodologías
prácticas basadas en simplificación de algunas ya existentes y el desarrollo de otras
nuevas, que posibiliten la cuantificación de los parámetros seleccionados y así lograr la
determinación anticipada de la ensilabilidad de un forraje. Estas medidas
comprendieron la medición de la actividad de carbohidrasas endógenas de la planta, la
determinación de azúcares solubles al momento de ensilar y una técnica de incubación
acelerada en ambiente controlado, lo que relacionó en conjunto la actividad de
bacterias epifíticas y el poder tampón de la planta. Se cuantificó el efecto del
premarchitado, del tamaño de picado en la acidificación inicial y finalmente el valor
predictivo de la acidificación inicial respecto a la estabilidad prolongada del ensilaje
fermentado. Los resultados indicaron que en gramíneas la fermentación alcanzada en
24 horas y en el caso de las leguminosas a las 48 horas permitiría predecir
correctamente el comportamiento del forraje en un ensilaje bien manejado. Esta
diferencia en horas estaría dada por el contraste de contenido de azúcares y poder
tampón entre leguminosas y gramíneas. Los resultados obtenidos al emplear las
metodologías propuestas, en diversos forrajes fueron consistentes con los parámetros
que logran esos forrajes en procesos fermentativos de largo tiempo. Por medio de la
integración de los parámetros evaluados, sería posible consolidar una metodología de
terreno que logre predecir la aptitud de conservación de un determinado forraje, así
como su respuesta a una inoculación con bacterias ácido-lácticas.

Palabras Clave: Ensilaje, azúcares, dinámicas de fermentación en microsilos, forrajes.

8
 ABSTRACT

Tuschner A., 2004. Methodological advances oriented to predict the aptitude of forages
species to be ensilaged. Tesis, Magister en Ciencias Animales, Facultad de
Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia Universidad Católica de Chile. Santiago,
Chile. 114 pp.

The main factors that influence the aptitude of forages to be ensiled were characterized.
The objective was to determine practical methodologies, based on simpler applications
of previous knowledge and the development of new methodologies, in order to quantify
selected parameters that would forecast the forage ensiling ability with greater
accuracy. The activity of endogenous plant carbohydrases in the cutting-ensiling time
interval, the measurement of actual sugar content at ensiling time, and an accelerated
microsilo fermentation, along with the natural occurrence of epiphytic bacteria and the
actual buffering capacity of the plant, were the essential components of the predictive
system. The experiments also dealt with wilting and particle size effects upon the
fermentation rate. When comparing the accelerated fermentation process over the first
two days, particularly the rate of pH decline, we observed that 24 hours fermentation in
grasses and 48 hours fermentation in clover and lucerne successfully predicted the
silage performance over a longer period of time. These results were consistent through
different forage species and wilting strategies. Integrating the components studied in
this research would allow to build a useful tool for proper decision making at ensiling
time, particularly regarding the need for bacterial inoculants and the level of critical
sugar concentration.

Key words: Silage, plant sugars, microsilos, fermentation dynamics, cool season
forages.

9
3.0 INTRODUCCION

El ensilaje es una de las alternativas más importantes e interesantes de

conservación de forrajes, particularmente en zonas templadas, dada su relativa
independencia de factores climáticos, en especial las precipitaciones y alta humedad
relativa que no permitan la henificación.
El proceso del ensilaje es muy bien conocido a nivel de trasformaciones
químicas. Sin embargo, la adaptación de estos conocimientos a nivel de toma de
decisiones en un predio tiende a estar alejada. Éstas se basan en relaciones de
estados fenológicos de las plantas con los contenidos de sustrato fermentable y otros
elementos determinados en laboratorios. De esta manera, la decisión de realizar el
ensilaje es llevada a cabo principalmente por medio de la observación y experiencia
previa. Esta relación es muy general y es afectada por la variabilidad que resulte de la
localización geográfica, el clima de cada año y de los días precedentes al corte en
particular, las variaciones fenológicas de las plantas y las características de la flora
epifíticas inicial en cada sitio. Esto podría posibilitar, que un determinado estado
fenológico no necesariamente presente las características deseables para el proceso
mismo.
Los puntos clave que determinan la ensilabilidad de un determinado forraje, se
basan básicamente en
a) la concentración de sustrato fermentable o azúcares solubles
b) en el poder tampón o resistencia a la acidificación
c) cantidad y tipo de bacterias epifíticas en el forraje
d) contenido de materia seca (el que vendría a afectar a los anteriores)

La determinación de cada uno de los factores por separado y su interacción,

nos indican el potencial de ensilabilidad del forraje en cuestión. El contenido de
azúcares fermentables permite pronosticar una potencial caída de pH, la cual puede
ser rápida, lenta, sostenida, estable o inestable o simplemente no producir un pH
adecuado que permita la correcta conservación del pasto.
Por otro lado, el poder buffer o tampón, indica la resistencia del forraje mismo a
bajar su pH y su tendencia a mantenerlo estable ya sea en pH altos o bajos. Este
mismo elemento puede provocar que un determinado contenido de azúcares sea o no
suficiente para la baja de pH.

10
 El contenido y tipo de bacterias epifíticas, pasan de la misma manera a ser un
factor clave en el proceso. De esta manera, de poco sirve si el contenido de azúcares
es adecuado, lo mismo que un bajo poder tampón, si las bacterias que
tradicionalmente contaminan los forrajes no son deseables o su contenido es
insuficiente provocando que la fermentación sea lenta o tome ribetes poco favorables.
Finalmente, la materia seca por si sola no afecta directamente la ensilabilidad,
más bien su importancia radica en lo que ella provoca en la concentración de azúcares,
poder tampón y contenido de bacterias epifíticas, junto con la facilidad practica de
compactar el ensilaje para generar la anoxia.
A partir de los resultados de análisis de forrajes, se han realizado equivalencias
entre contenidos de azúcares y estado fenológico determinado. Éste pasa a ser
principalmente el factor a considerar para tomar la decisión de llevar a cabo el proceso.
Todos estos factores son obtenidos a nivel de laboratorio, siendo estas
determinaciones generalmente parámetros que pueden distar de la realidad de un
productor en particular tanto en tiempo como en espacio. Es decir, el disponer de una
metodología alternativa, en un plazo corto de una situación en particular, podría ayudar
a tomar decisiones más precisas. Por lo tanto, el objetivo de la siguiente tesis, es el
desarrollar de manera primaria, una metodología que permita en un plazo breve
determinar si es posible realizar un ensilaje para un caso determinado.

11
4.0.- REVISION BIBLIOGRAFICA

El contenido de azúcares solubles o el poder tampón, así como la existencia de

bacterias contaminantes tanto como deseables o no deseables y también el contenido
de materia seca del forraje original, pasan a ser factores preponderantes de entender
para poder comprender el proceso del ensilaje en sí.
Estos tienden a interactuar como un todo, pero es importante comprender cada
uno por si solo para ver su influencia en el proceso de interacción posterior.

4.1.- Carbohidratos no estructurales:

Los carbohidratos en las plantas pueden ser clasificados en dos categorías
principales, estructurales y no estructurales. Dentro de los carbohidratos no
estructurales, se encuentran los carbohidratos solubles, los que juegan un rol dinámico
en los procesos de respiración y fotosíntesis y sufren rápidos cambios incluso
inmediatamente después del corte. Es importante destacar que el contenido de estos
azúcares influencia fuertemente la posibilidad de lograr éxito en el ensilaje.
En el proceso de ensilaje, bacterias ácido lácticas convierten azúcares solubles
principalmente en ácidos láctico y acético. Este proceso fermentativo debe producir
niveles satisfactorios de ácido que permitan una correcta preservación del forraje
original, vale decir, producir una baja alteración de sus características originales y
además ser estable en un largo plazo. Para lograr esto, el forraje debe poseer una
adecuada cantidad de CS los que en el caso de los pastos, incluyen azúcares libres,
glucosa, fructosa y sacarosa; oligosacáridos estaquiosa, rafinosa y melibiosa, y
fructosanos.
En el cuadro 1 se presentan los principales carbohidratos de los forrajes, que
sirven de sustrato para la fermentación primaria.

12
Cuadro 1. Carbohidratos de los forrajes.

Monosacaridos Pentosas Aldehidos Arabinosa Arabanos hemicelulosa

Xilosa Xilanos hemicelulosa
Ribosa ARN
Cetosas Xilulosa, r
Ribulosa
Hexosas Glucosa
Galactosa
Fructosa
Manosa
Heptosas Sedoheptulosa
Disacaridos Lactosa Glucosa + galactosa b 1-4
Sacarosa Glucosa + fructosa
Maltosa C anomerico
Celobiosa Glucosa + glucosa b 1-4
almidón
Glucosa + glucosa a 1-4
celulosa
Trisacaridos Rafinosa Glucosa + fructosa +
galactosa
Polisacaridos Homoglicanos Xilanos y arabanos
Glucanos Almidón n Maltosas
amilopectina (ramificada)
Glúcogeno amilosa (lineal)
Amilopectina
Dextrinasas Celulosa n Amilopectinas
Fructosanos Insulina y levan
Mananos
Galactanos
Heteroglicanos Pectinas Ac. Galacturónico + arabano
+ galactano
Hemicelulosas Xilano + arabano +
ac. Glucoronico + glucosa +
galactosa + manosa

13
 Los principales carbohidratos no estructurales de forrajes templados son
glucosa, fructosa, sacarosa y fructosanos. Los disacáridos, melibiosa, el trisacárido
rafinosa y kestose y el tetrasacárido estaquiosa, han sido detectados en algunos
pastos pero en bajas concentraciones (Mackenzie y Wylam, 1957). Todos estos
carbohidratos son solubles en agua (WSC).
La mayoría de los carbohidratos presentes en la fracción de CS en las
leguminosas son fructosa, glucosa y sacarosa, aunque rafinosa y estaquiosa han sido
también detectadas. (Hirst, et al., 1959).

4.1.1 Sustratos más comunes para la fermentación primaria en ensilajes.

Mientras que el principal carbohidrato de reserva en las gramíneas son los
fructosanos, en las leguminosas es el almidón. Ya que el almidón es muy poco soluble
en agua, éste no pertenece a la fracción de carbohidratos solubles y además mientras
no sea hidrolizado, no estará disponible para ser sustrato de la mayoría de las
bacterias ácido lácticas.
Los CS son rápidamente disponibles para las bacterias ácido lácticas. Se ha
sugerido que la tasa de difusión de los CS desde células intactas y destruidas a la fase
acuosa sería más importante que la cantidad absoluta del cultivo (Wilson y Collins,
1980) para generar mayor rapidez de fermentación.
Generalmente se considera que la mayoría de las bacterias ácido lácticas
normales, no poseen la habilidad de fermentar almidón directamente, aunque algunos
autores han aislado algunas (Woolford, 1984).
En el cuadro 2 se presenta los sustratos típicos utilizados por los
microorganismos en la fermentación primaria.

14
Cuadro 2. Sustratos para la fermentación primaria y fuentes naturales de energía
rápidamente fermentable.

I) Sustratos para la fermentación primaria

a) Carbohidratos
• Azúcares solubles: principalmente hexosas libres (glucosa y fructosa) y
disacáridos (sacarosa)
• Productos de la hidrólisis enzimática de oligosacáridos (rafinosa, estaquiosa) y
de polisacáridos no estructurales (almidones, fructosanos, glucanos, mananos,
fitoglicógenos)
• Productos de la hidrólisis enzimática de polisacáridos estructurales (pectinas,
hemicelulosas y celulosa lábil)

b) Ácidos orgánicos
• Málico, cítrico, malónico, succínico, quínico, oxálico.

II) Fuentes naturales de Energía rápidamente fermentables

• Azúcares presentes en el forraje

• Hidrólisis de polisacáridos por carbohidrasas endógenas: almidones,
fructosanos, pectinas (genera pentosas), Mananos y glucanos.
• Hidrólisis de polisacáridos por enzimas de bacterias epifíticas (desde
hemicelulosa).
• Enzimas preparadas e inoculación.

4.1.2 Concentraciones típicas de los distintos carbohidratos en los pastos.

La glucosa y la fructosa son los más importantes carbohidratos que existen
como azúcares libres en pastos con concentraciones que van de 10 a 30 gr por kilo. El
disacárido sacarosa está en el rango de 20 a 80 gr por kilo. Los fructosanos son
levanos constituidos por uniones -(2 6) de unidades de fructofuranosa terminados en
residuos de sacarosa (Smith, 1973).
En pastos templados, los fructosanos son los más abundantes CS con
concentraciones que van entre 50 y 90 gr por kilo ( y más de 120 gr/kilo se ha
reportado en ballica perenne) (Laidlaw, R.A. y Reid, S.G. 1952). Este polisacárido
parece estar concentrado en el eje principal del tallo. Mackenzie y Wylam, 1959
mencionan en estudios en ballica perenne, concentraciones en las hojas que no
superaron los 40 gr/kilo de fructosanos, mientras que en el tallo este superaba el 15%.

15
 El contenido de fructosanos en climas fríos tiende a ser levemente superior que
en climas más cálidos. (Bathurst y Mitchell, 1958)
En la cuadro 3 se muestran los contenidos de carbohidratos no estructurales
(gr/kg MS.) de algunos pastos de climas temperados.

Cuadro 3. Contenido de C no estructurales(gr/kg) de algunos pastos templados

Pasto (H)oja; (T)allo Azúcares Otros azúcares Fructosanos
reductores
Lolium perenne H 18 49 41
T 23 64 141
Phleum pratense H 14 54 6
T 23 36 49
Festuca pratensis H 12 42 13
T 21 40 54
Dactylis glomerata H 7 30 3
T 24 20 14
Fuente: Adaptado de McDonald et al., 1991

En la cuadro 4 se puede observar el contenido de algunos carbohidratos (gr/kg

de m.s.) de una leguminosa cosechado en distintas etapas del crecimiento.

Cuadro 4. Contenido de distintos carbohidratos (gr/kg) de trébol rosado.

Vegetativo Pre-botón Med-Botón Botón Floración Vaina
Fructosa 23 24 27 24 25 20
Glucosa 24 30 38 45 38 34
Sacarosa 48 41 21 20 29 21
WSC 95 95 86 89 92 75
Almidón 86 52 72 77 67 67
Fuente: Adaptado de McDonald et al., 1991

4.1.3 Factores que influencian el contenido de CS de pastos

En adición a la variación entre distintas especies, los mayores factores que

influencian el contenido de CS son las diferencias entre cultivares, etapa del
crecimiento, tiempo del día, intensidad de luz, temperatura y aplicación nitrogenada
(Pettersson y Lindgren, 1990).
Especie
De las especies típicas de los pastos templados, la ballica perenne tiene el más
alto contenido de CS y el pasto ovillo el más bajo (Pettersson y Lindgren, 1990).
Henderson (1973) examinó el contenido de CS de 373 muestras de pastos diferentes,

16
observando que dentro de especies se producían rangos amplios de contenido de
azúcares (cuadro 5).

Cuadro 5. Contenido de CS de 5 especies de pastos. (g/ kg de MS).

Especie Nº muestras Rango Promedio e.s.
Ballica anual 38 74-314 181 +- 9.6
Ballica perenne 191 46-315 170 +- 3.8
Fleo 20 53-199 110 +- 10.7
Festuca 17 35-263 96 +- 14.4
Pasto ovillo 107 5-191 79 +- 4.1
Fuente: Adaptado de McDonald et al., 1991

a) Cultivar
Se han encontrado diferencias entre cultivares distintos y entre estados de
desarrollo de los mismos. Sin embargo este aspecto es muy variable y su tendencia no
sigue un patrón muy definido. (McDonald et al., 1991)

b) Etapa de desarrollo
La concentración total de CS está muy influenciada por la relación hoja:tallo. La
concentración parece aumentar junto con la madurez de la planta, a medida que
aumenta la cantidad de tallo. Este incremento se debería principalmente por un
aumento del contenido de fructosanos (Henderson, 1973). Henderson observó
aumentos de 139 g/ kg de M.S. a 245 g/ kg M.S. en ballica perenne. Además Waite y
Boid (1953), encontraron que el contenido de sacarosa de muestras de Pasto ovillo,
ballicas y festucas, variaba con el estado de desarrollo, alcanzando un pick en
Noviembre/Diciembre (adaptado al hemisferio sur). Las curvas del contenido de
fructosanos en estos mismos pastos presentan dos pick, uno en Noviembre y el
siguiente en Marzo; sin embargo la ballica alcanza sólo uno en Diciembre.
Por su parte, pareciera no existir variaciones de contenidos de carbohidratos en
leguminosas con el avance de la madurez (Melvin, 1966). Sin embargo, Raguse y
Smith (1966) sí encontraron variaciones debido principalmente a una baja de sacarosa
al avanzar el estado de crecimiento de la alfalfa.

17
c) Variaciones durante el día
El contenido de CS en pastos templados tiende a aumentar en horas de la
mañana hasta disminuir al acabarse la luz. Luego decrece hasta que sale el sol
nuevamente. (McDonald et al., 1991)
Las leguminosas también presentarían variaciones durante el transcurso del
día, debiéndose principalmente a los cambios en sacarosa y almidón (Smith, 1973).
Por su parte Melvin (1966) encontró incrementos durante el día en el porcentaje de
azúcares reductores, carbohidratos solubles en agua y CNE totales, en relación a la
noche.

d) Clima
Reducción en la intensidad lumínica, reduce el contenido de CS. Estudios han
demostrado que la cantidad de CS es mayor en alta intensidad lumínica y bajas
temperaturas (Smith, 1973).
En casos de sombreamiento, algunos experimentos han mostrado como baja la
cantidad de glucosa, fructosa, fructosanos y sacarosa. (McKenzie, y Wylam, 1957).
Las altas temperatura tendería a provocar una disminución del contenido de
fructosanos y otros carbohidratos (Smith, 1973).

e) Nivel de fertilización
El contenido de CS tiende a reducirse al aplicar fertilizantes nitrogenados,
debido probablemente a la aceleración de la tasa de crecimiento y estaría más ligado a
la baja en la cantidad de fructosanos, que de carbohidratos totales (Smith, 1973).

4.1.4 Cambios de los CS luego del corte

Los carbohidratos solubles presentan variaciones inmediatamente luego de

realizado el corte de la planta. Estas variaciones se deberán principalmente a la ruptura
de polisacáridos por enzimas de la planta y a la respiración de la planta y se verá
influenciada por las condiciones a las que se vea sometida.

18
4.1.4.1 Actividad de Polisacaridasas endógenas: Cambios durante el
premarchitamiento.

La sacarosa es catabolizada a CO2 en pastos premarchitados, de esta forma la

pérdida de CS dada por respiración está principalmente dada por pérdidas de sacarosa
y fructosanos ( Pettersson y Lindgren, 1990).
Varios investigadores han reportado que los fructosanos y el total de los
residuos de fructosa generalmente decrecen continuamente a través del proceso de
premarchitado. Este quiebre viene dado probablemente por la actividad enzimática de
la planta, aunque se ha demostrado que algunas bacterias asociadas al ensilaje son
capaces de hidrolizar fructosanos.
Hidrólisis completa de fructosanos y sacarosa tiene lugar luego del corte de
forrajes y este quiebre se refleja en los mayores valores de fructosa que son obtenidos
en los silos. (McDonald et al., 1991).
Wylam (1953), determinó los cambios que ocurren en azúcares libres
individuales y fructosanos en pastos luego del corte (cuadro 6).

Cuadro 6. Contenido de azúcares y fructosanos de ballicas frescas y premarchitas.

M.S. % Glucosa Fructosa Sacarosa Fructosanos
Pasto fresco 18.4 1.3 1.7 6.2 9.6
Premarchito (2hr) 20.6 1.3 1.7 5.1 9.2
(24hr) 44.6 1.9 2.9 5.4 5.2
(8 días) 78.1 1.6 1.4 5.2 3.5
Botella (4h) 18.4 1.7 2.1 4.8 7.1
Botella (96h) 18.4 3.2 2.4 3.4 2.8
Fuente: Wylam, C (1953).

La hidrólisis enzimática de la sacarosa y fructosanos ocurren luego que el pasto

se ha cortado, y es extremadamente rápida si el material se mantiene bajo condiciones
de humedad. Estas reacciones son acompañadas por pérdidas de respiración, la que
decrece a medida que se marchita el pasto. La hidrólisis de la sacarosa de pasto
premarchito, cesa luego de las primeras horas, pero la de fructosanos continúa, tanto
así que cuando se ha alcanzado cerca de un 78% de M.S., un 64% de estos azúcares
se han transformado.
Bajo condiciones de humedad por 4 horas, 23% de la sacarosa y 26% de los
fructosanos desaparecen y aunque existe un leve aumento del contenido de hexosas,
esto no es suficiente para justificar la pérdida de sacarosa, lo que probablemente es
causado por respiración. Este autor descubrió que luego de 96 horas los cambios son

19
más marcados: 45% de la sacarosa y 71% de los fructosanos se hidrolizaron.
Probablemente el marcado cambio de los azúcares, en condiciones de humedad
(botellas), se debió a que la respiración actuó rápidamente mientras existió aire
(Wylam, 1953).
Melvin y Simpson (1963), mencionan que existe un rápido quiebre de
fructosanos en ballicas perennes durante el premarchitado. Ellos encontraron que el
contenido de fructosa se incrementa al inicio del premarchitado, pero este incremento
no era suficiente para responder por la hidrólisis de los fructosanos, mostrando que su
producto fue rápidamente respirado.
El resultado neto de los residuos de hexosa soluble, muestra que el total de los
residuos de fructosa baja continuamente durante el premarchitado y compromete la
mayor parte de la pérdida total. Se ha sugerido que esta rápida utilización de
furanósidos en la respiración, podría deberse a la provisión de mayor cantidad de
hexosas fosforiladas disponibles, más que a su estructura misma, que en su estado
libre es más rápidamente fermentable (Melvin y Simpson, 1963). El contenido de
glucosa no varía apreciablemente durante el secado, mientras que el contenido de
sacarosa cae al inicio y luego se incrementa durante la parte final del premarchitado
(Wylam, 1953).
De acuerdo a esto último, existiría evidencia de que abría formación de
sacarosa a partir de glucosa y fructosa en las hojas lo que explicaría el aumento de
este sustrato (Melvin y Simpson, 1963).
En el caso de las leguminosas, el promedio de disminución de almidón durante
un premarchitado, alcanza a niveles de 57 y 56% en trébol rosado y alfalfa
respectivamente (Owens et al, 1999). Estos mismos autores mencionan, que los
niveles de los azúcares solubles se mantienen constantes durante el período de
premarchitaje en ambas especies. Los mínimos cambios en concentración de azúcares
durante este período podrían atribuirse a hidrólisis de almidón y la correspondiente
liberación de glucosa dentro del pool de azúcar de estos forrajes.
Clark (1973) menciona que el contenido de carbohidratos solubles (CS) tiende a
decrecer sobre las 48 horas de un período de premarchitamiento, aunque con
oscilaciones. Los cambio en los niveles de fructosa siguen a los de CS totales, pero los
niveles de glucosa tienden a variar independientemente y con menor magnitud. Las
oscilaciones serían particularmente grandes durante el premarchitamiento oscuro al

20
aire, donde se presentan pérdidas en los niveles de azúcares mayores al 50% en 12
horas. El nivel de glucosa presenta una pequeña baja (premarchito a luz) o un
incremento (premarchito oscuro) durante un período de 48 horas.
Carpintero et al., 1979 encontró que existen pocos cambios en el contenido de
CS del pasto premarchitado por 48 horas bajo buenas y malas condiciones
ambientales, pero que existe una significativa caída luego de 144 horas bajo malas
condiciones de clima.
Si el premarchitamiento no es muy prolongado, el almidón puede proveer una
importante cantidad de azúcares a la planta. Por lo tanto, la liberación de glucosa por la
hidrólisis de almidón y hemicelulosa (Owens et al., 1999) pueden contribuir al pool de
azúcares residuales en ensilajes de leguminosas.
Sin embargo, debe considerarse la pérdida que se produce debido a que existe
una respiración importante de parte de los azúcares producidos, mientras exista
suficiente humedad en la planta (Wylam, C. B., 1953).

4.1.4.2 Actividad de Polisacaridasas endógenas: Cambios durante el período de

ensilaje.

Durante el ensilaje, la cantidad de ácido producido pareciera ser mayor que la

que puede proporcionarse por la sola fermentación de CS, lo que sugiere que otras
sustancias pueden actuar como sustratos. (Masaki y Ohyama, 1979). Ácido cítrico y
málico podrían ser utilizados como fuente de energía en el proceso de ensilaje. (Dewar
et al., 1963).
En el caso de las leguminosas, entre un 73 y 94% del azúcar disponible del
forraje premarchito es usado durante el ensilaje (Owens et al, 1999).
La ruptura de polisacáridos lábiles tanto antes y durante las etapas del ensilaje,
posee la ventaja de producir más azúcares fermentables para la acción de las BAL.
Existe una ruptura extensiva de sacarosa y fructosanos, el que es parcialmente
enzimático, parcialmente bacteriano y parcialmente dado por las condiciones del
ensilaje. Wylam (1953), menciona que por el hecho de la presencia de bajas
cantidades de fructosanos en un ensilaje de 8 días y un aumento posterior (8 meses)
en el contenido de fructosa libre en el mismo, la generación de este azúcar reductor
solo pudo provenir de ruptura de oligosacáridos.

21
 Se ha encontrado que la ruptura de carbohidratos no reductores a azúcares
más simples es más rápida en pastos ensilados directos que en los premarchitados a
campo (Wylam, C., 1953).
Pettersson y Lindgren, (1990) mencionan que la actividad metabólica durante
los primeros días del ensilaje es intensa, ya que luego de 4 días, azúcares por
aproximadamente 10% de la materia seca son fermentados. Ácido láctico se produciría
también después de la desaparición de los azúcares e incluso, es posible encontrar
altos contenidos de ácido láctico en silos de bajos contenidos iniciales de azúcares,
corroborando que otras sustancias a parte de los CS podrían ser usados como
sustratos de fermentación.
Si bien es conocido que ácidos orgánicos pueden servir para esta función, se
piensa que carbohidratos estructurales serían la principal fuente para esta energía
extra. (McDonald et al., 1991) Aunque ácido málico y cítrico en ballicas se encuentran
presente en cantidades relativamente pequeñas comparadas con lo CS, podrían sin
embargo contribuir en el contenido de ácido láctico del ensilaje.
Otras posibles fuentes de láctico y ácidos grasos volátiles son los amino ácidos
obtenidos por proteólisis durante el ensilaje, pero en un buen ensilaje, amonio no
debería ser producido, por lo que su rol no debería ser considerado como óptimo
(Dewar et al., 1963).
Otro punto que se ha sugerido, es la existencia de fotosíntesis durante el
premarchitado pero, aunque alguna actividad se ha observado en hojas durante las
primeras 24 horas luego de cosechada, pasa a ser de poca importancia global, por la
baja penetración de luz al enmarañado de pasto y por el cierre de estomas.

4.1.4.3 Responsabilidad de la hemicelulosa en la variación de azúcares

La aparición de azúcares solubles durante el período de ensilaje, podría
deberse aparte de los factores anteriormente mencionados, al quiebre de fibras lábiles
(Morrison, 1979).
En ausencia de suficiente cantidad de CS, los lactobacilos sobrevivían atacando
xilanos y arabanos. Se ha demostrado la existencia de bacterias que atacan pentosas.
(Dewar et al., 1963).

22
 Aunque algo de ruptura de celulosa ocurre durante el ensilaje, se considera
usualmente pequeña comparada con aquella proveniente de hemicelulosa. (McDonald
et al., 1991)
McDonald et al., (1968), relacionan la presencia de pequeñas cantidades de
xilosa y galactosa en los ensilajes, con de algo de ruptura de hemicelulosa.
Heron et al. (1986), mencionan que en silos inhibidos de actividad microbiana,
el contenido de CS se incrementa dramáticamente durante el período (153 días) desde
124 a 204 g/kg de materias seca. Este incremento, se obtendría del quiebre de
carbohidratos estructurales de las plantas, como la hemicelulosa, por la acción de
enzimas de la planta misma, y por hidrólisis ácida. Sin embargo, el pH relativamente
alto de los silos tratados (5,17), debió haber tendido a favorecer la acción de las
hemicelulasas. Junto a esto, se produjo una acumulación de pentosas en los silos
irradiados.
Por su parte, Ohyama y Masaki, (1977), agregaron distintos ácidos grasos
volátiles a ensilajes para inhibir la actividad microbiana. En sus resultados confirmaron
el incremento de CS, siendo parte de esto explicado por la aparición de arabinosa y
galactosa.
La aparición de arabinosa y xilosa dentro de los silos, indicaría ruptura parcial
de hemicelulosa aunque podría aparecer también de formación por parte de
microorganismos (Wylam, C., 1953). Esta desaparición de fibra en silos, se ha
evidenciado en diversas etapas de éste y por varios autores.
El contenido de hemicelulosa de los pastos, aumenta con la madurez, variando
desde cerca de 100 a 300 g/kg de M.S. y se ha encontrado, hidrólisis significativa
durante el ensilaje, la que podría llegar a ser más de la mitad de la hemicelulosa
original (McDonald et al., 1991).

Existen tres posibles vías de ruptura de la hemicelulosa:

1) hemicelulasas presentes en el forraje original.

2) hemicelulasas bacterianas
3) hidrólisis por ácidos orgánicos producidos durante la fermentación.

No se ha podido lograr la utilización de la hemicelulosa como tal, como fuente

de energía por parte de las bacterias ácido. (Dewar et al., 1963).

23
 Estos mismos autores indican que de varios tipos de bacterias ácido láctica
aislada de ensilajes, ninguna poseía actividad hemicelulolítica, sin embargo, bacterias
ácido láctica aisladas de pulpa de papas sí poseen esa capacidad.
Wylam en comunicación personal con McDonald, (1963), mencionó que había
aislado enzimas de L. perenne las que eran capaces de romper los enlaces de
hemicelulosa.
Enzimas provenientes de ballicas anuales, presentan un óptimo de acción en un
rango de pH cercano a 6,0 y una temperatura entre 30 y 43 ºC. Existe una interacción
entre altas temperaturas y bajos pH, ambos tendiendo a suprimir la actividad de las
enzimas. Si la máxima cantidad de azúcares formados a partir de la hemicelulosa es
de 22,8 mg. por 100 mg. de ésta, y asumiendo que estos pastos poseen alrededor de
10 % de hemicelulosas (base m.s.), los azúcares adicionales disponibles para
fermentación podría ser de 3% (Dewar et al., 1963).
Bousset et al., 1990, falló en demostrar la actividad in vivo de hemicelulasas,
pero concluyó que aunque estas enzimas existen en las plantas, estas estarían
relativamente inactivas dada la compartimentalización. Se liberarían luego de la
plasmólisis, y su actividad sería de corta vida por la rápida caída del pH. Por lo tanto en
circunstancias normales, la actividad de estas enzimas no contribuirían
significativamente a la cantidad de CS.
Algunos estudios previos con pastos no premarchitados han demostraron que la
hemicelulosa desaparece durante el ensilaje a razón de 11-55% y la pérdida individual
de polímeros es preferencialmente, arabano > galactano > xilano (Dewar et al., 1963) .
Es difícil cuantificar la importancia práctica de las hemicelulosas como fuente de
carbohidratos rápidamente fermentables, porque la máxima actividad enzimática ocurre
a pH 6,0. A pH más bajos, la producción de pentosas a partir de actividad enzimática
se reduce pero comienza a tomar un rol fundamental la hidrólisis ácida (Dewar, et al.,
1963, Wylam, 1953).
Ya que la fermentación ocurre durante los primeros días, se considera de vital
importancia cualquier liberación de pentosas durante ese período que contribuya a los
azúcares fermentables. Estas pentosas son rápidamente disponibles como
carbohidratos para bacterias ácido lácticas, por lo tanto la producción de éstas a partir
de hemicelulosas durante el ensilaje, son importantes para el incremento en ácido
láctico y acético (McDonald et al., 1991).

24
 La relación arabinosa:xilosa de la hemicelulosa original es cercano a 1:4
mientras que la relación de los productos de la lisis por las enzimas de las ballicas es
de 1:1 y de la del pasto ovillo es cercana a 1:2. El cambio en la relación indicaría que la
arabinosa presentaría preferencia por la cadena de xilanos por la enzima. La
composición de hemicelulosa proveniente de Lolium perenne es de 58,5% xilosa,
14,6% arabinosa, 6,0% glucosa, 5,7% galactosa, 1,3% cenizas. (Dewar et al., 1963).
Se ha sugerido que durante un prolongado almacenamiento, se produce
hidrólisis directa de la pared celular por acidez. El mismo Deward, demostró un quiebre
considerable de hemicelulosa a pH 4 (ver cuadro 7). Esto no podría deberse a ruptura
enzimática de la hemicelulosa. Morrison, (1979), encontró un aumento en la ruptura
ácida de hemicelulosa al agregar ciertos aditivos, especialmente ácido sulfúrico y
fórmico, pero no es sabido si la acidez natural producida por el ensilaje es capaz de
producir este efecto.

Cuadro 7. Efecto del pH en la hidrólisis de hemicelulosa de ballica en 90 días.

Xilosa (gr/kg de Hemicelulosa)
Temperatura (ºC)
pH 22 30 37
4.0 71 76 84
5.0 46 48 48
6.0 38 44 44
Resultados expresados como xilosa (g/kg hemicelulosa)
Adaptado de Dewar et al., (1963)

4.1.4.4 Inhibición de actividad enzimática para medición de azúcares:

Mediciones exactas de pérdidas de carbohidratos que suceden por la actividad
enzimática de plantas son difíciles de determinar, ya que azúcares perdidos a través de
la respiración pueden ser reemplazados parcialmente por liberación de azúcares por
hidrólisis enzimática de carbohidratos estructurales, como celulosa, hemicelulosa y
pectina (McDonald et al., 1991).
Wylam (1953), menciona la necesidad de la completa inactivación del sistema
enzimático de la planta luego del corte, para aquellos materiales que deben alcanzar
laboratorios para sus análisis, por los rápidos cambios que sufren los carbohidratos y
otras sustancias. Un método que propone es el secado rápido, pero advierte que se
corre el riesgo de destrucción de azúcares. Congelarlo no produce cambios en estos
componentes pero falla en la inactivación enzimática.

25
 El mismo autor recomienda la inmersión en etanol en ebullición como el
método más eficaz para no producir cambios en los componentes de las plantas y
producir una pronta inactivación enzimática.
Algunos estudios se han realizado con fermentación microbiana restringida o
prevenida, para probar que la actividad enzimática de plantas es la principal
responsable de la producción de azúcares adicionales.
Usando pastos irradiados con rayos gamma, Heron et al., (1986), encontraron
que el contenido de CS en pasto irradiado y ensilado por 153 días era un 65% mayor
que el pasto original.
Macpherson et al., (1957), encontraron que el incremento en CS observado
durante el ensilaje de pastos que había sido tratado con metabisulfito de sodio, era
principalmente dado por un incremento de la fracción de glucosa. Esto sugeriría que el
suministro de esto vendría vía celulosa, ya que alguna hidrólisis de celulosa había
ocurrido. Debido a la presencia de pentosas en el ensilaje, azúcar podría originarse de
la hidrólisis de hemicelulosa.
Ensilajes no tratados con metabisulfito de sodio, presentan una rápida caída en
el pH y en los CS, mientras que en los tratados se produce un aumento rápido de CS
inmediatamente hasta el día 8. Luego de 175 días el valor de azúcares solubles que se
alcanza es de un 30 % superior al inicial, debido a la falta de actividad bacteriana que
los utilice.
Por su parte, los carbohidratos no reductores decrecen rápidamente tanto en
los silos tratados con inhibidores de microorganismos y en los no tratados, no
quedando alguno al cabo de 175 días. La sacarosa es hidrolizada a glucosa y fructosa
y el fructosano a oligosacáridos y finalmente a fructosa (Macpherson et al., 1957).
En los silos tratados con inhibidor de actividad microbiana, la baja en los
carbohidratos no reductores, es acompañada con un aumento de los azúcares
reductores, mientras que en el ensilaje control, los azúcares reductores que son
producidos por hidrolización, se pierden por fermentación, la que entre el primer y
tercer día es más rápida que la hidrólisis, resultando en una baja en los azúcares
reductores. Luego del tercer día, cuando la fermentación casi ha cesado, los azúcares
reductores comienzan nuevamente a subir, dada por la continua hidrólisis. La hidrólisis
de los azúcares no-reductores es efectuada por enzimas de plantas (Cuadro 8). Es

26
obvio que aunque el metabisulfito inhibe la actividad microbiana, no hace lo mismo con
la actividad enzimática de las plantas (Macpherson et al., 1957) .

Cuadro 8. Monosacáridos presentes en ensilajes de 175 días.

fructosa Glucosa Galactosa Xylosa Arabinosa Total
Silo control 8.2 1.8 0.8 Trazas trazas 10.8
Silo tratado 12.6 11.9 2.8 1.7 0.9 29.9
Fuente: Adaptado de Macpherson et al., 1957

Resultados muy equivalentes obtuvieron Heron et al.,(1986), con silos tratados

con inhibidores químicos, en donde el contenido de carbohidratos solubles fue muy
superior en los tratados respecto al control.

4.2.0 Poder Tampón y Caída de pH

4.2.1 Generalidades del Poder Tampón o Buffer
Uno de los factores importantes a considerar al realizar un ensilaje, es su
capacidad buffer, o bien, la habilidad que posee éste de resistir el cambio de pH.
Virtanen (1947) desarrolló un método (AIV) de conservación de forrajes por medio de
ácidos minerales a fines de los años veinte. Su principal objetivo fue el de calcular la
cantidad de ácido que era necesario para bajar el pH de un forraje a un nivel en el cual
las enzimas de plantas y microorganismos se encontraran inactivas. Idealmente, para
lograr este objetivo el pH del silo debía bajo 3,0, pero a este nivel se volvía no
palatable para los animales. El mismo Virtanen descubrió que al disminuir el pH a 3,6
por medio de ácido clorhídrico, ningún ácido mineral se mantenía en el forraje.
Concluyó que la acidez no era dada por la presencia de ácido clorhídrico libre, pero los
cuerpos proteicos de naturaleza ácida y los ácidos orgánicos débiles tales como
oxálico, málico y cítrico son liberados por los ácidos minerales más fuertes
reaccionando con los constituyentes básicos del forraje.
Las mediciones para estimar la capacidad buffer de los forrajes son usualmente
realizadas determinando la cantidad de ácido mineral o ácidos orgánicos (tales como
láctico), que es necesario agregar a un forraje fresco para obtener un valor de pH
deseable.
El interés se concentra en el rango de pH de 4 a 6, ya que la mayoría de las
plantas luego de realizar un macerado, tienen un valor de pH de aproximadamente 6 o

27
levemente superior y el pH de forrajes bien preservados es de alrededor de 4
(dependiendo del contenido de humedad inicial).
Un método muy frecuentemente utilizado es el propuesto por Playne y
McDonald (1966), el cual consiste en macerar el forraje y titularlo a pH 3,0 con ácido
clorhídrico 0,1 M para liberar el bicarbonato como CO2, y luego titularlo a pH 6 con
Hidróxido de sodio 0,1 M. Previo a esta metodología, varios autores habían
determinado el poder buffer de diversos forrajes y silos en macerados acuosos, incluso
realizando diálisis. Sin embargo, aparentemente se había ignorado el posible rol de los
ácidos orgánicos de las plantas, y además se utilizaba ácido láctico como titulante.
Este ácido por sí mismo, forma un sistema buffer en presencia de cationes inorgánicos.
Dunne (citado por Playne y McDonald, 1966) sugirió que los ácidos orgánicos de las
plantas y sus sales forman el más importante poder buffer en las plantas en la región
ácida (pH< 6).
Un índice utilizado en la medición de la capacidad buffer de los cultivos es el
“índice buffer”, que es calculado como dB/dpH, donde dB es el número de equivalentes
gr. por litro de ácido o base requeridos para el cambio requerido en pH en un litro de
solución buffer. (McDonald y Henderson, 1962).
La capacidad buffer es expresada como miliequivalentes (mE) de álcali
requeridos para cambiar el pH de 1 kg de M.S. de 4 a 6. En general (cuadro 9), las
leguminosas tienden a mostrar un poder buffer más alto que las gramíneas.

28
Cuadro 9. Poder buffer (mE/Kg m.s.) de gramíneas y leguminosas.
Capacidad Buffer
Especies Número de muestras Rango Promedio
Pastos
Timoteo 2 188-342 265
(Phleum pratense)
Pasto Ovillo 5 247-424 335
(Dactylis glomerata)
Ballica italiana 11 265-589 366
(Lolium multiflorum)
Ballica perenne 13 257-558 380
(Lolium perenne)
Leguminosas
Trébol rosado 1 - 350
(Trifolium pratense)
Trébol blanco 1 - 512
(Trifolium repens)
Alfalfa 9 390-570 472
(Medicago sativa)
Adaptado de McDonald et al., 1991.

4.2.2 Fundamentos del poder Tampón.

Una reacción ácido básica comprende siempre un par ácido-básico conjugado,

constituido por un dador de protones y el correspondiente aceptor de protones. Por
ejemplo, el ácido acético (CH3-COOH) y el anión acetato (CH3-COO-) forman un par
conjugado ácido-básico, ocurriendo lo mismo para ácido láctico (CH3CHOHCOOH) y el
anión lactato (CH3CHOHCOO-). Aquellos ácidos que presentan una afinidad elevada
por el protón son ácidos débiles y sólo se disocian muy ligeramente, mientras que
aquellos que presentan una afinidad pequeña, son ácidos fuertes y pierden el protón
H+ con facilidad. La tendencia de cualquier ácido a disociarse viene dada por su
constante de disociación. En este punto se puede observar la cuadro 10 donde se
muestran la constantes de disociación de alguno ácidos orgánicos importantes en las
plantas y su transformación logarítmica pK` el que es una convención que evita lo
engorroso del K` tradicional.

29
Cuadro 10. Constante de disociación de algunos ácidos orgánicos
Ácido K` pK`
(dador de protones)
CH3COOH Ác. Acético 1.74 X 10-5 4.76
CH3CH2COOH Ác. Propiónico 1.35 X 10-5 4.87
CH3CHOHCOOH Ác. Láctico 1.38 X 10-4 3.86
COOHCH2CH2COOH Ác. Succínico 6.16 X 10-5 4.21
Fuente: Lehninger, 1984.
La figura 1 muestra las curvas de valoración (titulación) de algunos ácidos débiles
titulados con NaOH. El pH resultante después de cada incremento de NaOH, durante
la titulación de un ácido, se expresa frente a los equivalentes de OH- añadidos. Las
formas de tales curvas de
valoración son muy
semejantes para todos los
ácidos siendo las más
importante diferencia, el
encontrarse desplazados en
forma vertical a la escala de
pH. La curva de valoración de
cada ácido presenta una
zona relativamente llana que
se extiende alrededor de una
unidad de pH a cada lado de
su punto medio. En esta zona
el pH del sistema cambia
relativamente poco cuando
se añaden cantidades más
bien pequeñas de iones H+ o
OH-

Figura 1. Curvas de la valoración ácido-básica mostrando las principales especies

iónicas en el comienzo, en el punto medio y al final de la valoración (Lehninger, 1984)

30
 Esta es la zona en que el par conjugado ácido-base actúa como tampón, es
decir, es el sistema que tiende a impedir el cambio de pH cuando se añaden iones H+ o
OH-.
Para valores de pH fuera de esta zona hay menos capacidad de resistir los
cambios de pH. La capacidad de tamponamiento es máxima en el mismo punto medio
de la curva de valoración, es decir, cuando la concentración de aceptor de protones se
iguala con la de dador de protones, en la cual se cumple que pH = pK`. La capacidad
tampón, disminuye a medida que aumenta el pH o desciende, respecto a dicho unto,
como consecuencia directa del cambio en la relación entre las especies aceptadoras y
dadoras de protones. Cada par conjugado ácido-básico posee un pH característico en
el cual su capacidad de tamponamiento es máxima.

Figura 2. Capacidad relativa de tamponamiento. (Fuente: Lehninger, 1984)

La capacidad máxima de tamponamiento tiene lugar cuando pH=pK`, donde se

produce una variación mínima del pH al añadir una cantidad determinada de ácido o de
base. El principal buffer de las plantas (ácido acético-acetato) posee su máximo entre
pH 4,4 y 4,6, siendo muy similar para el caso de ácido láctico-lactato (Lehninger, 1984).
El resto de los componentes del poder buffer que se procederán a revisar a
continuación también presentan su rango de acción dentro del mostrado para ácido
acético.
En la figura 3 puede observarse las curvas típicas de titulación de algunas
especies tales como, Phleum pratense, Dactylis glomerata, Medicago sativa y Trifolium
pratense. La titulación fue realizada con ácido láctico, mostrando pequeñas variaciones
respecto a ácidos inorgánicos (cierta formación de buffer).

31
Figura 3. Curvas de titulación de algunas especies (Fuente McDonald y Henderson, 1962).

Al compararla con las de la figura 1, debe considerarse primero que el macerado que
fue titulado presenta en su composición solo un pequeño porcentaje de poder buffer
comparado con el poder buffer titulable de una muestra de ácido acético puro. Es por
esto que no logra apreciarse correctamente la capacidad de soportar el cambio dentro
del pH crítico (4-5). Sin embargo es destacable que las dos curvas de arriba Medicago
sativa y Trifolium pratense) presentan buffer considerablemente mayor, los que ya
desde el pH 5 tienden a disminuir de manera más horizontal comparada con las dos
gramíneas en cuestión (curvas de abajo). Además en el caso de Dactylis glomerata,
ésta presenta un buffer algo mayor que el que presenta otras gramíneas como el Fleo
en este caso. Esto es concordante con la mayor dificultad que presenta el pasto ovillo
comparado con otras especies para ser ensiladas.

4.2.3 Responsables directos del poder buffer:

La mayoría del poder buffer de los forrajes en general, puede atribuírsele a los
aniones presentes (sales de ácido orgánicos, ortofosfatos, sulfatos, nitratos y
clorhidros), con apenas un 10 a 20% del poder dependiendo de las proteínas de las
plantas. Entre pH 4 y 6, sin embargo, los ácidos aniónicos orgánicos y los ortofosfatos
producirían el buffer y el efecto propio de los ortofosfatos en este rango sería más bien

32
pequeño (Playne y McDonald, 1966). El potasio es la base más abundante en las
plantas destinadas a ensilaje, pero además calcio y magnesio están envueltos en este
aspecto (McDonald y Henderson, 1962).
Un gran número de ácido orgánicos han sido identificados en pastos, los que
pueden verse en la cuadro 11.

Cuadro 11. Ácidos orgánicos de algunos pastos creciendo en condiciones similares.

Ácidos orgánicos (g/kg M.S.)
Especies cítrico fumárico málico quínico shikímico succínico Total
P.Ovillo 3.2 - 8.1 4.4 1.4 2.8 19.9
S143
P.Ovillo 2.7 0.2 9.4 6.6 3.7 3.2 25.8
S37
Festuca 3.7 - 11.0 6.2 1.2 2.5 24.6
Agrostis 2.4 0.1 5.6 1.4 0.5 3.0 13.0
tenuis
Ballica 4.5 0.2 8.8 3.0 1.2 2.4 19.9
perenne
Festuca 2.8 - 13.0 2.4 2.2 2.8 23.2
rubra
Timoteo 4.2 0.2 8.2 5.6 1.8 2.2 22.2
Adaptado de McDonald et al., 1991

Cuantitativamente los más importantes ácidos orgánicos en pastos son, málico,

cítrico y quínico (McDonald et al., 1991)
Durante el ensilaje se producen cambios marcados en la capacidad buffer del
forraje original lo que provoca un aumento en la necesidad de ácido requerido para
bajar el pH, por sobre el necesitado con el forraje en fresco (Playne y McDonald, 1966).
Este cambio puede ser explicado en la mayor parte por la acción de las bacterias sobre
los ácidos orgánicos. Incluso sobre la mejor de las condiciones, es decir, bajo
predominancia de microflora homoláctica, estos cambios ocurren. La acción de
bacterias lácticas sobre malato y citrato, muestran como esos incrementos en la
capacidad buffer aparente tienen lugar. Estos incrementos pueden ser mayores a 2 o 3
veces el de la planta original (Whitenbury et al, 1967). Tanto las bacterias homolácticas
como heterolácticas disimilan el malato y citrato por varias vías (ver cuadro 12).

33
Cuadro 12. Principales productos de fermentación de ácidos orgánicos por bacterias ácido
lácticas.

Homo y Hetero - fermentativas

(a) 1 Ác. Cítrico 2 ácido acético + 1 ácido fórmico + 1 CO2
2 Ác. Cítrico 2 ácido acético + 1 acetoína + 4 CO2
2 Ác. Cítrico 3 ácido acético + 1 ácido láctico + 3 CO2
(b) 1 Ác. Málico 1 ácido láctico + 1 CO2
2 Ác. Málico 1 acetoína + 4 CO2
2 Ác. Málico 1 ácido acético / Etanol + 1 ácido fórmico + 1 CO2
Fuente: Adaptado de Whittenbury et al., (1967)

Los productos formados son tanto neutrales (acetoína, 2,3 butanodiol y etanol),
sales de ácidos orgánicos (lactatos y acetatos) y cationes alcalinos liberados. Estos
productos al formar su par conjugado generan el aumento de la capacidad buffer del
forraje (Whittenbury et al, 1967). Las fermentaciones que realizan algunas bacterias
ácido lácticas de los ácidos orgánicos tiende a generar como su principal producto
lactato y acetato y su quiebre durante el ensilaje produce un gran aumento de la
capacidad buffer ya que la mayoría de los ácidos existen como sales, y entonces su
degradación resulta en la liberación de un exceso de cationes que deben ser
neutralizados por ácidos de fermentación, esto es láctico y acético de preferencia
(Playne y McDonald, 1966).
En el caso de fermentaciones no deseables, la destrucción de 2 moles de
lactato para generar un mol de ácido butírico, CO2 e hidrógeno, resulta en una
elevación de pH hacia la neutralidad, ocurriendo esto cuando aparecen clostridios con
predominancia de variedades sacarolíticas de lactatos y azúcares residuales.
(Whittenbury et al, 1967).
Existe una gran contribución de la fracción aniónica al poder buffer de la planta.
Ya sea en la planta como en el ensilaje, esta fracción responde por más de los 2/3 de
la resistencia a la baja de pH entre 6 y 4. En la fracción aniónica se encuentran
principalmente los ácidos orgánicos (Playne y McDonald, 1966).

34
 Al igual que en el caso de un forraje conformado principalmente por
leguminosas, el de gramíneas presenta un mayor poder buffer repartido en la fracción
aniónica y este aumenta durante el proceso de ensilaje.
El ácido málico y cítrico son los mayores ácidos orgánicos presentes en ballica
fresca, formando el 76,9% del total de ácidos detectados. Durante el período de
ensilaje se produce un quiebre casi absoluto de éstos y se producen grandes
cantidades de láctico y acético, además de incrementarse la cantidad de succínico
(que en parte vendría dado por actividad enzimática de la planta. Los ácidos orgánicos
tienden a estar como sales en el forraje fresco (pH 6 aprox.) y al producirse el quiebre
de éstos, podría generar un exceso de cationes. Consecuentemente, aunque la
capacidad buffer del material podría ser bajada por el quiebre de estos ácidos, el
exceso de los cationes tiene que ser neutralizado por ácidos producidos durante la
fermentación, tales como el láctico y el acético resultando en poco cambio de la
capacidad buffer total planta (original, pero aumentando por la formación de nuevo
poder buffer a partir de los productos de fermentación).
Durante el ensilaje, la capacidad buffer se incrementa rápidamente y dentro de
los primeros tres días, el valor puede doblar al original y esto puede atribuirse a la
formación de acetatos y lactatos (McDonald y Henderson, 1962).
En el trébol rosado los ácidos glicérido, málico y malónico son
aproximadamente el 80% de los ácidos que se detectados. En el caso del trébol
blanco, el ácido mayoritario presente en el forraje fresco es el glicérido (43,5%). Al
igual que en el caso de las gramíneas, láctico y acético son los ácidos
mayoritariamente formados durante la fermentación, respondiendo por el 78,5 % del
total (dependiendo de las condiciones del proceso de ensilaje mismo). (Whittenbury., et
al. 1967)
En teoría, si la producción de ácido láctico ocurre inmediatamente empezado el
proceso, entonces un contenido de ácido láctico de 3-5% de la materia seca debería
ser capaz de preservar el pasto a pH 4,0 (McDonald y Henderson, 1962). En pastos
frescos, la capacidad buffer es equivalente aproximadamente a un 3% de la materia
seca, siempre y cuando no existan otros cambios, con esta cantidad de ácido, es
factible conservar el cultivo a pH 4. Al poseer mayor contenido de poder buffer las
leguminosas, se requiere aproximadamente un 6% de la materia seca como ácido
láctico para bajar el pH a 4.

35
 En general, acetato tiende a tener un poder buffer mucho mayor a lactato (40.87
v/s 36.39 mequiv. respectivamente) si bien en general el contenido lactato es mucho
mayor que el de acetato (Lehninger, 1984).

4.2.3.1 Proteínas y poder buffer:

Durante las primeras etapas del ensilaje, se produce un quiebre de proteínas a

amino ácidos, pero resulta improbable que estos amino ácidos puedan contribuir de
alguna manera a este poder buffer aumentado dentro del rango de pH 4-6, pero la
decarboxilación de ciertos amino ácidos con la consecuente producción de bases
puede ocurrir generando la real contribución de las proteínas al poder buffer del forraje.
El contenido de proteínas de un forraje, no controla directamente la capacidad
buffer, además el incremento de éste durante el proceso de ensilaje no está
aparentemente relacionado con el incremento en los productos de quiebre de proteínas
(Playne y McDonald, 1966). McDonald y Henderson (1962), mencionan que los
resultados obtenidos en sus estudios sugerirían una relación entre el contenido de
proteína del forraje y el poder buffer que él presenta. Sin embargo recalcaron que
aunque esa relación existe, es muy improbable que el contenido de proteína sea el
mayor responsable de la capacidad buffer de las plantas ya que cultivos altamente
fertilizados con sulfato de amonio presentaron en sus estudios un relativo bajo poder
buffer y un alto contenido de proteína.
El poder buffer de las proteínas, se ha determinado por extracción de éstas por
distintos medios. La capacidad buffer luego, se ha determinado también entre pH 4 y 6.
Playne y McDonald (1966) han determinado que el poder buffer de las proteínas no es
mayor a 11 mequiv./100 gr de materia seca, tanto en Ballica italiana como en trébol
rosado (estado de floración). Específicamente para el caso de la Ballica italiana, las
proteínas resultan representar sólo el 24% del poder buffer total, mientras que en el
trébol rosado es de un 19,5%. En el caso de muestras de pasto ovillo (Dactylis
glomerata) estas han representado incluso valores más bajos del total (8% de la
capacidad buffer).
Aunque el alto contenido de los ácidos orgánicos y sus sales se consideran la
causa más importante en el gran poder buffer de las leguminosas comparado con los
pastos, el alto contenido de proteínas en estos cultivos, también juega un rol
(McDonald et al., 1991).

36
 Si se asume que solo la cadena lateral del grupo carboxílico de ácido glutámico
y aspártico son los responsables del efecto buffer de las proteínas entre el pH 4 y 6 y el
valor hipotético de buffer de las proteínas de pastos se encuentra entre 6 y 11
mequiv/100 g de materia seca, esto sería concordante con los valores encontrados en
varios estudios (Playne y McDonald, 1966). Por lo tanto es destacable que dentro del
bajo porcentaje que representan las proteínas dentro del poder buffer de las plantas,
los ácidos glutámico y aspártico pasan a ser los de mayor importancia.
El grupo -carboxilo del ácido aspártico y el -carboxilo del ácido glutámico,
aunque se hallan totalmente ionizados a pH 7,0 poseen valores de pK´
considerablemente más elevados que los correspondientes valores de pK´ de los
grupos -carboxilos, y más aproximadamente iguales a los de los ácidos carboxílicos
sencillos tales como el ácido acético (Lehninger A., 1984).
En la figura 4 puede apreciarse el aminoácido aspártico y glutámico, cada uno
de los cuales posee un segundo grupo carboxilo que se halla completamente ionizado
y por lo tanto, cargado negativamente a pH 6 a 7. Los pK´ del grupo R del ácido
aspártico es de 3,86 y el del glutámico 4,25 muy inferior a los presentados por cisteína,
tirosina, lisina y arginina los que poseen todos un grupo R también. Esta baja constante
de disociación estaría indicando el mayor poder buffer que presentan estos
aminoácidos.

Figura 4. Representación de los aminoácidos principales responsables del poder buffer

en forrajes frescos.
Fuente: Lehninger, 1984.

37
 En figura 5 se puede apreciar la curva de
titulación del ácido glutámico.
Las curvas de valoración de los aminoácidos con
grupos R que se ionizan (tales como histidina,
lisina, glutámico y aspártico) son más complejas,
puesto que son una combinación de curvas
correspondientes a la disociación del grupo R y
las curvas de titulación de los grupos -amino y
-carboxilo (Lehninger, 1984).

Figura 5. Curva de titulación de ácido glutámico. Fuente: Lehninger, 1984.

Puede verse en el esquema 2 que el pK´R del ácido glutámico tiene el máximo poder
buffer entre el pH 4 y 5 siendo coincidente con los mayores poderes buffer que
presentan el acetato y lactato. El ácido aspártico tiende a tener su poder buffer muy
similar en acción al glutámico al ser su grupo R muy semejante lo mismo que su pK´R.
Existe una contribución al poder buffer durante el ensilaje debido a la reducción
de nitratos ejercidos por algunas enterobacterias. La reducción de nitrato bajo ciertas
condiciones (adecuadas para la sobrevivencia de este tipo de bacterias) produce la
energía necesaria para su generación; y el paso de nitrito a óxido nitroso y amonio
prolonga su actividad al incrementar la capacidad buffer (ver curva de amonio en
figura 2), siendo el pH bajo el único capaz de evitar este proceso. La mayoría de las
enterobacterias reducen nitrato a amonio vía nitrito, mientras que sólo algunas
producen óxido nitroso (McDonald et al., 1991).

4.2.4 Efectos de algunos manejos sobre el poder buffer:

a) Premarchitar: En general, al premarchitar un forraje, el poder buffer de éste

tiende a bajar. Playne y McDonald (1966) mencionan, que existe un marcado efecto en
disminución del poder buffer al premarchitar el forraje (cuadro 13). La disminución del
poder buffer es de aproximadamente un 18% al compararlo con el chopeado simple,
siendo el incremento de este poder durante el ensilaje, menor al compararlo con los no
premarchitos. Esto se debería a una formación de cantidades menores de acetato y
lactato lo que se ve además reflejado, en un valor de pH mayor para el caso del
premarchito

38
Cuadro 13. pH y capacidad buffer de trébol rosado fresco y sus ensilajes respectivos.

Forraje fresco Silo 8 días

picado chopeado Pre- picado chopeado Pre-
marchito marchito
M.S.% 15.0 13.8 31.8 - - -
pH 5.95 5.73 5.8 4.02 4.35 5.03
Capacidad buffer 57.8 61.7 49.1 142.2 147.1 76.3
(pH 4 a 6)
Efecto buffer de 42.5 - 8.1 96.5 - 12.4
ácidos orgánicos
presentes.
Adaptado de Playne y McDonald, 1966.

Durante el proceso de premarchitado, se produce una disminución marcada de

los ácidos orgánicos formados y esta pérdida respondería por el menor poder buffer de
plantas de trébol premarchitado.

b) Tipo de fertilizante nitrogenado: McDonald y Henderson (1962), mencionan

que plantas que recibieron fertilización amoniacal poseyeron una menor concentración
de ácidos orgánicos que aquellos que recibieron fertilización de nitratos como fuente de
nitrógeno. Concluyen que la depresión del poder buffer del forraje fuertemente
fertilizado con sulfato de amonio, puede estar asociada con una disminución del
contenido de ácidos orgánicos en el forraje fresco. Además Keady y O`Kiely (1998),
mencionan que incrementar la fertilización nitrogenada provoca un aumento de la
capacidad buffer.

c) Fertilización potásica: Una excesiva fertilización con potasio tiende a generar

un mayor consumo de este mineral por parte de la planta, del necesario para su normal
crecimiento. Muck y Walgenbach (1985), citado por Keady y O`kiely (1998), reportaron
que la incrementada capacidad buffer de los forrajes en el ensilaje luego de una fuerte
fertilización potásica, está altamente correlacionada con la concentración interna de
potasio.
Sin embargo Keady y O`kiely (1998), señalan que la capacidad buffer de las
plantas se incrementa con aplicaciones de K entre 0 y 60 kg., mientras que no aumenta
entre el rango de 60 a 240 kg/ha, en el primer corte. En un corte tardío del primer
rebrote, al incrementar el K (0 a 120 kg/ha), la capacidad buffer se incrementa. En

39
general llegan los autores a la discordancia con respecto a los resultados encontrados
por Muck y Walgenbach (1985) los que sí encontraron correlaciones entre el contenido
de K en el suelo y la capacidad buffer.

d) Retraso del corte: retrasar la época del corte genera una disminución del
poder buffer en conjunto con una disminución del contenido de proteínas y un efecto
positivo en el contenido de carbohidratos solubles. La disminución de la capacidad
buffer vendría dada por una disminución de la relación hoja:tallo, ya que las hojas
poseen un poder buffer mayor que los tallos maduros (Keady y O`kiely (1998).

4.3. Valores de capacidad buffer de los forrajes.

El poder buffer de los forrajes se encuentra aproximadamente entre los 31 y 70
mequiv., siendo los mayores valores asociados a los tréboles o a mezclas enriquecidas
en estas leguminosas (McDonald et al., 1991) (cuadro 14).

Cuadro 14. Capacidad buffer total y valores de pH de varios forrajes y sus silos.

Especie Capacidad buffer pH Capacidad buffer de pH

planta silo
Pastos ovillo 24.7 - - -
Pasto ovillo 25.3 - - -
Ballica italiana 58.9 5.88 125.0 4.14
Ballica italiana 44.6 - - -
Ballica italiana (alto N 31.0 5.89 100.0 4.31
fert)
Ballica italiana (bajo N 38.6 6.16 13.6 4.37
fert)
Ballica perenne 38.6 6.06 89.9 5.81
Ballica perenne 42.8 5.90 82.2 5.36
Trébol rosado 61.7 5.73 147.1 4.35
(chopeado)
Trébol rosado 49.1 5.80 76.3 5.03
(premarchitado)
Trébol blanco 51.2 - - -
Adaptado de Playne y McDonald, 1966.
Playne y McDonald (1966), mencionan que los tréboles tienden a tener el doble
de capacidad buffer que las gramíneas y esto sería un factor importante asociado con
la dificultad de ensilar las leguminosas.
El poder buffer de la alfalfa luego de ensilada supera en 3 o 4 veces el valor
encontrado en el forraje fresco (cuadro 15) (Jones et al., 1991).

40
Cuadro 15. Capacidad buffer de alfalfa previo a ensilar.
1985 1986
Parámetro 1 2 3 4 1 2 3 4
Capacidad buffer 515 431 448 503 580 414 524 487
(mEq/kg ms)
Azúcar (mg/g ms) 49 26 50 103 42 48 59 106
CHO:buffer 95 61 112 205 73 116 114 218
(mg/mEq)
Fuente: adaptado de Jones et al., 1991.

Jones et al (1991) propone un índice en relación al contenido de azúcares

fermentables y el poder buffer, el que consiste en dividir el contenido de azúcares por
el de buffer. Este índice mientras más alto indicaría mejores condiciones de
ensilabilidad.
4.4 Microorganismos responsables de fermentaciones de los forrajes.
Es importante el rol de los microorganismos en la conservación de forrajes,
dada su responsabilidad en el tipo de fermentación que tome lugar, dependiendo de las
condiciones que se les impongan. Desde comienzos de 1900, se han ido descubriendo
diversas microorganismos que toman parte dentro de las fermentaciones en el proceso
del ensilaje, ya sea de fermentaciones deseables o indeseables.
Uno de los factores más preponderantes para el éxito del proceso fermentativo
es la existencia de una adecuada cantidad de bacterias ácido lácticas (Rooke, J.,
1990), las que si no están presentes en el forraje fresco original, deberían ser
agregadas como inoculante al inicio del proceso.
4.4.1 Contaminación epifítica de bacterias en forrajes.
Desde hace bastante que se sabe de la presencia de bacterias en la parte
aérea de los pastos. Miskovic y Rasovic encontraron, revisando la flora epifítica de
sorgo, maíz y alfalfa, que el número total de microorganismos era mayor en hojas y
dentro de éstas en la parte superficial, que en los tallos, en todas las etapas de
desarrollo.
El número total de bacterias en pastos frescos ha mostrado variar entre 106 y
109 /grMS. (Moon and Henk, 1980, citados por McDonald, 1991).
La gran mayoría de estas bacterias por encontrarse en la superficie, son
estrictamente aeróbicas lo que contribuye poco o nada a la fermentación y ya que la
anaerobiosis se logra rápidamente luego de comenzado el proceso, su crecimiento se
verá rápidamente inhibido por falta de oxígeno. Los organismos anaeróbicos más

41
abundantes en material fresco de forraje, son los coliformes, miembros de la familia
Enterobactericeae. Estas enterobacterias tienden a estar siempre presentes en cultivos
de alfalfa y maíz, y en este último, las levaduras y hongos tienden a ser los de mayor
número (Lin et al., 1992).
También se puede encontrar especies de Bacillus y Clostridios pero en menor
cantidad. Los últimos, que son estrictamente anaeróbicos, están en las plantas como
endosporas resultado probablemente de aplicación de purines o por contaminación del
suelo (Pedersen et al., 1973).
Las bacterias ácido lácticas, las que son las más importantes y deseables
especies durante el ensilaje, están usualmente en el forraje fresco en un número 1000
veces inferior que sus principales competidoras los hongos y enterobacterias (Dellagio,
1985). Mientras tanto, Lindgren et al., (1985), citado por Lin et al., (1992), confirman
que al examinar pastos y alfalfa, las enterobacterias eran la población dominante
siendo entre 100 y 1000 veces superior a la de lactobacilos.
Sin embargo Rooke, J.A. (1990), encontró que el número de bacterias ácido
lácticas en muestras de pastos frescos era considerablemente mayor que las
cantidades reportadas anteriormente en la década del 60. Además se apoyó en dos
estudios de Pahlow y Dinter (1987), los que encontraron cantidades similares a las
halladas por él. Lin et al., 1992, encontraron que estas bacterias, incluyendo los grupos
lactobacilos, pediococos y leuconostoc, constituyen una baja proporción (5 %) de la
población total de microorganismos presentes en alfalfa y maíz (cuadro 16).

Cuadro 16. Identificación y enumeración de la microflora epifítica de alfalfa y maíz.

Microflora Alfalfa Maíz SEM
(log10 ufc/g de material fresco)
Lactobacilos, pediococos, leuconostoc 3.76B 4.22B 4.03
b,A
Enterobacteria 6.06 6.87ª,A 6.51
Hongos y levaduras 5.07b,B 6.85ª,A 6.52
b,B ª,A,B
Levaduras asimiladoras de lactato 4.19 6.36 5.89
Esporas clostridiales fermentadoras de ND1 1.97B 1.69
Cho
SEM 4.96 6.62
a,b
Significa en la misma hilera con diferencias (P< 0,05)
A,B significa en la misma columna con diferencias (P< 0,05)
ND1 No detectable.
Adaptado de Lin et al., 1992.
Pareciera que estas bacterias ácido láctica coexisten con las plantas, y aunque
su función no se conoce aún, pareciera que ésta se relaciona que protegerían a las

42
plantas de microorganismos patogénicos, produciendo compuestos como ácidos,
bacteriocinas y agentes antifúngicos. Esto vendría dado por los altos recuentos en
sectores dañados de las plantas (Stierling, A.C. y Whittenbury, R., 1969).

4.4.2 Responsables de las variaciones de bacterias epifíticas en forraje.

Varios factores provocan variaciones tanto en el contenido como en el tipo de
bacterias de un forraje, en un momento dado. La temperatura tiende a ser el factor más
influyente en este aspecto. Al aumentar la temperatura durante un período de 24 horas
antes del corte, se incrementó el número de lactobacilos, pero no existe relación
alguna con los otros grupos de microorganismos.
En general, al aumentar la temperatura varios días antes del corte de un forraje,
tienden a aumentar también la flora epifítica, sin embargo sólo el promedio de
precipitaciones diarias y la humedad relativa se correlacionan muy alto con la
contabilización de enterobacterias (Lin et al., 1992).

4.4.3 Variaciones de bacterias ácido lácticas en el forraje.

Los reportes de contenido de bacterias ácido láctica en forrajes, han mostrado
amplias variaciones, tanto en el número como en las especies presentes (McDonald et
al., 1991).
En general, las bacterias logran importantes aumentos después del corte,
alcanzando su máximo entre los dos y cuatro días (109), para posteriormente declinar
lentamente. Se atribuía el aumento del número de bacterias desde el corte hasta el
ensilaje, a inoculación por el equipamiento mecánico y su reproducción en la sabia
liberada del forraje (Henderson, et al., 1972). Sin embargo, Pahlow y Ruser (1989),
demostraron que no es posible alcanzar esa multiplicación bacteriana desde el cultivo
hasta la cosecha, dado que el tiempo de paso por la maquinaria es muy corto. El
causante de estos resultados serían los métodos de contabilización de bacterias en el
cultivo, ya que dada la manipulación que se hacía de las muestras, las bacterias
perderían su viabilidad antes que las muestras alcanzaran el laboratorio para sus
análisis. Las altas contabilizaciones se obtenían de materiales chopeados casi al
momento de analizar y que el aumento típico posterior a este chopeo sería de
responsabilidad de las bacterias ácido láctica más que de cualquier otro
microorganismos.

43
 Estos autores propusieron como explicación que algunas BAL tienen como
método de protección contra la aerobiosis, la encapsulación contra el oxígeno, por
medio de secuestración por manganeso, además que muchas de las enzimas de estas
bacterias son manganeso dependientes. Las plantas tienen una gran contenido de este
mineral, por lo que se asume que pasan a ser reservorios para las bacterias. El
manganeso sería liberado a plenitud para las bacterias al momento del chopeado de la
planta, al liberar ésta su jugo y esta disponibilidad permitiría a las BAL soportar las
condiciones estresantes de la cosecha.
Con respecto a la variación de estas bacterias a lo largo de las temporadas,
McDonald et al., (1991), destaca que algunos autores reportan que el contenido no se
ve afectado por la época, mientras que otros sí la reportan, siendo más bajo el número
en el inicio y al final del crecimiento de los pastos. Holden 1994, notó un incremento en
la contabilización de bacterias entre el primer y segundo corte.
Un cultivo muestreado por medio de tijeras procurando el mínimo daño, es decir
la mínima liberación de nutrientes, genera la pérdida de viabilidad de BAL.
Las razones del porqué existe en la actualidad un mayor recuento de bacterias
ácido láctica en el cultivo de origen, serían el incremento de uso de inoculantes
bacterianos y mejoras de la maquinaria de cosecha, que han disminuido el tiempo de
chopeo (McDonald et al, 1991). Otra explicación vendría dada por los diferentes
métodos de incubación utilizados anteriormente, los que tendían a tener un pH más
bajo (Rogosa o Tween acetate agar), los que no incluían en su contabilización los
estreptococos (Rooke, 1990). Ya que los estreptococos y leuconostoc tienden a
dominar en cultivos frescos, esta explicación tendería a ser propicia.

4.4.4 Variaciones de enterobacterias en el forraje.

Las enterobacterias son de importancia por estar dentro de un grupo de
importantes patógenos. Según algunos autores, este grupo representa una minoría en
la microflora de los pastos (Pedersen y Guttormsen 1975), mientras que otros han
encontrado cantidades del orden de 104 o más de 105 g (Rooke, 1990).
El premarchitado tiende a disminuir la contabilización de enterobacterias
(Spoelstra, 1985), mientras que durante los primeros días de comenzado el ensilaje, su
número tiende a aumentar, alcanzando máximos tan altos como 108 hasta 1010 /g.
Luego de esto, el desarrollo de las BAL y la consecuente caída de pH deberían tender

44
a provocar una rápida caída en su número, pero bajo ciertas circunstancias, podrían
persistir. Esto es indeseable ya que compiten directamente con las bacterias ácido
lácticas por el sustrato, además de producir endotoxinas y ser responsables de la
liberación de amonio en el ensilaje (McDonald et al., 1991).
Es muy poco lo que se sabe acerca de las enterobacterias presentes en el
pasto y en el ensilaje. Heron et al., (1990) descubrieron un patrón de sucesión de
bacterias, que mencionaba el cambio del dominio de enterobacterias en el pasto
original y luego durante el ensilaje. Este cambio en el dominio del tipo de
enterobacteria entre el pasto original y el ensilaje, sugeriría que el número inicial de
este tipo de microorganismos no tendría necesariamente implicancias en los sucesos
durante el proceso de ensilaje (McDonald et al., 1991).
La aplicación de feces como fertilizante a las praderas destinadas a ensilajes,
ha generado discusiones acerca de su potencial efecto adverso en la fermentación.
McDonald et al (1991) menciona que existe muy poca información disponible acerca de
esto. Rooke (1990), examinó pasto fertilizado con fecas durante dos temporadas y
encontró que la aplicación de éste tanto en invierno como en primavera, no generaba
necesariamente un aumento en la cantidad de enterobacterias, al cosecharse el pasto
para ensilaje. Sin embargo las fecas contienen un alto contenido de esporas
anaeróbicas y la posibilidad que estas dominen la fermentación no debe ser obviada.

4.4.5 Variaciones de clostridios en el forraje.

Los clostridios tienden a ser estrictamente anaeróbicos, pero existen muchas de
estas bacteria que son capaces de crecer en presencia de aire siempre que exista
suficientemente poco potencial de poder reductor. Se dividen en dos grupos: los
sacarolíticos que tienden a fermentar casi exclusivamente azúcares y ácidos orgánicos
y los proteolíticos que a su vez tienden a hacer lo mismo con amino ácidos. Se
considera que dentro de los más de 60 especies que jugarían algún rol dentro de los
ensilajes, solo siete de ellos son de gran importancia (McDonald et al, 1991).
Los clostridios se encuentran tanto en ensilajes, como en fecas y suelo.
Presumiblemente la fuente primaria de estas bacterias sería el suelo, y la existencia de
ellas en los otros dos vendría dado por contaminación directa desde el suelo mismo,
tanto para el tracto digestivo como para los ensilajes (Seale et al., 1986).

45
 Luego del llenado del silo, los clostridios tienden a reproducirse
exponencialmente siendo tan temprano como lo hacen las otras bacterias en el
ensilaje, ocurriendo esto dentro de los primeros días de iniciado el proceso (Gibson et
al., 1968). El crecimiento clostridial es estimulado por temperaturas elevadas en el
almacenamiento, bajo contenido de materia seca, bajo contenido de carbohidratos
solubles y una capacidad buffer alta, sumado a un retraso en el sellado del silo; siendo
esto derechamente relacionado a competencia directa con BAL. Si no se logra
rápidamente un pH bajo y estable, la actividad clostridial iniciará una fermentación
secundaria, siendo esto último indeseable.

4.4.6 Hongos y levaduras en el forraje.

Los hongos son organismos heterotróficos que se encuentran abundantemente
en el suelo, en la vegetación y en el agua. Obtienen los nutrientes para su crecimiento
por medio de secreción de enzimas extracelulares (proteasas, lipasas, amilasas y
celulasas) las que generan monómeros desde complejas sustancias. La mayoría de los
hongos son estrictamente aeróbicos sin embargo algunas levaduras y unos pocos
hongos filamentosos pueden crecer bajo condiciones anaeróbicas por medio de
fermentación. La actividad mayoritaria de estos organismos se da al momento de la
exposición al aire del ensilaje, es decir principalmente al estar expuesto ya sea por
lentitud de cierre del mismo o al momento de abrirlo para ser utilizado.

46
5 HIPOTESIS Y OBJETIVOS

5.1 HIPOTESIS

-La hipótesis general es que es posible predecir el patrón de fermentación de un

determinado forraje a través de análisis químicos y mediciones tempranas de
fermentación en micro-silos.
- En particular esta hipótesis involucra la posibilidad de acelerar el proceso de
fermentación anaeróbica de los forrajes a través de estrategias de elaboración
de microsilos con ese objetivo.
- Asimismo, ese patrón de fermentación inicial así obtenido constituiría un buen
predictor de cómo se comportará la conservación en términos totales.

5.2 OBJETIVO GENERAL

Desarrollar una metodología que permita evaluar la ensilabilidad de forrajes

basada en la dinámica de fermentación que resulta de la concentración de azúcares
fermentables, de la capacidad buffer de la planta, del tipo y cantidad de
microorganismos fermentadores.

5.3 OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Desarrollar una metodología simple y rápida para la medición de la

concentración de azúcares fermentables presentes en forrajes frescos.
- Medir los cambios en el contenido de carbohidratos no estructurales durante el
premarchitamiento de diversos forrajes.
- Diseñar una estrategia de microsilos que permita estudiar un elevado número
de tratamientos y posean las características de ser anaeróbicos, mantener una
temperatura constante y permitir la disipación de los gases de fermentación.
- Estudiar el efecto del tamaño de picado del forraje y de la inoculación con
bacterias ácido lácticas sobre la tasa de fermentación de los micro-ensilajes.
- Analizar la dinámica de fermentación de los microsilos a través del cambio en
acidez y la estabilidad de la misma. Comparar estos valores iniciales con los
resultados de fermentaciones más prolongadas

47
6. MATERIALES Y METODOS.
6.1 ENSAYO 1: Metodología simplificada para la medición de la concentración
de azúcares fermentables presentes en forrajes frescos

6.1.1. Metodología.
a) Método físico : Refractómetro. El instrumento utilizado para medir
carbohidratos solubles consistió en un refractómetro. Este aparato cuantifica por
medio de la refracción de un haz de luz, provocado por los sólidos en suspensión, la
cantidad de azúcares solubles en ella. Esta cantidad es ponderada por medio de
grados brix, cuya conversión a porcentaje de azúcares solubles depende de los
componentes de la solución.
La forma normal de operación consiste en obtener una solución por medio de
extracción manual desde el tejido vegetal y situar una gota en el lector del aparato. Al
dirigir el visor hacia el haz de luz, se obtiene un quiebre de color en éste y la línea
divisora marca el grado brix correspondiente.
En este ensayo se utilizó un refractómetro ATC, con un rango de operación de 0
a 16 grados brix.
Con el objetivo de evaluar su potencial para medir azúcares, se procedió a
realizar un estándar que incluyera los compuestos mayoritarios de extractos vegetales.
Estos incluyeron glucosa, fructosa, sacarosa, almidón, pectina y BSA como modelo de
proteína. Las concentraciones utilizadas fueron aumentando en una unidad porcentual,
desde 1% hasta 16%, de manera de simular las concentraciones presentes en las
plantas. Se introdujo una gota de cada una de las soluciones dentro del lector del
refractómetro, así como también combinaciones de ellas y se registró el número de
grados Brix que arrojó. Las mediciones se realizaron dos veces por cada
concentración.

b) Método físico sobre extracto clarificado:Para eliminar las interferencias debidas

a proteínas, almidones y pectinas, se aplicó una clarificación dependiente de hidróxido
de Bario y sulfato de Zinc.
La aplicación de óxido de Bario y sulfato de Zinc permite clarificar la muestra,
extrayendo por completo la proteína presente en los extractos. Para lograr la
clarificación, se agregó a 1 ml de extracto, 1 ml de hidróxido de Bario y se agitó por un

48
minuto en un Vortex. Luego de esto, se adicionó 1 ml de sulfato de Zinc y se filtró con
papel Whatman nº1. Una gota de filtrado fue utilizada para la medición de azúcares
por medio del refractómetro.
c) Método Químico : McDonald & Henderson (1964) basado en el reactivo
de Somogyi (1938). El sistema empleado fue la metodología propuesta por McDonald
& Henderson (1964), utilizando la propiedad de reducción del cobre de los azúcares
reductores. La base de este sistema es el reactivo de Somogyi (1938), el cual provoca
una reacción entre el óxido de cobre y el arsenomolibdato en los azúcares reductores
presentes. Esto provoca un cambio de color de la solución, cuya intensidad es medida
en un espectrofotómetro ( Spectronic). Este instrumento provoca el paso de un haz de
luz de intensidad conocida, a través de una solución determinada. El nivel de extinción
del haz es registrado y por medio de una ecuación previamente derivada de la
calibración con cantidades conocidas de soluciones, se obtiene el valor en cuestión.

6.1.2. Sustratos utilizados

Se evaluó la metodología de determinación de azúcares realizando un perfil de

carbohidratos no estructurales en diversas especies forrajeras : Alfalfa (Medicago
sativa) , Trébol rosado (Trifolium pratense), Trébol blanco (Trifolium repens), mezcla de
Ballica (Lolium perenne) y Festuca (Festuca pratensis), Maíz (Zea mais)

6.1.3. Preparación de muestras

Las seis muestras de cada una de las especies fueron tomadas desde diversos
predios de la zona central de Chile y almacenadas con hielo seco en recipientes
aislados hasta llegar al laboratorio para su análisis.
Aproximadamente 200 gramos de muestra verde, fueron cortados hasta un tamaño de
2 a 3 centímetros y posteriormente homogeneizados para tomar una submuestra de 25
gramos. Estas fueron pesadas en una balanza con una precisión de centésimas de
gramo. Paralelamente, 100 gramos fueron utilizados para medir materia seca. El resto
de las muestras, fueron almacenadas a –20 ºC para posteriores análisis.

49
6.1.4. Metodología analítica
Se determinó el contenido de materia seca de las muestras pesando
aproximadamente 100 gramos de muestra verde y secando en estufa a 60 ºC por 48
horas.
Los carbohidratos solubles totales se determinaron en base a McDonald & Henderson
(1964) según el siguiente protocolo:

A. Preparación de la muestra a analizar

a) 25 grs de forraje (base materia verde)
b) Se agregó 200 ml de agua destilada y se maceró en macerador top-drive por
5 minutos.
c) Remoción del residuo fibroso por medio de filtración en paño común (tamiz
0.01mm).

B. Clarificación de la muestra
a) A 100 ml del filtrado se le agregó 5 ml de ácido sulfúrico 0,1 N.
b) Se llevó a punto de ebullición para la coagulación de proteína
c) Se filtró con papel Whatman (Nº 1) lavando el residuo con agua destilada, y
se aforó a 250 ml.

C. Hidrólisis de sacarosa y fructosanos

a) Se agregó 1 ml de ácido sulfúrico 2N a 3 ml de la muestra clarificada en un
tubo de ebullición tapado con un condensador frío.
b) Se ingresó el tubo en Baño María por 10 minutos
c) Se dejó enfriar por 5 minutos
d) Se trasvasijó a vaso precipitado de 25 ml y se llevó a neutralidad de rojo
metilo, con hidróxido de sodio (2N y luego 0,1 N)
e) Se aforaron con agua destilada a un volumen de 25 mlf) A 0,5 ml de
anterior se le adicionó 0.5 ml de reactivo de Somogyi y se llevó a Baño María
por 12 minutos tapado con condensador frío.

g) Se enfrió por 5 minutos en agua fría y se agregó 0,5 ml de arsenomolibdato

h) Se diluyó con 3,5 ml de agua destilada.

50
 i) Se dejó reposar las muestras por 30 minutos y se leyó en espectrofotómetro
a 540 nm.
Paralelamente, se elaboró una curva de calibración con un estándar de glucosa.
Por medio de la ecuación obtenida, se obtuvieron los valores de carbohidratos solubles
de cada muestreo. Esta curva fue revisada con regularidad, de manera de evitar
variaciones producidas por temperatura de medición.

6.1.5 Comprobación de Sensibilidad de Metodología

Para comprobar la sensibilidad de las metodologías, se procedió realizar una
calibración. Para esto se agregó a la muestra de pasto, cantidades conocidas de
sacarosa disueltas en el volumen de agua con que son maceradas . De esta forma, se
realizaron determinaciones en paralelo del contenido de azúcares reductores, tanto a la
muestra sin sacarosa, como a la que se agregó sacarosa con 6 repeticiones para cada
caso.

6.2 ENSAYO 2: EFECTO DEL PREMARCHITADO EN EL CONTENIDO DE

CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES.

6.2.1 Metodología

El ensayo fue llevado a cabo en Diciembre de 2001 y se midió la variación de

azúcares en tres niveles de marchitamiento: 0, 1 y 2 días.
Se procedió a delimitar tres parcelas de 6 x 30 mts cada una por medio de
estacado, representando cada una, una repetición. De esta forma, cada una de estas
repeticiones constó con muestreo al inicio y al final de dos días para detectar variación
de carbohidratos y de muestreos intermedios para monitorear evolución de materia
seca.
Respecto al almacenamiento de las muestras, durante el traslado al laboratorio
para sus análisis, se dispusieron en doble bolsa de polietileno sellada y se emplearon
recipientes aislados con hielo seco en su interior. Esto garantizó la disminución de la
temperatura a nivel cercano a congelamiento de las muestras.

51
6.2.2 Sustrato utilizado
Se utilizaron praderas de alfalfa (Medicago sativa) en estado botón, de tercer
año y segundo corte del Centro Experimental de la Pontificia Universidad Católica de
Chile, ubicados en Pirque, Región Metropolitana.

6.2.3 Equipamiento
Para cortar diariamente el forraje, se utilizó un segadora propiedad del Centro
Experimental, con un ancho de corte de 3,0 mts. dejando hilerada la Alfalfa (ancho de
1.5 mts), incluyendo 3 hileras por parcela. Para el almacenamiento del forraje, se
empleó recipientes aislados de 0,3 m3 de volumen y con cinco kilos de hielo seco cada
uno.
Se registró diariamente la temperatura ambiental en la caseta meteorológica de
la Estación Experimental. La humedad relativa se determinó haciendo mediciones con
termómetro de bulbo húmedo debidamente calibrados.

6.2.4 Tiempo de secado y muestreo

El corte se realizó entre las 9 y 10 de la mañana, y se procedió a muestrear
cada tres horas para determinar el cambio en materia seca. Dentro de las tres hileras
que se formaron producto del corte, se extrajo 2 muestras al azar por oportunidad de
muestreo.
A las 10:00 horas AM y a las 19:00 horas PM, se midieron los cambios de la
fracción de carbohidratos no estructurales, tomándose para tal efecto dos mediciones
conformadas por las dos muestras cada vez.
Cada muestra fue de aproximadamente 1.5 kg de materia seca de donde se
obtenían submuestras para realizar la medición de los azúcares.

6.2.5 Diseño experimental

El experimento fue un diseño de bloques completos al azar, en donde cada uno
de los tres días representó una repetición (bloque) del experimento. Para cada tiempo
de secado, se tomaron dos muestras.
Se midió el contenido de carbohidratos no estructurales totales y carbohidratos
solubles al inicio y al final de cada día. Por diferencia, se estimó el contenido de
almidón. Para comprobar si existían diferencias en el contenido de los diferentes tipos

52
de carbohidratos no estructurales durante los días de secado, se realizó una
comparación de medias mediante la prueba de Tuckey-Kramer.

6.2.6 Metodología utilizada para determinación de azúcares.

La metodología empleada para la medición de azúcares solubles fue la misma
descrita para la evaluación química del Ensayo 1.
Para la medición de los carbohidratos no estructurales totales, sin considerar pectinas,
se procedió de acuerdo al siguiente protocolo:
a) Se agregó 0,2 ml de amiloglucosidasa (SIGMA) y 0,5 ml de ALFA-amilasa
(SIGMA) a 100 ml de extracto de planta
b) Se adicionó 0,05 ml de un preparado de Azida de Sodio (2 N).
c) Se incubó por 24 horas con agitación constante, a 28 °C y en un medio
anaeróbico.
Se analizó el contenido de azúcares como se describió anteriormente con la
metodología de Somogyi.

6.3 ENSAYO 3: EFECTO DEL PICADO Y LA INOCULACION EN LA VELOCIDAD

DE CAIDA DE pH EN DISTINTOS ENSILAJES.
6.3.1 Sustratos utilizados
Los forrajes utilizados para estos ensayos fueron dos gramíneas y dos
leguminosas cosechadas en Mayo de 2001. Las gramíneas utilizadas fueron Avena
(Avena sativa) y una mezcla de Pasto Ovillo (Dactylis glomerata) y Bromo (Bromus
innermis) , todas en estado vegetativo (fin de macolla). Las leguminosas fueron Alfalfa
(Medicago sativa) en estado de prebotón (según escala Zadoks) y Trébol Blanco
(Trifolium repens) en estado vegetativo.
Todos los forrajes fueron obtenidos en diversos predios de la Región
Metropolitana y trasladados hasta los laboratorios de la Universidad Católica en
recipientes aislados, con hielo para mantener la temperatura cercana a los 0 ºC en el
interior. De esta manera se buscó disminuir al máximo la actividad enzimática
endógena de la planta.

53
6.3.2 Elaboración de microsilos, tamaño de picado, inoculación y llenado.

Microsilos.
Se utilizó tubos de pyrex con una dimensión de 15 cm de largo y un diámetro de
2,5 cm, con un volumen de 73,6 cm3. En su parte superior poseían una rebarba
diseñada para fijarlos al incubador. Se instaló en ellos un tapón de goma que poseía
dos jeringas para el escape de gases, conectadas éstas en su exterior con tubos de
ensayo con vacío. Esto permitió el desplazamiento del oxígeno residual y la capturar
tanto los gases de fermentación como los efluentes producidos en forma de espuma
con el gas. Entre el pasto y las jeringas se agregó una malla de acero inoxidable que
evitaba el contacto directo entre el forraje y la cabeza de entrada para evitar el
taponamiento de las agujas. Al cabo de las primeras 24 horas de iniciada la incubación
se procedió a cambiar los tubos de vacío para evitar sobrecarga de gases y/o efluentes
y su consecuente explosión.
Los microsilos fueron dispuestos al azar dentro de la cámara de incubación.
Esta consistió en una caja de 50 cm de ancho y 40 cm de alto y fondo. Bajo esta caja
y conectada directamente a ella, se instaló un sistema de ventiladores y generadores
de temperatura, separados del receptáculo anterior por medio de rejillas dispersoras
del flujo de aire . En el centro de la cámara con los microsilos se ubicó el termostato.
En la cara superior se hizo perforaciones del mismo diámetro de los tubos (microsilos);
estos quedaban suspendidos en su rebarba del extremo. La temperatura de
fermentación fue de 28 ºC (+/- 0,3°C), monitoreada constantemente por medio de un
termómetro digital. Esta temperatura buscó estimular el crecimiento bacteriano, ya que
el óptimo de crecimiento para la mayoría de las especies ácido lácticas es cercano a
los 30 ºC (Sneath, et al., 1986, citado por McDonald et al., 1991). En el Anexo A se
observa una imagen del sistema inoculador y de los microsilos.

Tamaño de picado.
El picado normal del forraje utilizado en el laboratorio para ensayos en microsilos de
menos de 1000ml ha sido tradicionalmente de 2,5 a 3,0 cm, representando una
situación cercana al picado con maquinaria de campo. Con el objeto de acelerar el
proceso de fermentación se probó dos tamaños de picado inferiores al señalado, lo
cual permitiría un contacto más pronto de las bacterias con los sustratos y a la vez

54
reduciría la posible interferencia de residuos de oxígeno al mejorar la calidad de la
compactación.

En consecuencia, se probó tres tamaños de partícula :

Tamaño Grueso (G) : picado a 2,5 a 3,0 cm utilizando tijeras manuales.
Tamaño Mediano (M) : picado a 1,0 a 1,5 cm utilizando tijeras manuales.
Tamaño Fino (F) : macerado en un homogenizador top-drive por el espacio de 30
segundos por carga (250 grs aproximadamente en base a materia verde).

Inoculación.
Cada tamaño de picado fue dividido y una mitad recibió inoculación de bacterias ácido
lácticas (Lactobacillus plantarum y Enterococcus faecium), asegurando una población
cercana a las 106 UFC/g materia verde y la otra mitad no recibió inóculo. Cada silo fue
elaborado en triplicado.
El relleno de los microsilos fue realizado de manera rápida y compactando cada
capa ingresada por medio de un mortero especial, de manera de asegurar la máxima
eliminación de aire del interior. Inmediatamente se procedió con el tapado y generación
de anaerobiosis.

6.3.3 Muestreo
Se muestrearon los ensilajes a las 18, 36 y 54 horas de iniciado el proceso.
Para cada hora se midió el pH en las tres repeticiones para cada tratamiento.
Para medir pH se realizó una extracción de 20 gramos verde de cada microsilo
y se agregaron 100 ml de agua destilada. Esta mezcla fue agitada a temperatura
ambiente por espacio de media hora (Wilson, y Melvin, 1972), luego de lo cual fue
filtrada. Se midió el pH en la solución filtrada mediante un pH-metro con una precisión
de 2 décimas de unidad. Luego de registrado el valor, se le agregó 0,5 ml de un
preparado de azida de sodio (2N) y fue refrigerado por un lapso de 12 horas.

6.3.4 Diseño experimental

El diseño experimental fue de bloques completos al azar con tres repeticiones,
con estructura factorial 3 x 2, siendo los tratamientos tres tamaños de picado (factor a)
y aplicación de inoculante bacteriano (factor b). Para la comparación de medias de pH

55
se utilizó una prueba de Tuckey-Kramer y la significancia de las diferencias se
estableció con una confianza de un 95%.

6.4 ENSAYO 4: CAIDA INICIAL DE pH COMO PREDICTOR DEL pH EN EL

ENSILAJE ESTABILIZADO.

6.4.1 Sustratos utilizados

Se buscó tener diferentes escenarios en los ensilajes, por lo que los
tratamientos se diseñaron para obtener cuatro tipos de fermentaciones:
a) Gramínea con fermentación láctica breve o restringida,
b) Gramínea con fermentación en base a flora epifítica normal,
c) Leguminosa con fermentación en base a flora epifítica normal, y
d) Leguminosa con fermentación en base a inoculación de microorganismos
indeseables, principalmente clostridios.

En el mismo orden anterior, los tratamientos fueron :

a)Pasto Ovillo suplementado con sacarosa al 2,5% de la materia verde e inoculado
con un preparado de enzimas ácido lácticas;
b) Pasto Ovillo sin aditivos;
c) Alfalfa sin aditivos; y
d) Alfalfa inoculada con un preparado enriquecido en clostridios.

6.4.2 Tamaño de picado, inoculación y llenado de los silos.

En este ensayo se utilizaron dos tamaños de picado: uno Grueso (2.5-3.0cm) y
otro Fino (macerado), representando un control y el tamaño fino que en los primeros
ensayos resultó de mayor interés. El llenado y tapado de cada silo fue realizado de la
misma manera descrita en el ensayo anterior.
El preparado bacterial utilizado para el caso de la inoculación láctica, fue un
inoculante PIONEER 1174 que contenía sólo bacterias ácido lácticas (Lactobacillus
plantarum y Enterococcus faecium) y sin enzimas, de manera de eliminar el efecto de
generación de azúcares solubles extras y limitarse solamente a estudiar el efecto de
inoculación con bacterias. Para asegurar la viabilidad de las bacterias, se hizo recuento
de UFC en medios específicos.

56
 Para el caso de la inoculación de la Alfalfa con clostridios, se generó un cultivo
específico para generar el material. Para esto se incubó tierra de un sector anegado
próximo a los establos, en un medio rico en proteína (BSA) , sacarosa, macro y micro-
minerales, en un ambiente saturado de CO2 y a 38,5 ºC por 48 horas.
Todos los tratamientos fueron realizados en duplicado.

6.4.3 Equipamiento
Se utilizó los mismos materiales empleados para el caso del experimento 2.

6.4.4 Muestreo
El pH fue muestreado con dos repeticiones a las 12, 24, 36, 48, 96, 144 y 720
horas de iniciada la incubación, para cada uno de los cuatro experimentos en que fue
dividido este ensayo. La medición de pH fue llevada a cabo de la misma manera que
en el ensayo 2.

6.4.5 Diseño experimental

Se realizaron mediciones repetidas en el tiempo para ver las tendencias en el
comportamiento de cada ensilaje. Se realizó comparación de tasas de acidificación
entre los diversos tratamientos.

57
7 RESULTADOS Y DISCUSIONES

7.1 METODOLOGIA PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO DE

AZUCARES FERMENTABLES

Los resultados arrojaron lectura de glucosa, fructosa, sacarosa, BSA,

cuantificados en la misma magnitud, esto es, una solución al 1% de cada uno
representaba 0,75 grados Brix (ver cuadro 1). La pectina también fue registrada por el
refractómetro pero en magnitudes sin patrón definido, debido probablemente a su
característica de dificultad de lograr una disolución uniforme en solución acuosa.
Desde la dilución de 8% de pectina, no se continuó con los registros debido a lo
errático de las mediciones.

Cuadro 1. Lectura de refractómetro de soluciones conocidas.

Glucosa Fructosa Sacarosa Almidón Pectina BSA
Sustrato (%) Grados BRIX
1 0.75 0.75 0.75 0 0.00 0.75
2 1.50 1.50 1.50 0 0.75 1.50
3 2.25 2.25 2.25 0 1.00 2.25
4 3.00 3.00 3.00 0 2.00 3.00
5 3.75 3.75 3.75 0 2.00 3.75
6 4.50 4.50 4.50 0 4.00 4.50
7 5.25 5.25 5.25 0 4.00 5.25
8 6.00 6.00 6.00 0 ---- 6.00
9 6.75 6.75 6.75 0 ---- 6.75
10 7.50 7.50 7.50 0 ---- 7.50
11 8.25 8.25 8.25 0 ---- 8.25
12 9.00 9.00 9.00 0 ---- 9.00
13 9.75 9.75 9.75 0 ---- 9.75
14 10.50 10.50 10.50 0 ---- 10.50
15 11.25 11.25 11.25 0 ---- 11.25
16 12.00 12.00 12.00 0 ---- 12.00
d.e. 0 0 0 0 1,28 0

58
 Debido a que el refractómetro registra la proteína y sustancias como pectinas
(cuadro 1) lo que hace al sistema perder precisión al tener las especies forrajeras
contenidos considerables de estos elementos, se intentó clarificar la muestra dejando
solamente los azúcares solubles. Para esto se intentó la clarificación por medio de
hidróxido de bario y sulfato de zinc, además de coagulación ácida. Ambos métodos
requieren de extracción del líquido de la planta en cuestión, y una serie de diluciones
para la obtención de un extracto limpio de contaminantes. Estas diluciones obligadas,
provocan que la lectura en el refractómetro sea muy errónea e imprecisa, debido a que
son obtenidas en los puntos más bajos de éste.
Campbell, y Hume (1970), mencionan lo adecuado que resulta el refractómetro
para la medición de azúcares solubles en maíz. La metodología empleada fue de
extracción directa de líquido de la hojas y tallo de maíz por presión y lectura directa de
éste en el refractómetro. Al ser el contenido de proteína muy bajo en maíz presto a ser
ensilado, y dado que presenta muy bajo contenido de pectina, la alteración del
contenido de azúcares resulta muy baja. Sin embargo, al emplearse esta forma de
medición de azúcares en pastos como ballicas, festucas , pasto ovillo y otros, en donde
el contenido de proteína es más alto, y principalmente en leguminosas en donde se
suma la existencia de pectinas, esta metodología presenta severas limitaciones. Sin
embargo, queda abierta la posibilidad de seguir investigando en esta línea,
posiblemente concentrando la muestra una vez realizada la clarificación.

7.1.2 Medición de azúcares con reactivo de Somogyi.

Curva standard de calibración.

La calibración de la metodología basada en la reacción del cobre con los azúcares
reductores, comenzó con la adaptación de la técnica utilizada por McDonald-
Henderson (1964). Se utilizó como sustrato standard Glucosa (Sigma G2899) y se
midió la absorbancia a 540 nm. La función fue rectilínea entre las concentraciones de
0.05 y 0.23 mg de glucosa/ml. con una leve distorsión entre 015 y 0.18 mg glucosa/ml
(figura 1).

59
 0.3

0.25 y = 0.1525x + 0.0061

2
r = 0.9982
0.2
mg Hexosa/ml

0.15

0.1

0.05

0
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60
absorbancia

Figura 1. Curva standard con sustrato de glucosa para la medición de azúcares reductores.

Interferencias en forrajes crudos.

Diversas mediciones espectrofotométricas en el laboratorio han mostrado interferencia
de macromoléculas como proteínas, pectinas, almidones y otros. Para estudiar cómo
se afectaría la medición de azúcares, se agregó cantidades crecientes de sacarosa a
una muestra basal de alfalfa, debido a que este forraje ha presentado dicho tipo de
problemas con otras substancias. El contenido original de azúcares solubles de la
Alfalfa fue de 6,6 % + 0,052 (base M.S.) y se agregó las cantidades que se indica en el
Cuadro 2.

Cuadro 2. Mediciones de azúcares reductores con recuperación de sacarosa.

Sacarosa (gr) Recuperación (gr) d.e. % de recuperación
0.1 0.119 0.008 118.6 %
0.4 0.385 0.005 96.2 %
0.5 0.498 0.005 99.6 %
0.8 0.795 0.005 99.4 %
1 0.974 0.035 97.4 %
1.2 1.165 0.034 97.0 %
1.6 1.528 0.003 95.5 %
2 1.955 0.011 97.7 %
Número de repeticiones =6

60
La recuperación fue muy exitosa, por sobre el 96%, lo cual permite utilizar el método de
azúcares reductores de Somogyi en forrajes crudos, sin extracciones de substancias
que pudieran interferir. Solamente la medición en la concentración más baja,
equivalente a 10 mg Glucosa/ml, la medición no fue buena y se recuperó más del
100% de los azúcares existentes, lo cual puede atribuirse a la baja cantidad agregada,
que puede resultar en baja sensibilidad a cantidades muy pequeñas de azúcares.

Repetibilidad.
Con el objeto de conocer la repetibilidad del muestreo y determinación de azúcares
aplicado a forrajes, se colectó y analizó un número elevado de repeticiones en diversas
especies y en distintos estados de crecimiento. El resumen de mediciones se presenta
a continuación (cuadro 3).

Cuadro 3. Porcentajes de carbohidratos en especies y mezclas forrajeras.

Especie Característica n Total Azúcares Glucosa + Fructosa
(estado fenológico) Solubles (% base M.S.)
(% base M.S.)

Promedio d.e. CV Promedio d.e. CV

Ballica perenne-Festuca Vegetativo tardío 10 15.59 1.11 0.071 7.93 0.31 0.039

Ballica perenne-Festuca Vegetativo inicial 2 4.79 0.32 0.067 1.84 0.01 0.005

Trébol blanco 30 % Flor 4 11.37 0.23 0.020 6.75 0.18 0.027

Trébol rosado Vegetativa 9 6.26 0.55 0.088 3.99 0.11 0.028

Alfalfa 90% Flor 4 10.47 0.22 0.021 5.09 0.01 0.002

Alfalfa Vegetativa 6 4.29 0.24 0.056 2.20 0.11 0.050

Maíz Grano pastoso 6 14.28 0.12 0.008 8.88 0.14 0.016

El contenido de total de azúcares solubles incluye sacarosa y en el caso de

gramíneas fructosanos, es por aquella razón que se muestran en cálculo separado
para separarlo de las hexosas. Las bajas desviaciones estándar que se observaron
dentro de cada tipo de pradera confirman que un muestreo en un mismo día en
diferentes sectores de una pradera permite obtener datos consistentes respecto a su
concentración de azúcares, lo cual constituye un elemento importante para el objetivo
de este trabajo. Las cantidades presentadas en el cuadro anterior, son semejantes con
los valores reportados en la literatura (McDonald et al, 1990).

61
7.2 EFECTO DEL PREMARCHITADO EN EL CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS
SOLUBLES.

7.2.1 Medición de evolución de azúcares en premarchitado

La evaluación de los datos generados a partir del ensayo de corte en alfalfa,
mostró una disminución progresiva del contenido total de carbohidratos no
estructurales de las plantas (Cuadro 4). Esto es consistente con lo reportado por
Melvin y Simpson (1963) y por Wylam (1953) en donde se deja de manifiesto, que
producto de la respiración propia de la planta, el contenido de azúcares no
estructurales totales baja. La fotosíntesis que puede generarse durante el período de
secado es muy baja y tiende a presentarse principalmente en las capas superiores de
la hilera (Nash, M.J., 1959, citado por McDonald et al.,1991).

Cuadro 4. Cambio en la fracción de carbohidratos no estructurales en

premarchitamiento de alfalfa.
Tiempo M.S. % d.e. CHO d.e. Almidón (% d.e. Total CHO no d.e.
Solubles M.S.) estructurales
(% M.S.) (%)
Prom. Hora 0 21.10 (a) 0.98 7.59 (a) 0.09 9.84 (a) 0.82 17.44 (a) 0.91

Prom. Hora 10 33.05 (b) 5.55 7.97 (a) 0.47 2.85 (b) 0.17 10.82 (b) 0.34

Prom. Hora 32 58.40 (c) 8.51 7.49 (a) 0.75 1.01 (c) 1.34 8.51 (c) 1.72

Letras distintas dentro de columna representan diferencias significativas (p<0.05)

El resumen de los tres ensayos muestra una disminución constante del

contenido de carbohidratos no estructurales totales (anexo 1).
La desviación estándar del contenido de almidón es relativamente mayor que la
presentada por los carbohidratos solubles y esto puede atribuirse a que es una fracción
muy dinámica cuyo contenido aumenta o disminuye a lo largo del día a medida que
ocurren excedentes o déficit de azúcares simples para el metabolismo de la planta.
Además, esta fracción de carbohidratos de reserva es calculada como la diferencia
entre los carbohidratos solubles y los carbohidratos no estructurales totales.
Es destacable al observar la figura 2, que la fracción que más sufre una
disminución es la de carbohidratos de reserva, en este caso almidón. Esto se debería
probablemente, a que la planta al mantener la respiración mientras mantiene un cierto
nivel del humedad interior, debe mantener su stock de sustratos respirables más o
menos constante. Debido a que los carbohidratos solubles, principalmente glucosa y

62
fructosa son los utilizados para este fin, las enzimas endógenas de la planta estarían
actuando sobre almidón para generar las hexosas necesarias para la respiración.
En este trabajo se observa una disminución cercana a 50% en el contenido de
CNET, provocada solamente por la disminución en el contenido de almidón desde 10%
a 1% al cabo de 32 horas post-corte.
La disminución del contenido total de CHO no estructurales de las plantas
durante el secado, es mencionado por Clark (1973), en donde destaca que el
contenido de glucosa tiende a mantenerse constante durante un período de
premarchitamiento de 48 horas.

Figura 2. Efecto del marchitamiento sobre las fracciones de carbohidratos no estructurales en

alfalfa en base a materia seca

La metodología de determinación de Almidón puede haber hidrolizado parte de

otros carbohidratos debido al sistema de incubación utilizado precio a la determinación
de los azúcares reductores. Debido a esta razón, se denominó carbohidratos de
reserva a la diferencia entre la totalidad de carbohidratos no estructurales (CNE) y los
azúcares reductores. Al expresar los resultados en términos de materia verde, se
observa el aumento en la concentración de los carbohidratos, producto del aumento en
el porcentaje de materia seca al avanzar el premarchitado (figura 3). De esta manera,
si bien la cantidad de azúcares solubles tiende a mantenerse estable en base a materia

63
seca, su concentración aumenta, generando una mejor condición para la conservación
del pasto vía ensilaje (Suwarno et al., 1999). Esta es una de las razones por la cual se
premarchita previo a ensilar.

Figura 3 Efecto del premarchitado sobre la concentración de carbohidratos no estructurales en

alfalfa, expresado en base a materia verde.

Destaca que si bien el material original no presenta el contenido necesario de

sustrato fermentable para ser ensilado, al final del primer día se alcanza un 2,9% de la
materia verde, lo cual supera el nivel crítico de concentración de azúcares en la
fitomasa para ensilar exitosamente el forraje, (Pettersson, K.L., y Lindgren, S., 1990).

7.3 EFECTO DEL PICADO Y LA INOCULACION EN LA VELOCIDAD DE CAIDA DE

pH EN DISTINTOS ENSILAJES.

7.3.1 Efecto del tamaño de picado sobre la dinámica de acidificación del ensilaje.
En general se observó un lento aumento de la acidez en las primeras 18 h de
fermentación, siendo un poco mayor en el tamaño de partícula más fino. Asimismo,
mientras más fino fue el picado, más rápida fue la acidificación entre las 18 y las 54
horas de fermentación. En iguales condiciones de población microbiana, la alfalfa

64
mostró una menor velocidad de acidificación posiblemente debido a su alta capacidad
buffer y a un bajo nivel de azúcares fermentables (Cuadro 5).

Cuadro 5. Efecto del tamaño de picado sobre la dinámica de acidificación del ensilaje
con microflora epifítica.
TIEMPO TAMAÑO CORTE
Grueso Mediano Fino
pH + DE pH + DE pH + DE
(horas) 3,0-2,5 (cm) 1,5-1,0 (cm) M-0,5 (cm)
pH + DE pH + DE pH + DE
Ovillo-Bromo 0 hrs 6,1 6,1 6,1
18 hrs 6,1 (0,02)a 6,1 (0,02)a 5,9 (0,02)a
36 hrs 5,4 (0,07)a 4,5 (0,13)b 4,3 (0,11)b
54 hrs 4,4 (0,05)a 3,9 (0,02)b 3,8 (0,01)b
Avena 0 hrs 6,2 6,2 6,2
18 hrs 6,1 (0,03)a 6,1 (0,03)a 5,5 (0,16)b
36 hrs 5,4 (0,08)a 4,6 (0,19)b 4,0 (0,03)c
54 hrs 4,3 (0,04)a 4,0 (0,02)b 3,8 (0,04)c
Trébol Blanco 0 hrs 6,2 6,2 6,2
18 hrs 5,9 (0,08)a 5,5 (0,06)b 5,3 (0,04)c
36 hrs 5,3 (0,05)a 4,9 (0,18)b 4,7 (0,05)c
54 hrs 4,3 (0,06)a 4,0 (0,11)b 3,7 (0,01)c
Alfalfa 0 hrs 6,2 6,2 6,2
18 hrs 6,0 (0,03)a 6,0 (0,04)a 5,8 (0,02)b
36 hrs 5,7 (0,38)a 5,0 (0,05)b 4,6 (0,22)c
54 hrs 5,0 (0,04)a 4,9 (0,05)a 4,2 (0,01)b

Letras diferentes en misma fila indican diferencias significativas (p<0,01) según prueba de
Tuckey-Kramer. Valores entre paréntesis representan desviaciones estándar del promedio.

Avena y Pasto Ovillo presentan una disminución más fuerte de pH que las dos
leguminosas a las 36 horas, en el corte fino. El análisis estadístico mostró diferencias
significativas (p<0,01) para el tamaño de picado fino en comparación con los otros dos
tamaños, para Avena, Trébol blanco y Alfalfa. En el caso de Pasto Ovillo-Bromo a la
hora 18 y 54 el tamaño fino no mostró diferencias comparado con el tamaño mediano.
De esto se desprende, que el tamaño más fino sí muestra una aceleración de caída de
pH al compararlo con el pasto menos trozado.

65
 6.50

6.00

5.50

5.00
G
pH

4.50 M
F
4.00

3.50

3.00

2.50
0 18 36 54
Tiempo de fermentación (h)

Figura 4. Efecto del tamaño de picado sobre la evolución de la acidez en un ensilaje de

bromo-pasto ovillo. Fermentación con microflora epifítica natural.

6.50
6.00
5.50
5.00 G
pH

4.50 M
4.00 F

3.50
3.00
2.50
0 18 36 54
Tiempo de fermentación (h)

Figura 5. Efecto del tamaño de picado sobre la evolución de la acidez en un ensilaje de avena.
Fermentación con microflora epifítica natural.

66
 6.50
6.00
5.50
5.00 G
pH

4.50 M
4.00 F

3.50
3.00
2.50
0 18 36 54
Tiempo de fermentación (h)

Figura 6. Efecto del tamaño de picado sobre la evolución de la acidez en un ensilaje de trébol
blanco. Fermentación con microflora epifítica natural.

6.50
6.00
5.50
5.00 G
pH

4.50 M
4.00 F

3.50
3.00
2.50
0 18 36 54
Tiempo de fermentación (h)

Figura 7. Efecto del tamaño de picado sobre la evolución de la acidez en un ensilaje de alfalfa.
Fermentación con microflora epifítica natural.

7.3.2 Efecto del tamaño de picado y de la inoculación sobre la dinámica de

acidificación del ensilaje.

Los resultados muestran que los forrajes inoculados con bacterias ácido-lácticas
tuvieron una significativa caída en e pH ya en las primeras 18 horas de fermentación.

67
Asimismo, en las gramíneas se observó que mientras más fino fue el picado, más
rápida fue la acidificación inicial (18 h); en las leguminosas en cambio, la caída en pH
fue menor en el tamaño más grueso, y no se observó diferencias entre los dos
tamaños de picado menores.
El macerado provoca un mayor acceso de las bacterias a los sustratos fermentables de
la planta. Este efecto es notorio principalmente en tiempos iniciales, en donde se
produce el crecimiento exponencial de las bacterias epifíticas y de aquellas agregadas
vía inoculación (cuadro 6).

Cuadro 6. Efecto del tamaño de picado sobre la dinámica de acidificación del ensilaje con
aditivos.
TIEMPO TAMAÑO CORTE
Grueso Mediano Fino
pH + DE pH + DE pH + DE
(horas) 3,0-2,5 (cm) 1,5-1,0 (cm) M-0,5 (cm)
Ovillo-Bromo 6,1 6,1 6,1
18 hrs 5,6 (0,03)a 4,7 (0,03)b 4,0 (0,01)c
36 hrs 4,7 (0,07)a 4,0 (0,02)b 3,7 (0,02)c
54 hrs 4,1 (0,03)a 3,9 (0,01)b 3,7 (0,02)b
Avena 6,2 6,2 6,2
18 hrs 5,3 (0,06)a 4,5 (0,05)b 4,3 (0,05)b
36 hrs 4,4 (0,11)a 3,8 (0,03)b 3,8 (0,01)b
54 hrs 4,0 (0,03)a 3,8 (0,05)b 3,8 (0,01)b
Trébol Blanco 6,2 6,2 6,2
18 hrs 5,4 (0,05)a 4,8 (0,18)b 4,8 (0,07)b
36 hrs 4,5 (0,06)a 3,9 (0,01)b* 3,8 (0,03)b*
54 hrs 4,0 (0,04)a 3,9 (0,01)b* 3,7 (0,02)b*
Alfalfa 6,2 6,2 6,2
18 hrs 5,7 (0,02)a 5,0 (0,01)b 5,2 (0,06)c
36 hrs 5,1 (0,03)a 4,6 (0,03)b 4,2 (0,00)b
54 hrs 4,7 (0,04)a 4,5 (0,06)a 4,2 (0,02)b
Letras diferentes en misma fila indican diferencias significativas (p<0,01) según prueba de
Tuckey-Kramer y asterisco muestra diferencias significativa con p< 0,05. Valores entre
paréntesis representan desviaciones estándar del promedio.

La consecuencia del tamaño de corte en el ensilaje y la inoculación es muy

marcada al pasar de 3,0 cm a 1,5, en donde se aprecia en todas las especies una
reducción de pH mayor en todos los tiempos de fermentación.. La alfalfa a la hora 54,
finaliza con un pH más elevado que las otras plantas, debido al efecto tampón propio,
el que no es capaz de ser contrarrestado por la inoculación; también se observa en

68
este proceso que la alfalfa con el picado más fino, mantuvo el mismo pH entre la 36 y
54 horas, sugiriendo que ha alcanzado una fase estabilizada.
El macerado provoca un aceleramiento de la caída de pH en el ensilaje
(Charmley et al., 1997) de las especies estudiadas.
A continuación se presentan los gráficos de las caídas de pH para cada forraje
estudiado con aditivo (figuras 8, 9, 10 y 11)

6.50
6.00
5.50
5.00 G
pH

4.50 M
4.00 F

3.50
3.00
2.50
0 18 36 54
Tiempo de fermentación (h)

Figura 8. Efecto del tamaño de picado sobre la evolución de la acidez en un ensilaje de bromo-
pasto ovillo. Fermentación con inoculación de bacterias ácido-lácticas.

6.50
6.00
5.50
5.00 G
pH

4.50 M
4.00 F

3.50
3.00
2.50
0 18 36 54
Tiempo de fermentación (h)

Figura 9. Efecto del tamaño de picado sobre la evolución de la acidez en un ensilaje de avena.
Fermentación con inoculación de bacterias ácido-lácticas.

69
 6.50
6.00
5.50
5.00 G
pH

4.50 M
4.00 F

3.50
3.00
2.50
0 18 36 54
Tiempo de fermentación (h)

Figura 10. Efecto del tamaño de picado sobre la evolución de la acidez en un ensilaje de trébol
blanco. Fermentación con inoculación de bacterias ácido-lácticas.

6.50

6.00

5.50

5.00
G
pH

4.50 M
F
4.00

3.50

3.00

2.50
0 18 36 54
Tiempo de fermentación (h)

Figura 11. Efecto del tamaño de picado sobre la evolución de la acidez en un ensilaje de alfalfa.
Fermentación con inoculación de bacterias ácido-lácticas.

70
7.3.3 Efecto de la inoculación con lactobacilos sobre la dinámica de acidificación
de un forraje.
La consecuencia más importante de la inoculación sobre la caída inicial de pH,
se observa en las primeras horas. Aquí, el efecto de agregar bacterias exógenas,
provoca una fermentación más acelerada, en relación a las bacterias epifíticas. Éstas,
por encontrase en una cantidad inicial reducida, deben pasar por una etapa de
multiplicación y colonización, que en general tiende a ser desde unas horas hasta los 2
días, en donde alcanzarían su máximo (Charmley, E., et al., 1997). Esto se ve reflejado
en la marcada diferencia existente a las 18 horas, al comparar la inoculación con el
forraje original. Posteriormente, luego de las 36 horas, el efecto deja de ser tan notorio,
debido probablemente a que las bacterias epifíticas han logrado reproducirse y generar
una fermentación acorde a su potencial. La evolución gráfica se muestra en las figuras
de los anexos 2, 3, 4, 5.
Las diferencias existentes a esa altura y en adelante, podrían deberse al tipo de
bacterias con las que se inocula. Éstas tienden a ser seleccionadas para presentar un
mejor comportamiento que las epifíticas presentes en el forraje fresco.
Otro factor relacionado al marcado efecto positivo de inoculación sobre la
fermentación, pudo deberse a la época de cosecha del forraje. Debido a que se realizó
en Otoño, en donde las temperaturas son más bajas que en Primavera / Verano, el
número de bacterias presentes en el forraje, pudo verse disminuido. La población de
bacterias epifíticas de un forraje, tienden a aumentar de la misma manera que lo hace
la temperatura (Lin et al., 1992).
Tanto a la hora 18 como a la 36, existe un notorio efecto de la inoculación para
los cortes grueso y mediano en todas las especies. Este efecto podría estar
relacionado con la probable encapsulación contra el oxígeno que generan las bacterias
ácido lácticas (BAL) para protegerse. El líquido liberado al macerar la planta provoca
liberación de manganeso, el que es utilizado por las BAL como secuestrante de
oxígeno. Esto permitiría una mejor subsistencia de las bacterias, a las condiciones
previas a la anaerobiosis (Pahlow y Ruser, 1989, citados por McDonald, 1991). Por
esto mismo, la diferencia entre inoculación con BAL y desarrollo de flora epifítica no
sería tan notoria en el macerado, pero sí en los cortes enteros.

71
 La alfalfa presentó una caída lenta de pH en las primeras horas estudiadas, aún
con la inoculación y con el macerado, lo que corroboraría el efecto fuerte que ejerce el
poder tampón y el contenido de azúcares, sobre la caída de pH de esta planta.
El macerado genera un aceleramiento de las reacciones de fermentación,
provocadas por las bacterias durante el ensilaje. Gráficamente puede observarse esta
situación en las figuras ubicadas en anexos 2, 3, 4, 5.
En el anexo 9 se muestra, mediante un análisis de varianza, la interacción entre
los efectos de picado, inoculación y picado más inoculación.

7.4 RELACION ENTRE LA TASA DE ACIDIFICACIÓN INICIAL Y LA ESTABILIDAD

PROLONGADA DE ENSILAJE.
7.4.1 Caída inicial y estabilidad del pH
Los pH medidos para las diferentes horas en los cuatro tipos de fermentaciones
buscadas son presentados en los cuadros (7, 8, 9, 10) a continuación y gráficamente
en las figuras 12, 13, 14 y 15.

Cuadro 7: Evolución de la acidez en un ensilaje de bromo-pasto ovillo inoculado con bacterias

ácido-lácticas.
Tiempo de fermentación (h)
0 12 24 36 48 96 144 720
pH
Grueso 6,18 6,11 5,16 4,23 4,06 4,19 4,42 4,38
d.e. 0,00 0,02 0,16 0,02 0,01 0,01 0,05 0,07
Fino 6,18 5,89 4,69 3,86 3,82 3,88 3,80 3,80
d.e. 0,00 0,01 0,04 0,02 0,01 0,01 0,00 0,00
Valores bajo los promedios indican la desviación estándar observada.

72
 6.50

6.00

5.50

5.00 Grueso
pH

4.50

4.00 Fino

3.50

3.00
0 100 200 300 400 500 600 700 800
horas

Figura 12 Evolución de la acidez en un ensilaje de bromo-pasto ovillo inoculado con bacterias

ácido-lácticas.

Cuadro 8: Evolución de la acidez en un ensilaje de bromo-pasto ovillo sin inoculación de

bacterias ácido-lácticas.
Tiempo de fermentación (h)
0 12 24 36 48 96 144 720
pH
Grueso 6,18 5,43 4,00 3,72 3,62 3,60 3,52 3,53
d.e. 0,00 0,17 0,02 0,01 0,01 0,00 0,00 0,01
Fino 6,18 4,96 3,94 3,71 3,63 3,58 3,53 3,55
d.e. 0,00 0,08 0,02 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01

6.50

6.00

5.50

5.00 Grueso
pH

4.50

4.00 Fino

3.50

3.00
0 200 400 600 800

horas

Figura 13. pH en distintas horas, en fermentación tipo Láctica restringida.

73
Cuadro 9: Evolución de la acidez en un ensilaje de alfalfa con flora epifíticas.
Tiempo de fermentación (h)
0 12 24 36 48 96 144 720
pH
Grueso 6,10 6,04 6,00 5,79 5,01 4,61 4,48 4,62
d.e. 0,00 0,02 0,03 0,01 0,02 0,11 0,14 0,16
Fino 6,10 5,82 5,89 5,86 5,06 4,28 4,33 4,27
d.e. 0,00 0,02 0,08 0,06 0,06 0,03 0,04 0,04

6.50

6.00

5.50

5.00 Grueso
pH

4.50

4.00 Fino

3.50

3.00
0 200 400 600 800

horas

Figura 14. pH en ensilaje en fermentación de alfalfa con flora epifítica.

Cuadro 10: Evolución de la acidez en un ensilaje de alfalfa con inoculante rico en organismos
indeseables.
Tiempo de fermentación (h)
0 12 24 36 48 96 144 720
pH
Grueso 6,10 6,03 6,06 5,23 4,86 4,54 4,67 4,47
d.e. 0,00 0,04 0,02 0,07 0,07 0,08 0,05 0,01
Fino 6,10 5,74 5,82 5,23 4,25 4,00 4,08 4,03
d.e. 0,00 0,01 0,01 0,04 0,15 0,00 0,04 0,00

74
 6.50

6.00

5.50

5.00
Grueso
pH

4.50

4.00

3.50 Fino

3.00

2.50
0 200 400 600 800
horas

Figura 15. Fermentación de alfalfa con inóculo rico en microorganismos indeseables.

Destaca en Alfalfa en ambos tipo de fermentación, la inestabilidad en la

tendencia del pH en las primeras horas. Esta tendencia se quiebra luego de las 36
horas, en donde las bacterias logran vencer el poder buffer propio de estas especies, y
comienzan a acidificar el medio. Por su parte, la mezcla Pasto Ovillo-Bromo sin
inocular produce el quiebre en el pH a las 24 horas, y la mezcla inoculada con BAL lo
hace a las 12.
Si se analiza detalladamente el pH de cada tipo de fermentación, se puede
mencionar, que para la mezcla de gramíneas sin inoculación, el pH no sufre mayor
variación dentro de las primeras 12 horas, tanto el control como el macerado. El pH a
la hora 24 sufre una gran variación. El picado fino se estabiliza en pH adecuado,
mientras que el picado grueso sufre un aumento de 0,4 unidades de pH entre su punto
más bajo y su estabilización a la hora 144.
La inoculación con BAL y la adición de azúcar, asegura desde la primera
medición, una caída de pH mantenida y estable en el tiempo. El macerado presenta
una caída más temprana, notoria a las 12 horas, pero ya a las 24, ambos tamaño de
picado no muestran diferencias.
Alfalfa no inoculada, genera una zona inestable, cercana a las 36 horas, en
donde no se ve una caída clara en el pH. Esta respuesta podría venir dada por falta de
bacterias BAL, unido por el gran poder buffer que éstas deberían vencer. El pH final
alcanzado insuficiente para lograr una correcta conservación, estaría ilustrando la

75
exigua cantidad de azúcar fermentable que dispusieron las bacterias, o que estas
fueron consumidas en gran parte durante el período de ruptura de poder buffer.
La Alfalfa inoculada con clostridios presentó un comportamiento inicial muy
similar al presentado por la alfalfa no inoculada. La zona de vacilación de pH se da
hasta las 24 horas y sorprendentemente luego de la hora 36, se produce una caída de
pH que no se dio para el caso anterior. Específicamente para esta situación se
esperaba que el dominio clostridial generara el pH más alto de las cuatro tipos de
fermentaciones. Al descartar los factores tradicionales de inhibición clostridial, como
materia seca mayor a 30%, aerobiosis o fuerte acidez temprana, la posibilidad que
queda como agente de supresión sería la producción de nitritos u óxido nitroso por
parte de enterobacterias (Spoestra, S.F., 1983). Si luego de la movilización de estos
productos de degradación proteica las bacterias BAL han producido una suficiente
cantidad de ácido, los clostridios verán suprimida su proliferación (McDonald et al.,
1991).
Si bien las enterobacterias presentan una débil actividad proteolítica, muestran
un gran poder de reducción de nitratos (McDonald et al., 1991). Dado que este tipo de
bacterias tienden a estar altamente correlacionadas con las precipitaciones diarias y la
humedad relativa (Lin et al., 1992), y puesto que este forraje provino de días húmedos
otoñales tardíos, es muy probable que la presencia de nitritos y óxido nitroso
provenientes de enterobacterias, hayan provocado en parte la inhibición clostridial.

7.4.2 TASAS DE ACIDIFICACION DE LOS ENSILAJES

Las tasas de caída de pH en la mezcla Pasto Ovillo-Bromo, son descendentes
en el tiempo, esto es, sus valores máximos son alcanzados al inicio del proceso de
conservación, para posteriormente bajar en magnitud. Los valores de las tasas de cada
tratamiento, pueden observarse en el cuadro 11.

76
Cuadro 11. Tasas de acidificación de ensilajes de mezcla de gramíneas.
Tasa (unidades de pH/hora)
PH Normal Grueso Normal Fino Láctico Grueso Láctico Fino
6,18
6,00 0,143 0,200 0,450 0,450
5,80 0,133 0,164 0,300 0,360
5,60 0,105 0,150 0,300 0,360
5,40 0,091 0,129 0,257 0,257
5,20 0,071 0,106 0,225 0,257
5,00 0,059 0,086 0,164 0,180
4,80 0,043 0,069 0,138 0,150
4,60 0,031 0,050 0,106 0,113
4,40 0,020 0,035 0,072 0,075
4,20 -0,004 0,019 0,045 0,045
4,00 ----- 0,004 0,023 0,021
3,80 ----- -0,002 0,005 0,004
3,60 ----- ----- -0,003 -0,002
La tasa es calculada como la diferencia entre dos pH determinados (0,2 unidades) y el tiempo
requerido para lograrlo, siendo este último propio de cada tratamiento. Para la determinación
del tiempo requerido, se realizó una regresión y se adaptó una ecuación a cada tratamiento
(Anexo 10). Las tasas negativas corresponden a aumentos en el pH.

Para el caso de la Alfalfa, la tasa presenta un aumento dentro de las primeras

0,5-0,6 unidades de pH, en donde alcanza su máximo, para luego declinar al igual que
lo hace la mezcla de gramíneas. Los valores se presentan en el cuadro 12.

Cuadro 12. Tasas de acidificación de ensilajes de Alfalfa.

Tasas de Caída de pH para Alfalfa
Tasa (unidades de pH/hora)
pH Normal Grueso Normal Fino Clostridial Grueso Clostridial Fino
6,1
5,90 0,03704 0,00719 0,05263 0,01408
5,70 0,05000 0,06061 0,08333 0,03846
5,50 0,05263 0,08000 0,07407 0,07143
5,30 0,04878 0,10000 0,02632 0,13333
5,10 0,03774 0,04651 0,02174 0,11111
4,90 0,02273 0,03704 0,01613 0,08696
4,70 0,00216 0,02326 0,00775 0,05882
4,50 -0,00130 0,00559 -0,00219 0,03509
4,30 -0,00197 0,01333
4,10 -0,00308

La tasa es calculada como la diferencia entre dos pH determinados (0,2

unidades) y el tiempo requerido para lograrlo, siendo este último propio de cada
tratamiento. Para la determinación del tiempo requerido, se realizó una regresión y se

77
adaptó una ecuación a cada tratamiento (Anexo 10). Las tasas negativas corresponden
a aumentos en el pH.
El período de alza en la tasa de caída de pH, refleja el sector de vencimiento
del poder tampón de la Alfalfa, el que toma para los dos casos, más de 36 horas. La
menor tasa que presenta inicialmente el macerado para ambos casos al compararlo
con el testigo, vendría dada por la mayor liberación de ácidos orgánicos en el medio
producto de la maceración. Estos ácidos contribuyen al poder buffer de las plantas
(Lehninger, A., 1984) y podrían estar provocando un retraso en la fermentación inicial.
Sin embargo, esta situación es temporal y se revierte luego del pH 5,50, en donde el
macerado exhibe una tasa de caída de pH mayor que la presentada por el testigo,
luego de haber neutralizado antes los pares conjugados de los ácidos.
Gráficamente estos resultados pueden observarse en la figura 16 para el caso
de la gramínea y 17 para la Alfalfa.

0.5
0.45
0.4
Tasa (unidades de pH/horas)

0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
-0.05 6.18 6.00 5.80 5.60 5.40 5.20 5.00 4.80 4.60 4.40 4.20 4.00 3.80 3.60

pH

Figura 16. Tasa de caída de pH en Pasto Ovillo. Línea morada indica corte fino inoculado con
BAL. Rojo indica tamaño fino con flora epifítica. Azul muestra corte grueso con BAL y verde
tamaño grueso con flora epifítica.

78
 0.16
Tasa (unidades de pH/horas) 0.14

0.12

0.1

0.08

0.06

0.04

0.02

0
6.1 5.9 5.7 5.5 5.3 5.1 4.9 4.7 4.5 4.3 4.1
-0.02
pH

Figura 17. Tasa de caída de pH en Alfalfa. Línea morada indica corte fino inoculado con
bacterias indeseables. Rojo indica tamaño fino con flora epifítica. Azul muestra corte grueso con
bacterias indeseables y verde tamaño grueso con flora epifítica.

7.4.3 ANALISIS ENTRE pH DE MACERADO Y TESTIGO

El pH alcanzado dentro de las primeras horas de fermentación por el macerado,
debería ser un indicador del comportamiento del testigo (que representa el tamaño de
picado tradicional para ensilajes), tanto dentro del proceso, como luego de estabilizado.
El cuadro 13 presenta una relación entre las pendientes de caída de pH de las
primeras horas del macerado de cada tratamiento, y el comportamiento del tratamiento
testigo respectivo.

79
Cuadro 13 Relación entre pendientes de pH, en las primeras horas.
Sustrato Tipo Período Pendiente pH pH final Factor Pendiente
fermentación (h) (720 h) tramo final
(*1000)
P Ovillo Sin aditivo
0-12 - 0,0040 5,89 4,38 1,34 -0,007
Sin aditivo
0-24 - 0,0115 4,69 4,38 1,07 -0,007
Sin aditivo
0-36 - 0,0131 3,86 4,38 0,88 -0,007
Sin aditivo
0-48 - 0,0100 3,82 4,38 0,87 -0,007
P. Ovillo Sacarosa +
bact ác láct 0-12 - 0,0183 4,96 3,53 1,41 0,01
Sacarosa +
bact ác láct 0-24 - 0,0188 3,94 3,53 1,11 0,01
Sacarosa +
bact ác láct 0-36 - 0,0142 3,71 3,53 1,05 0,01
Sacarosa +
bact ác láct 0-48 - 0,0111 3,63 3,53 1,03 0,01
Alfalfa Sin aditivo
0-12 - 0,0040 5,82 4,62 1,26 -0,02
Sin aditivo
0-24 - 0,0015 5,89 4,62 1,28 -0,02
Sin aditivo
0-36 - 0,0011 5,86 4,62 1,27 -0,02
Sin aditivo
0-48 - 0,0039 5,06 4,62 1,10 -0,02
Alfalfa Clostridial
0-12 - 0,0051 5,74 4,47 1,28 -0,02
Clostridial
0-24 - 0,0020 5,82 4,47 1,30 -0,02
Clostridial
0-36 - 0,0043 5,23 4,47 1,17 -0,02
Clostridial
0-48 - 0,0076 4,25 4,47 0,95 -0,02
El cálculo de las pendientes, se detalla en Anexo 11. El Factor es calculado como la división
entre el pH alcanzado a determinada hora por el macerado, y el pH final del testigo.

La acidez observada al cabo de 720 horas de fermentación constituyó una fase

estabilizada de los ensilajes, con una situación que se ve confirmada por las
pendientes observadas entre los intervalos de 144 a 720 horas en donde estas
pendientes son esencialmente iguales a 0 (cuadro 13).
El factor cercano a 1,1 unidades buscó semejanza entre pH temprano de
macerado y el pH final de testigo. Esperar más allá de este punto, significaría pérdida
de efectividad del sistema, al hacerse muy prolongado.
El pH alcanzado por ambos tratamientos de las gramíneas a las 24 horas,
tendió a reflejar el comportamiento que presentó el testigo al final del proceso de
conservación. En el caso de la leguminosa, debido al efecto del poder tampón, el
reflejo del pH del macerado pudo observarse sólo después de las 36 horas. Por lo
tanto resulta prácticamente imposible lograr una mayor aceleración en la fermentación

80
de éstas, de modo que logre en las primeras horas reflejar el comportamiento una vez
estabilizado el pH.
Al analizar los datos generados en el cuadro anterior (13), se puede mencionar
que el pH de las 24 horas, logrado por la fermentación inducida láctica, refleja la
tendencia que tuvo el testigo respectivo. Para el caso de la mezcla de gramíneas sin
ningún aditivo, el pH del macerado a las 24 horas, indicó una fermentación no muy
adecuada y que manifestó la propensión del testigo respectivo a un tipo de
fermentación insatisfactoria. Lo mismo ocurrió para el caso de Alfalfa sin aditivos.
Sorprendentemente para la Alfalfa inoculada con clostridios, la fermentación, en el
mismo tiempo de la no inoculada (48 horas), reveló un pH más bajo, que podría haber
indicado una mejor fermentación.
Sin bien aquí se ha comparado en valores absolutos de pH al inicio y final de
fermentación, sería interesante relacionar la tasa inicial de fermentación con el
resultado del período más prolongado. En cuyo caso habrá interacciones con los
niveles de pH estables alcanzado por cada forraje, el cual es afectado por factores
propios de la planta.
Sin embargo, para poder realizar una conclusión respecto a la relación que
existe entre el pH del macerado en las primeras horas y el pH que presenta finalmente
el testigo, se requiere seguir con las investigaciones realizando nuevos ensayos.

81
8 CONCLUSIONES
El sistema de medición de azúcares en diversas forrajeras por medio de
refractómetro, resulta poco aconsejable dado que registra sólidos solubles. Al tomar un
extracto de especies forrajeras, se encuentran además de azúcares solubles, proteínas
y pectinas que en parte ingresan a la fracción soluble y son registradas por el
instrumento. Esto genera distorsión en las mediciones siendo necesaria una
clarificación del extracto. Queda abierta la posibilidad de continuar la investigación en
esta vía, concentrando la muestra una vez clarificada. Esto es importante, debido a que
al clarificar una muestra se genera diluciones y el refractómetro pierde sensibilidad
dado su rango de funcionamiento.

La adaptación de la metodología de reducción del cobre para la medición de

azúcares resulta poseer adecuada sensibilidad y cumplir con los requerimientos de
cuantificación de azúcares respecto a rapidez y precisión.

El contenido de azúcares solubles durante el premarchitamiento de Alfalfa (M.

sativa), tiende a mantenerse estable en el tiempo. Sin embargo el contenido total de
carbohidratos no estructurales, desciende a valores cercanos al 50% del original, luego
del segundo día de secado. Esto viene dado por una hidrólisis casi completa de los
azúcares de reserva, en este caso en particular, principalmente de almidón. La
hidrólisis de este polisacárido, sería provocada por las enzimas propias de las plantas
en busca de mantener el stock directo de azúcares respirables.

La mantención del contenido de azúcares solubles de la planta, en base a

materia seca durante el secado de ésta, significa una concentración de éstos en base a
materia verde. En vista que el contenido original de azúcares solubles de la Alfalfa
particularmente, es insuficiente para una correcta fermentación en ensilaje, la
concentración generada es de vital importancia para suministrar el sustrato suficiente
para las bacterias ácido lácticas.

El sistema de incubación a temperatura controlada, de anaerobiosis en base a

succión de gases y de macerado del pasto, provocó un aceleramiento notorio de la
fermentación de forrajes en microsilos de laboratorio.

82
 El disminuir el tamaño de picado de distintos forrajes, provoca un aumento en la
velocidad de acidificación durante el ensilaje. Esto vendría dado, por el aumento de los
lugares de ataque de las bacterias, generando una mayor disponibilidad de sustratos
para las BAL.

La inoculación provocó una caída de pH más rápida, debido probablemente a la

mayor velocidad de colonización de bacterias ácido láctica en una mayor proporción de
espacio físico en el pasto. Este efecto se observó en las primeras 36 horas de iniciado
el proceso de conservación, asegurando una fermentación de tipo láctica desde el
inicio.

Existe un período de resistencia a la baja de pH en Alfalfa cercano a las 36 e

incluso 48 horas, que no se da en la mezcla de Pasto Ovillo – Bromo. Este período se
caracteriza por mantener un pH cercano a la planta original, debido al poder tampón
propio de la planta.

La tasa de caída de pH en el macerado de Alfalfa, tiende a ser inferior en las

primeras horas, al compararlo con la del testigo. Esto vendría dado por la mayor
liberación de ácidos orgánicos propios de la planta al medio, los que junto a su par
conjugado, son los responsables en gran parte, del poder tampón de las plantas.

La relación existente entre el pH del macerado, dentro de las primeras horas de

iniciada la fermentación y la del pH que presenta el testigo una vez estabilizado el
sistema, requiere de más estudios para poder determinar una relación precisa. Sin
embargo puede mencionarse, que para el caso de gramíneas, el pH alcanzado a las 24
horas sería el adecuado para realizar un pronóstico. Mientras que para la Alfalfa, el
tiempo adecuado sería cercano a las 48 horas, ya que en el período anterior, el poder
tampón no ha permitido aún una baja de pH adecuada.

83
9. BIBLIOGRAFIA

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87
ANEXOS

88
ANEXO A

89
Anexo 1
Cuadro 4. Cambio en la fracción de carbohidratos no estructurales en
premarchitamiento de alfalfa.
ENSAYO Tiempo M.S. Chos d.e. Almidón d.e. Total
% Solubles (% M.S.) carbohidratos
(% M.S.) no estructurales
I Hora 0 21,93 7,64 0,37 10,22 1,54 17,86
I Hora 10 28,65 8,49 0,91 2,65 1,61 11,14
I Hora 32 49.79 8,09 1,19 0,24 0,39 8,33
II Hora 0 21,36 7,48 0,33 8,90 0,49 16,39
II Hora 10 31,21 7,55 0,88 2,91 1,49 10,46
II Hora 32 66,82 7,74 0,32 2,57 nd 10,31
III Hora 0 20,02 7,66 0,09 10,41 0,53 18,06
III Hora 10 39,29 7,88 0,88 2,99 nd 10,87
III Hora 32 58,58 6,65 0,66 0,23 1,30 6,88

90
Anexo 2 MUESTREO CAÍDA DE pH FINALES CON DOS TAMAÑO DE CORTES DISTINTOS
Vol. tubo: 73.629 cm3 30/06/2001
Vol. Tubo lleno: 58.903 cm3
Peso 2,5 cm 32 grs
Peso 1,5 cm: 35 grs
Peso macerado: 43 grs
Densidad 2,5 cm 0.543 grs/cm3
Densidad 1,5 cm: 0.594 grs/cm3
Densidad macer: 0.730 grs/cm3
Ovillo-Bromo
pH original pH 18 hrs pH 36 hrs pH 54 hrs
2,5cm Sin A 6.10 6.08 5.32 4.37
2,5cm Sin A 6.10 6.07 5.41 4.42
2,5cm Sin A 6.10 6.04 5.45 4.32
Prom 2,5 SA 6.10 6.06 5.39 4.37
2,5cm Con A 6.10 5.63 4.65 4.12
2,5cm Con A 6.10 5.65 4.68 4.08
2,5cm Con A 6.10 5.68 4.78 4.13
Prom 2,5 CA 6.10 5.65 4.70 4.11
1,5cm Sin A 6.10 6.05 4.60 3.93
1,5cm Sin A 6.10 6.05 4.38 3.90
1,5cm Sin A 6.10 6.08 4.37 3.94
Prom 1,5 SA 6.10 6.06 4.45 3.92
1,5 cm Con A 6.10 4.70 4.04 3.93
1,5 cm Con A 6.10 4.75 4.00 3.95
1,5 cm Con A 6.10 4.72 4.01 3.94
Prom 1,5 CA 6.10 4.72 4.02 3.94
Macer Sin A 6.10 5.94 4.20 3.82
Macer Sin A 6.10 5.95 4.40 3.83
Macer Sin A 6.10 5.92 4.22 3.84
Prom M SA 6.10 5.94 4.27 3.83
Macer Con A 6.10 4.06 3.75 3.71
Macer Con A 6.10 4.08 3.73 3.70
Macer Con A 6.10 4.08 3.72 3.68
Prom M CA 6.10 4.07 3.73 3.70

6.50
6.00
5.50 2,5 SA
5.00 2,5 CA

4.50 1,5 SA
pH

4.00 1,5 CA
M SA
3.50
M CA
3.00
2.50
2.00
pH original pH 18 hrs pH 36 hrs pH 54 hrs
Tiempo (hrs)

91
Anexo 3 MUESTREO CAÍDA DE pH FINALES CON DOS TAMAÑO DE CORTES DISTINTOS
Vol. tubo: 73.629 cm3 09/07/2001
Vol. Tubo lleno: 58.903 cm3
Peso 2,5 cm 36 grs
Peso 1,5 cm: 39.26 grs
Peso macerado: 46.09 grs
Densidad 2,5 cm 0.611 grs/cm3
Densidad 1,5 cm: 0.667 grs/cm3
Densidad macer: 0.782 grs/cm3
Avena
pH original pH 18 hrs pH 36 hrs pH 54 hrs
2,5cm Sin A 6.22 6.10 5.38 4.28
2,5cm Sin A 6.22 6.13 5.42 4.33
2,5cm Sin A 6.22 6.15 5.53 4.26
Prom 2,5 SA 6.22 6.13 5.44 4.29
2,5cm Con A 6.22 5.22 4.52 4.00
2,5cm Con A 6.22 5.30 4.40 3.95
2,5cm Con A 6.22 5.33 4.31 3.97
Prom 2,5 CA 6.22 5.28 4.41 3.97
1,5cm Sin A 6.22 6.05 4.82 3.96
1,5cm Sin A 6.22 6.04 4.50 3.99
1,5cm Sin A 6.22 6.09 4.48 3.98
Prom 1,5 SA 6.22 6.06 4.60 3.98
1,5 cm Con A 6.22 4.48 3.86 3.76
1,5 cm Con A 6.22 4.48 3.81 3.76
1,5 cm Con A 6.22 4.39 3.85 3.84
Prom 1,5 CA 6.22 4.45 3.84 3.79
Macer Sin A 6.22 5.50 4.05 3.79
Macer Sin A 6.22 5.37 3.99 3.84
Macer Sin A 6.22 5.68 4.05 3.77
Prom M SA 6.22 5.52 4.03 3.80
Macer Con A 6.22 4.22 3.78 3.78
Macer Con A 6.22 4.29 3.77 3.76
Macer Con A 6.22 4.31 3.78 3.76
Prom M CA 6.22 4.27 3.78 3.77

6.50
6.00
5.50
Prom 2,5 SA
5.00
Prom 2,5 CA
4.50 Prom 1,5 SA
pH

4.00 Prom 1,5 CA

3.50 Prom M SA
3.00 Prom M CA

2.50
2.00
pH original pH 18 hrs pH 36 hrs pH 54 hrs
tiempo (hrs)

92
Anexo 4 MUESTREO CAÍDA DE pH FINALES CON DOS TAMAÑO DE CORTES DISTINTOS
Vol. tubo: 73.629 cm3
Vol. Tubo lleno: 58.903 cm3
Peso 2,5 cm 35 grs
Peso 1,5 cm: 36 grs
Peso macerado: 45 grs
Densidad 2,5 cm 0.594 grs/cm3
Densidad 1,5 cm: 0.611 grs/cm3
Densidad macer: 0.764 grs/cm3
Trébol Blanco
pH original pH 18 hrs pH 36 hrs pH 54 hrs
2,5cm Sin A 6.18 5.81 5.30 4.30
2,5cm Sin A 6.18 5.93 5.27 4.27
2,5cm Sin A 6.18 5.96 5.21 4.38
Prom 2,5 SA 6.18 5.90 5.26 4.32
2,5cm Con A 6.18 5.40 4.55 4.05
2,5cm Con A 6.18 5.47 4.52 3.99
2,5cm Con A 6.18 5.38 4.44 4.07
Prom 2,5 CA 6.18 5.42 4.50 4.04
1,5cm Sin A 6.18 5.53 4.94 3.96
1,5cm Sin A 6.18 5.54 5.15 4.15
1,5cm Sin A 6.18 5.43 4.80 3.96
Prom 1,5 SA 6.18 5.50 4.96 4.02
1,5 cm Con A 6.18 4.70 3.95 3.85
1,5 cm Con A 6.18 4.67 3.95 3.87
1,5 cm Con A 6.18 5.00 3.94 3.86
Prom 1,5 CA 6.18 4.79 3.95 3.86
Macer Sin A 6.18 5.25 4.66 3.75
Macer Sin A 6.18 5.33 4.70 3.73
Macer Sin A 6.18 5.30 4.75 3.73
Prom M SA 6.18 5.29 4.70 3.74
Macer Con A 6.18 4.82 3.77 3.74
Macer Con A 6.18 4.78 3.81 3.71
Macer Con A 6.18 4.69 3.76 3.74
Prom M CA 6.18 4.76 3.78 3.73

6.50
6.00

5.50 Prom 2,5 SA

5.00 Prom 2,5 CA

4.50 Prom 1,5 SA

pH

Prom 1,5 CA
4.00
Prom M SA
3.50
Prom M CA
3.00
2.50

2.00
pH original pH 18 hrs pH 36 hrs pH 54 hrs
Tiempo (hrs)

93
Anexo 5 MUESTREO CAÍDA DE pH FINALES CON DOS TAMAÑO DE CORTES DISTINTOS
Vol. tubo: 73.629 cm3 09/07/2001
Vol. Tubo lleno: 58.903 cm3
Peso 2,5 cm 32 grs
Peso 1,5 cm: 35.82 grs
Peso macerado: 45 grs
Densidad 2,5 cm 0.543 grs/cm3
Densidad 1,5 cm: 0.608 grs/cm3
Densidad macer: 0.764 grs/cm3

Alfalfa
pH original pH 18 hrs pH 36 hrs pH 54 hrs
2,5cm Sin A 6.21 6.05 5.24 4.92
2,5cm Sin A 6.21 6 5.96 5.00
2,5cm Sin A 6.21 6 5.80 4.95
Prom 2,5 SA 6.21 6.02 5.67 4.96
2,5cm Con A 6.21 5.65 5.05 4.70
2,5cm Con A 6.21 5.68 5.10 4.63
2,5cm Con A 6.21 5.64 5.04 4.68
Prom 2,5 CA 6.21 5.66 5.06 4.67
1,5cm Sin A 6.21 6.05 5.03 4.90
1,5cm Sin A 6.21 5.99 5.03 4.81
1,5cm Sin A 6.21 5.98 4.95 4.86
Prom 1,5 SA 6.21 6.01 5.00 4.86
1,5 cm Con A 6.21 5.05 4.60 4.49
1,5 cm Con A 6.21 5.05 4.54 4.51
1,5 cm Con A 6.21 5.03 4.58 4.60
Prom 1,5 CA 6.21 5.04 4.57 4.53
Macer Sin A 6.21 5.76 4.46 4.24
Macer Sin A 6.21 5.73 4.85 4.24
Macer Sin A 6.21 5.76 4.48 4.22
Prom M SA 6.21 5.75 4.60 4.23
Macer Con A 6.21 5.15 4.22 4.15
Macer Con A 6.21 5.25 4.22 4.17
Macer Con A 6.21 5.25 4.22 4.14
Prom M CA 6.21 5.22 4.22 4.15

6.50
6.00

5.50
Prom 2,5 SA
5.00
Prom 2,5 CA
4.50
Prom 1,5 SA
pH

4.00 Prom 1,5 CA

3.50 Prom M SA
3.00 Prom M CA

2.50
2.00
pH original pH 18 hrs pH 36 hrs pH 54 hrs
tiempo (horas)

94
Anexo 6 Evaluación de la predictividad de pH medido en macerado en relación
a corte 2 cm en distintas horas
Bromo - Ovillo Normal (sin aditivo)
0 12 24 36 48 96
2 cm Normal 6.18 6.12 5.27 4.24 4.05 4.20
2 cm Normal 6.18 6.09 5.05 4.21 4.07 4.18
0.00 0.02 0.16 0.02 0.01 0.01
Promedio 6.18 6.11 5.16 4.23 4.06 4.19
Macerado Normal 6.18 5.88 4.66 3.87 3.82 3.88
Macerado Normal 6.18 5.90 4.71 3.84 3.81 3.87
0.00 0.01 0.04 0.02 0.01 0.01
Promedio 6.18 5.89 4.69 3.86 3.82 3.88

Bromo - Ovillo Láctico (sacarosa a 2,5% de M.V. más

BAL)
0 12 24 36 48 96
2 cm Láctico 6.18 5.55 3.98 3.73 3.61 3.60
2 cm Láctico 6.18 5.31 4.01 3.71 3.62 3.60
0.00 0.17 0.02 0.01 0.01 0.00
Promedio 6.18 5.43 4.00 3.72 3.62 3.60
Macerado Láctico 6.18 4.90 3.95 3.71 3.63 3.58
Macerado Láctico 6.18 5.02 3.92 3.71 3.63 3.58
0.00 0.08 0.02 0.00 0.00 0.00
Promedio 6.18 4.96 3.94 3.71 3.63 3.58

Alfalfa Normal (sin aditivo)

0 12 24 36 48 96
2 cm Normal 6.10 6.05 5.98 5.79 4.99 4.53
2 cm Normal 6.10 6.02 6.02 5.78 5.02 4.68
0.00 0.02 0.03 0.01 0.02 0.11
Promedio 6.10 6.04 6.00 5.79 5.01 4.61
Macerado Normal 6.10 5.80 5.95 5.90 5.10 4.26
Macerado Normal 6.10 5.83 5.83 5.81 5.01 4.30
0.00 0.02 0.08 0.06 0.06 0.03
Promedio 6.10 5.82 5.89 5.86 5.06 4.28

Alfalfa Butírica (Clostridios+E.coli)

0 12 24 36 48 96
2 cm Butírico 6.10 6.05 6.07 5.18 4.91 4.48
2 cm Butírico 6.10 6.00 6.04 5.28 4.81 4.60
0.00 0.04 0.02 0.07 0.07 0.08
Promedio 6.10 6.03 6.06 5.23 4.86 4.54
Macerado Butírico 6.10 5.74 5.81 5.25 4.14 4.00
Macerado Butírico 6.10 5.73 5.83 5.20 4.35 4.00
0.00 0.01 0.01 0.04 0.15 0.00
Promedio 6.10 5.74 5.82 5.23 4.25 4.00

95
Anexo 7 Condiciones climáticas en Estación Experimental
durante los días de ensayo de premarchitamiento de Alfalfa

DÍA 1 65
04/12/2001 30 60

% hr
Hora T° H° Relativa 20 55

ºC
50
12:00 27 56 % 10
45
14:30 27.8 56 % 0 40
15:45 27.8 56 % 12:00 14:30 15:45 17:00 19:00 19:30
17:00 27.8 56 % T°
horas
19:00 26.5 51 % H°Relativa
19:30 25 54 %

DÍA 2 35 65
05/12/2001 30 60
25
Hora T° H° Relativa 55

% hr
20
ºC

10:30 24 49 % 15 50
10
12:00 26 49 % 5 45
0 40
14:45 30 44 %
10:30 12:00 14:45 16:45 19:40
16:45 28 45 %
T°
19:40 25 47 % horas
H°Relativa

35 65
DÍA 3 30 60
06/12/2001 25

% hr
20 55
ºC

Hora T° H° Relativa 15 50
10
10:45 23 55 % 5 45
13:00 29 41 % 0 40
10:45 13:00 15:00 17:00 19:00
15:00 29 41 % T°
17:00 28 42 % horas H°Relativa
19:00 25 57 %

DÍA 4
07/12/2001 35 65
60
Hora T° H° Relativa 25
55
% hr

11:30 22 61 %
ºC

15
50
13:15 25 61 % 5 45
14:30 28 42 %
-5 11:30 13:15 14:30 16:00 19:00 40
16:00 28 42 %
horas T°
19:00 27 47 %
H°Relativa

96
Anexo 8
Tasa de caída de pH en dos especies forrajeras con distintos tipos de fermentación

0.5

0.45

0.4
Tasa (unidades de pH/horas)

0.35

0.3
Ovillo Normal 2
0.25 Ovillo Normal M
0.2 Ovillo Láctico 2
Ovillo Láctico M
0.15

0.1

0.05

0
6.18 6.00 5.80 5.60 5.40 5.20 5.00 4.80 4.60 4.40 4.20 4.00 3.80 3.60
-0.05
pH

0.16

0.14
Tasa (unidades de pH/horas)

0.12

0.1
Alfalfa Normal 2
0.08 Alfalfa Normal M
0.06 Alfalfa Clostr 2
Alfalfa Clostr M
0.04

0.02

0
6.1 5.9 5.7 5.5 5.3 5.1 4.9 4.7 4.5 4.3 4.1
-0.02
pH

97
Anexo 9
Análisis de Varianza (SAS) que muestra interacción entre efectos
de Picado, Inoculación y Picado más inoculación
p>0.05 no hay diferencias estadísticamente significativas

HORA 1 (18 HRS)

ALFALFA
3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ---- 0.0001 0.9988 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ---- 0.0001 0.0001 0.0405 0.0001
1,5 cm Sin A 0.9988 0.0001 ---- 0.0001 0.0001 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.0001 ---- 0.0001 0.0003
Macer Sin A 0.0001 0.0405 0.0001 0.0001 ---- 0.0001
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.0003 0.0001 ----

HORA 2 (36 HRS)

ALFALFA
3 cm Sin A 3 cm 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
Con A
3 cm Sin A ---- 0.0144 0.0073 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0144 ---- 0.9982 0.0526 0.0686 0.001
1,5 cm Sin A 0.0073 0.9982 ---- 0.1032 0.1329 0.0019
1,5 cm Con A 0.0001 0.0526 0.1032 ---- 1 0.2304
Macer Sin A 0.0001 0.0686 0.1329 1 ---- 0.1821
Macer Con A 0.0001 0.001 0.0019 0.2304 0.1821 ----

HORA 3 (54 HRS)

ALFALFA
3 cm Sin A 3 cm 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
Con A
3 cm Sin A ---- 0.0001 0.0646 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ---- 0.0007 0.009 0.0001 0.0001
1,5 cm Sin A 0.0646 0.0007 ---- 0.0001 0.0001 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.009 0.0001 ---- 0.0001 0.0001
Macer Sin A 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 ---- 0.1804
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.1804 ----

HORA 1 (18 HRS) TRÉBOL BLANCO

3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0004 0.0021 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0004 ----- 0.8721 0.0001 0.5969 0.0001
1,5 cm Sin A 0.0021 0.8721 ----- 0.0001 0.1396 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.0001 ----- 0.0003 0.9991
Macer Sin A 0.0001 0.5969 0.1396 0.0003 ----- 0.0002
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.9991 0.0002 -----

98
 HORA 2 (36 HRS) TRÉBOL BLANCO
3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0001 0.0073 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ----- 0.0002 0.0001 0.0858 0.0001
1,5 cm Sin A 0.0073 0.0002 ----- 0.0001 0.00187 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.0001 ----- 0.0001 0.1905
Macer Sin A 0.0001 0.0858 0.0187 0.0001 ----- 0.0001
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.1905 0.0001 -----

HORA 3 (54 HRS) TRÉBOL BLANCO

3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0004 0.0003 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0004 ----- 0.9996 0.0169 0.0002 0.0002
1,5 cm Sin A 0.0003 0.9996 ----- 0.0281 0.0003 0.0003
1,5 cm Con A 0.0001 0.0169 0.0281 ----- 0.1261 0.099
Macer Sin A 0.0001 0.0002 0.0003 0.1261 ----- 1
Macer Con A 0.0001 0.0002 0.0003 0.099 1 -----

HORA 1 (18 HRS) AVENA

3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0001 0.8767 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ----- 0.0001 0.0001 0.0233 0.0001
1,5 cm Sin A 0.8767 0.0001 ----- 0.0001 0.0001 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.0001 ----- 0.0001 0.109
Macer Sin A 0.0001 0.0233 0.0001 0.0001 ----- 0.0001
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.109 0.0001 -----

HORA 2 (36 HRS) AVENA

3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ----- 0.2233 0.0001 0.0042 0.0001
1,5 cm Sin A 0.0001 0.2233 ----- 0.0001 0.0001 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.0001 ----- 0.2233 0.9608
Macer Sin A 0.0001 0.0042 0.0001 0.2233 ----- 0.0622
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.9608 0.0622 -----

HORA 3 (54 HRS) AVENA

3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ----- 1 0.0001 0.0002 0.0001
1,5 cm Sin A 0.0001 1 ----- 0.0001 0.0002 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.0001 ----- 0.9938 0.9636
Macer Sin A 0.0001 0.0002 0.0002 0.9938 ----- 0.7692
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.9636 0.7692 -----

99
 HORA 1 (18 HRS) OVILLO
3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0001 0.9461 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ----- 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
1,5 cm Sin A 0.9461 0.0001 ----- 0.0001 0.0001 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.0001 ----- 0.0001 0.0001
Macer Sin A 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 ----- 0.0001
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 -----

HORA 2 (36 HRS) OVILLO

3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ----- 0.0215 0.0001 0.0003 0.0001
1,5 cm Sin A 0.0001 0.0215 ----- 0.0003 0.1481 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.0003 ----- 0.0197 0.01
Macer Sin A 0.0001 0.0003 0.1481 0.0197 ----- 0.0001
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.01 0.0001 -----

HORA 3 (54 HRS) OVILLO

3 cm Sin A 3 cm Con A 1,5 cm Sin A 1,5 cm Con A Macer Sin A Macer Con A
3 cm Sin A ----- 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
3 cm Con A 0.0001 ----- 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
1,5 cm Sin A 0.0001 0.0001 ----- 0.9651 0.0088 0.0001
1,5 cm Con A 0.0001 0.0001 0.9651 ----- 0.0024 0.0001
Macer Sin A 0.0001 0.0001 0.0088 0.0024 ----- 0.0005
Macer Con A 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0005 -----

100
Anexo 10 Cálculo de tasas de caída de pH en los diversos tipos
defermentación estudiados

Ovillo
Normal
Grueso S = 0.2 63 64 88 3
r = 0.9 39 57 43 1

12 6.12 6 .3
3
12 6.09
24 5.27 5 .9
1
24 5.05
36 4.24 ) 0
st 5 .5
36 4.21 i
n
48 4.05 u( 8
5 .0
48 4.07 si
96 4.2 x
A 7
4 .6
96 4.18 Y
144 4.38 6
4 .2
144 4.45
720 4.43 4
3 .8 1.2 132 .8 26 4.4 396 .0 52 7 .6 65 9.2 790 .8
720 4.33
X Axis (units)

Ovillo
Normal Fino

12 5.88
12 5.9
S = 0.1 285 437 1
24 4.66 r = 0.98 902 413
24 4.71 1
6 .1
36 3.87
36 3.84 9
48 3.82 5 .6

48 3.81 ) 6
96 3.88 st 5 .2
i
96 3.87 n
u( 4
144 3.8 4 .8
si
144 3.8 x
A 1
720 3.77 4 .4
Y
720 3.8
8
3 .9

6
3 .5 1.2 132 .8 264.4 396 .0 527 .6 659 .2 790 .8

X Axis (units)

101
Ovillo
Láctico
Grueso
S = 0 .0 5 7 6 00 5 9
12 5.55 r = 0.9 9 6 79 1 1 6
12 5.31 5 .7
5
24 3.98
24 4.01 5
5 .3
36 3.73
36 3.71 ) 4
st 4 .9
48 3.61 i
n
48 3.62 u( 4
4 .5
96 3.6 si
96 3.6 x 3
A 4 .1
144 3.52 Y
144 3.52 2
3 .7
720 3.54
720 3.52 2
3 .3 1 .2 13 2 .8 264 .4 39 6 .0 52 7.6 659 .2 79 0 .8

X Axis (units)

Ovillo
Láctico Fino

12 4.9 S = 0.031 07895

r = 0.99847 258
12 5.02
7
24 3.95 5 .1
24 3.92
7
36 3.71 4 .8
36 3.71
) 7
48 3.63 st 4 .5
48 3.63 i
n
96 3.58 u( 7
4 .2
96 3.58 si
x
144 3.52 A 3 .9
7
144 3.53 Y
720 3.55 3 .6
7
720 3.54
7
3 .3 1 .2 132.8 264.4 39 6.0 527.6 659.2 790 .8

X Axis (units)

102
Alfalfa
Normal
Gruesa
S = 0.27437019
12 6.05 r = 0.92741869
12 6.02
2
24 5.98 6 .2

24 6.02
8
36 5.79 5 .8
36 5.78
) 5
48 4.99 st 5 .5
48 5.02 i
n
96 4.53 u( 1
5 .2
96 4.68 si
x
144 4.38 A 4 .8
8

144 4.58 Y
720 4.73 4 .5
5
720 4.5
1
4 .2 1.2 132.8 264.4 396.0 527.6 659.2 790.8

X Axis (units)

Alfalfa
Normal Fina

12 5.8
12 5.83 S = 0.360 12962
24 5.95 r = 0 .897 44406

24 5.83 6 .1
2
36 5.9
36 5.81 5 .7
8
48 5.1
48 5.01 ) 4
st 5 .4
96 4.26 i
96 4.3 n
u( 0
5 .1
144 4.3 si
144 4.36 x 5
A 4 .7
720 4.24
Y
720 4.3
1
4 .4

7
4 .0 1.2 13 2.8 264.4 39 6.0 527.6 659.2 790.8

X Axis (units)

103
Alfalfa
Inóculo
S = 0.3 09 0 57 9 2
indeseable r = 0 .88 9 70 3 84
Gruesa
3
6 .2
12 6.05
12 6 1
5 .9
24 6.07
24 6.04 ) 9
st 5 .5
36 5.18 i
n
36 5.28 u( 6
5 .2
48 4.91 si
48 4.81 x
A 4
4 .9
96 4.48 Y
96 4.6 2
144 4.63 4 .6

144 4.7
0
720 4.48 4 .3 1.2 132 .8 26 4.4 39 6 .0 52 7 .6 659 .2 79 0.8
720 4.46
X Axis (units)

Alfalfa
Inóculo
indeseable S = 0 .2 13 275 66
Fina r = 0 .9 649 36 78
1
6 .0
12 5.74
12 5.73 5
5 .6
24 5.81
24 5.83 ) 8
36 5.25 st 5 .2
i
36 5.2 n
u( 1
48 4.14 4 .9
si
48 4.35 x
A 5
96 4 4 .5
96 4 Y
144 4.05 8
4 .1
144 4.1
720 4.03 2
3 .8 2.4 133 .6 264.8 396.0 52 7.2 65 8.4 789.6
720 4.03
X Axis (units)

104
Anexo 11 Cálculo de pendientes en base a linearización de pH en 4 tipos de fermentaciones

Ovillo Normal Testigo

Hor Ln (pH) pH
as
0 1.82131827 6.18
12 1.80910811 6.105
24 1.64093658 5.16
36 1.44101926 4.225
48 1.40118297 4.06
96 1.43270073 4.19
144 1.48500783 4.415
720 1.47704872 4.38

Ln (pH) Ovillo Normal 2 cm de 0 a 12 hrs Ln (pH) Ovillo Normal 2 cm de 0 a 36 hrs

1.822 1.85

1.8
1.82
1.75
1.818 1.7

1.816 1.65 Ln (pH)

Ln (pH)
1.6 Lineal (Ln (pH))
Lineal (Ln (pH))
1.814
1.55
1.812 1.5

1.81 y = -0.001x + 1.8213 1.45 y = -0.0106x + 1.8213

R2 = 1 R2 = 1
1.4
1.808 0 10 20 30 40
0 5 10 15

Ln (pH) Ovillo Normal 2 cm de 0 a 24 hrs Ln (pH) Ovillo Normal 2 cm de 0 a 48 hrs

1.84 1.85
1.82 1.8
1.8 1.75
1.78
1.7
1.76
1.65
1.74 Ln (pH) Ln (pH)
1.6
1.72 Lineal (Ln (pH)) Lineal (Ln (pH))
1.55
1.7
1.5
1.68
1.66 1.45 y = -0.0088x + 1.8213
1.4 R2 = 1
1.64
1.62 y = -0.0075x + 1.8213 1.35
0 5 10 15 20 25 30 R2 = 1 0 10 20 30 40 50 60

105
Ovillo Normal Macerado
Hor Ln (pH) pH
as
0 1.82131827 6.18
12 1.773256 5.89
24 1.54436592 4.685
36 1.34937101 3.855
48 1.33894066 3.815
96 1.35454566 3.875
144 1.33500107 3.8
720 1.35454566 3.875

Ln (pH) Ovillo Normal Macerado de 0 a 12 hrs Ln (pH) Ovillo Normal Macerado de 0 a 24 hrs

1.83 1.85

1.8
1.82

1.75
1.81
1.7
Ln (pH) Ln (pH)
1.8 Lineal (Ln (pH))
Lineal (Ln (pH)) 1.65

1.79
1.6

1.78 y = -0.004x + 1.8213 1.55 y = -0.0115x + 1.8213

2
2
R =1 R =1
1.5
1.77
0 5 10 15 20 25 30
0 2 4 6 8 10 12 14

Ln (pH) Ovillo Normal Macerado de 0 a 36 hrs Ln (pH) Ovillo Normal Macerado de 0 a 48 hrs

1.9 1.9

1.8 1.8

1.7 1.7

Ln (pH) Ln (pH)
1.6 1.6
Lineal (Ln (pH)) Lineal (Ln (pH))

1.5 1.5

y = -0.01x + 1.8213
1.4 1.4 R2 = 1
y = -0.0131x + 1.8213
R2 = 1
1.3 1.3
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 60

106
Ovillo Láctico 2 cm
Hor Ln (pH) pH
as
0 1.8213183 6.18
12 1.6919391 5.43
24 1.3850436 3.995
36 1.3137237 3.72
48 1.2850919 3.615
96 1.2809338 3.6
144 1.258461 3.52
720 1.2612979 3.53

Ln (pH) Ovillo Láctico 2 cm de 0 a 12 hrs Ln (pH) Ovillo Láctico 2 cm de 0 a 24 hrs

1.84 1.9

1.82
1.8
1.8
1.7
1.78
Ln (pH)
Ln (pH) 1.6
1.76 Lineal (Ln (pH))
Lineal (Ln (pH))
1.74 1.5

1.72
1.4
y = -0.0182x + 1.8213
1.7 y = -0.0108x + 1.8213
R2 = 1
R2 = 1 1.3
1.68
0 5 10 15 20 25 30
0 2 4 6 8 10 12 14

Ln (pH) Ovillo Láctico 2 cm de 0 a 36 hrs Ln (pH) Ovillo Láctico 2 cm de 0 a 48 hrs

1.85 1.9

1.8
1.75
1.7
1.65
1.6
Ln (pH) Ln (pH)
1.55 Lineal (Ln (pH))
Lineal (Ln (pH)) 1.5

1.45 1.4 y = -0.0112x + 1.8213

R2 = 1
1.35 y = -0.0141x + 1.8213 1.3
R2 = 1
1.2
1.25
0 10 20 30 40 50 60
0 10 20 30 40

107
Ovillo Láctico Macerado
Hor Ln (pH) pH
as
0 1.8213183 6.18
12 1.6014057 4.96
24 1.3699109 3.935
36 1.3110319 3.71
48 1.2892326 3.63
96 1.2753628 3.58
144 1.2598804 3.525
720 1.2655382 3.545

Ln (pH) Ovillo Láctico Macerado de 0 a 12 hrs Ln (pH) Ovillo Láctico Macerado de 0 a 24 hrs

1.85 1.9

1.8 1.8

1.75 1.7

Ln (pH) Ln (pH)
1.7 1.6
Lineal (Ln (pH)) Lineal (Ln (pH))

1.5
1.65
y = -0.0183x + 1.8213 y = -0.0188x + 1.8213
R2 = 1 1.4 R2 = 1
1.6

1.3
1.55
0 5 10 15 20 25 30
0 2 4 6 8 10 12 14

Ln (pH) Ovillo Láctico Macerado de 0 a 36 hrs Ln (pH) Ovillo Láctico Macerado de 0 a 48 hrs

1.85 1.85

1.75 1.75

1.65 1.65

Ln (pH) Ln (pH)
1.55 1.55
Lineal (Ln (pH)) Lineal (Ln (pH))
y = -0.0111x + 1.8213
1.45 1.45
y = -0.0142x + 1.8213 R2 = 1
R2 = 1
1.35 1.35

1.25
1.25
0 10 20 30 40
0 10 20 30 40 50 60

108
Alfalfa Normal 2 cm
Hor Ln (pH) pH
as
0 1.8082888 6.1
12 1.7975759 6.035
24 1.7917595 6
36 1.7552684 5.785
48 1.6104374 5.005
96 1.5271427 4.605
144 1.499623 4.48
720 1.5293119 4.615

Ln (pH) Alfalfa Normal 2 cm de 0 a 12 hrs Ln (pH) Alfalfa Normal 2 cm de 0 a 24 hrs

1.81 1.81

1.808
1.808
1.806
1.806 1.804

1.802
1.804 Ln (pH)
Ln (pH)
1.8
Lineal (Ln (pH)) Lineal (Ln (pH))
1.802 1.798

1.796
1.8 y = -0.0007x + 1.8083
y = -0.0009x + 1.8083 1.794 R2 = 1
1.798 R2 = 1 1.792

1.796 1.79
0 2 4 6 8 10 12 14 0 5 10 15 20 25 30

Ln (pH) Alfalfa Normal 2 cm de 0 a 48 hrs

Ln (pH) Alfalfa Normal 2 cm de 0 a 36 hrs

1.85
1.82

1.81
1.8

1.8
1.75
1.79 Ln (pH) Ln (pH)

Lineal (Ln (pH)) Lineal (Ln (pH))

1.78 1.7

1.77
1.65
1.76
y = -0.0015x + 1.8083
R2 = 1 1.6
1.75
y = -0.0041x + 1.8083
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 60
R2 = 1

109
Alfalfa Normal Macerada
Hor Ln (pH) pH
as
0 1.8082888 6.1
12 1.7604408 5.815
24 1.773256 5.89
36 1.767296 5.855
48 1.6203779 5.055
96 1.453953 4.28
144 1.4655675 4.33
720 1.4516138 4.27

Ln (pH) Alfalfa Normal Macerada de 0 a 12 hrs Ln (pH) Alfalfa Normal Macerada de 0 a 24 hrs

1.82 1.815

1.81
1.81
1.805
1.8
1.8
1.79 1.795
Ln (pH) Ln (pH)
Lineal (Ln (pH)) 1.79 Lineal (Ln (pH))
1.78
1.785
1.77
y = -0.004x + 1.8083 1.78
R2 = 1
1.76
1.775
y = -0.0015x + 1.8083
1.75 1.77 R2 = 1
0 2 4 6 8 10 12 14 0 5 10 15 20 25 30

Ln (pH) Alfalfa Normal Macerada de 0 a 36 hrs Ln (pH) Alfalfa Normal Macerada de 0 a 48 hrs

1.815 1.85

1.81
1.8
1.805
1.8
1.75
1.795 Ln (pH)
Ln (pH)
1.79 Lineal (Ln (pH))
Lineal (Ln (pH)) 1.7
1.785
1.78
1.65
1.775
1.77
y = -0.0011x + 1.8083 1.6 y = -0.0039x + 1.8083
1.765 0 10 20 30 40 50 60 R2 = 1
R2 = 1
0 10 20 30 40

110
Alfalfa Clostridial 2 cm
Hor Ln (pH) pH
as
0 1.8082888 6.1
12 1.7959175 6.025
24 1.8008844 6.055
36 1.6544113 5.23
48 1.5810384 4.86
96 1.512927 4.54
144 1.5400878 4.665
720 1.4973884 4.47

Ln (pH) Alfalfa Clostridial 2 cm de 0 a 12 hrs Ln (pH) Alfalfa Clostridial 2 cm de 0 a 24 hrs

1.81 1.809

1.808 1.808

1.807
1.806
1.806
1.804
Ln (pH) 1.805 Ln (pH)
1.802
Lineal (Ln (pH)) 1.804 Lineal (Ln (pH))
1.8
1.803
1.798 1.802
y = -0.001x + 1.8083
1.796 1.801
R2 = 1
y = -0.0003x + 1.8083
1.794 1.8 R2 = 1
0 2 4 6 8 10 12 14 0 5 10 15 20 25 30

Ln (pH) Alfalfa Clostridial 2 cm de 0 a 36 hrs Ln (pH) Alfalfa Clostridial 2 cm de 0 a 48 hrs

1.82 1.85

1.8
1.8
1.78

1.76 1.75

1.74 Ln (pH) Ln (pH)

1.7
Lineal (Ln (pH)) Lineal (Ln (pH))
1.72

1.7 1.65

1.68
1.6
y = -0.0047x + 1.8083
1.66 R2 = 1
1.64 1.55
y = -0.0043x + 1.8083
0 10 20 30 40 R2 = 1 0 10 20 30 40 50 60

111
Alfalfa Clostridial Macerada
Hor Ln (pH) pH
as
0 1.8082888 6.1
12 1.7465878 5.735
24 1.7613003 5.82
36 1.6534548 5.225
48 1.4457418 4.245
96 1.3862944 4
144 1.4048707 4.075
720 1.3937664 4.03

Ln (pH) Alfalfa Clostridial Macerada de 0 a 24 hrs

Ln (pH) Alfalfa Clostridial Macerada de 0 a 12 hrs

1.82
1.82

1.81
1.81

1.8 1.8

1.79 1.79
Ln (pH)
Ln (pH)
1.78 Lineal (Ln (pH))
Lineal (Ln (pH)) 1.78

1.77
1.77
y = -0.002x + 1.8083
1.76 y = -0.0051x + 1.8083 R2 = 1
R2 = 1 1.76
1.75
1.75
1.74
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15

Ln (pH) Alfalfa Clostridial Macerada de 0 a 36 hrs Ln (pH) Alfalfa Clostridial Macerada de 0 a 48 hrs

1.85 1.85

1.8

1.8 1.75

1.7
1.75 1.65 Ln (pH)
Ln (pH)
Lineal (Ln (pH)) 1.6 Lineal (Ln (pH))
1.7
1.55

1.5
1.65
1.45
y = -0.0043x + 1.8083 y = -0.0076x + 1.8083
1.4
1.6 R2 = 1 R2 = 1
0 10 20 30 40 50 60
0 10 20 30 40

112
ANEXO 12
Evaluación de la predictividad de pH medido en macerado en relación a corte 2 cm
en distintas horas
(Promedios y desviaciones estándar)

Bromo - Ovillo Normal (sin aditivo)

0 12 24 36 48 96 144 720
Promedio Grueso Normal 6.18 6.11 5.16 4.23 4.06 4.19 4.42 4.38
d.e. 0.00 0.02 0.16 0.02 0.01 0.01 0.05 0.07
Promedio Fino normal 6.18 5.89 4.69 3.86 3.82 3.88 3.80 3.80
d.e. 0.00 0.01 0.04 0.02 0.01 0.01 0.00 0.00

Bromo - Ovillo Láctico (sacarosa a 2,5% de M.V. más BAL)

0 12 24 36 48 96 144 720
Promedio Grueso Láctico 6.18 5.43 4.00 3.72 3.62 3.60 3.52 3.53
0.00 0.17 0.02 0.01 0.01 0.00 0.00 0.01
Promedio Fino Láctico 6.18 4.96 3.94 3.71 3.63 3.58 3.53 3.55
d.e. 0.00 0.08 0.02 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01

Caída de pH en dos tipos de fermentaciones en mezcla de Pasto Ovillo-Bromo

6.50

6.00

5.50 2 cm
5.00 Normal
Macerado
pH

4.50
Normal
4.00 2 cm
3.50
Láctico
Macerado
3.00
Láctico
2.50
0 100 200 300 400 500 600 700 800

horas

113
Alfalfa Normal (sin aditivo)
0 12 24 36 48 96 144 720
Promedio Grueso Normal 6.10 6.04 6.00 5.79 5.01 4.61 4.48 4.62
d.e. 0.00 0.02 0.03 0.01 0.02 0.11 0.14 0.16
Promedio Fino normal 6.10 5.82 5.89 5.86 5.06 4.28 4.33 4.27
d.e. 0.00 0.02 0.08 0.06 0.06 0.03 0.04 0.04

Alfalfa Butírica (Clostridios+E.coli)

0 12 24 36 48 96 144 720
Promedio Grueso Butírico 6.10 6.03 6.06 5.23 4.86 4.54 4.67 4.47
d.e. 0.00 0.04 0.02 0.07 0.07 0.08 0.05 0.01
Promedio Fino Butírico 6.10 5.74 5.82 5.23 4.25 4.00 4.08 4.03
d.e. 0.00 0.01 0.01 0.04 0.15 0.00 0.04 0.00

Caída de pH en dos tipos de fermentaciones en Alfalfa

6.5

5.5
2 cm
5 Normal
Macerado
pH

4.5
Normal
4 2 cm
3.5 Butírico
Macerado
3
Butírico
2.5
0 100 200 300 400 500 600 700 800

horas

114