IBIO3204- BIOLOGÍA MOLECULAR III

TALLER INTEGRADOR # 3: Yo estudio para salvar al mundo

El objetivo de este taller es que puedas aplicar tus conocimientos como Ingeniero en Biotecnología en
formación para contribuir en proponer una vacuna efectiva para el SARS-Cov2, así como comprender y
analizar lo que se está desarrollando hasta el momento.
La actividad deberá realizarse en tres grupos por paralelo por afinidad. Si bien el taller escrito, así
como la presentación n ser entregado únicamente por el líder del grupo, las actividades deberán
realizarse de manera grupal a conciencia (asegurándose que todos puedas resolver cualquier parte), ya
que el día de la defensa además de presentar los resultados más importantes, la profesora pedirá de
forma individual la demostración de uno de los resultados obtenidos por el grupo en tiempo real a cada
integrante. La rúbrica que se utilizará para la calificación estará disponible en el aula y los alumnos
podrán observar los criterios de evaluación grupales individuales en la misma.

ACTIVIDADES PROGRESO 3

Usted se acaba de unir al grupo de investigación de Virología y Biología Molecular de la

UDLA, que investiga la producción de una proteína recombinante como candidata para vacuna
de SARS-Cov2 para Ecuador. La investigación se basa en el conocimiento que se posee acerca
de la proteína Spike del virus y su alta capacidad inmunogénica. Para esto, usted realizará las
siguientes actividades durante el Segundo progreso:

Parte 1: ANÁLISIS in silico (todos los detalles solo registrarlos en el

documento escrito)
Como grupo y con base a la investigación realizada en progreso 1 escojan una estrategia
para el desarrollo de su vacuna basada en la proteína S del virus, sabiendo que
algunas utilizan la proteína S completa, otras la proteína de fusión, otras solo la región RBD
de la proteína, otras una mezcla de epítopos de la proteína S. En función de la decisión que
tomen, responda la pregunta ¿Cuál será su enfoque y por qué lo escogen frente a otras
alternativas? Pueden basarse en resultados de otras investigaciones de las distintas fases que
ya estén publicados de las distintas vacunas. Una vez
 escogida la estrategia, realice las siguientes actividades con
la secuencia de interés:

a. Predecir si existe glicosilación en el fragmento de

interés utilizando el programa NetNGlyC:
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/. Presente los
resultados con impresiones de pantalla y la
interpretación que usted le da al resultado.

Interpretación del gráfico: Se observa un algoritmo de la probabilidad es de 0,6543 mayor a 0,5

por lo tanto hay una alta posibilidad de glicosilación.

Predecir si existe la presencia de péptido señal

empleando el programa: SignalP 5.0 Server:
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/. Presente los
resultados con impresiones de pantalla y la
interpretación que usted le da al resultado.
 b. Predecir la presencia de puentes disulfuro utilizando el
programa Disulfind:
http://disulfind.dsi.unifi.it/process.php Presente los
resultados con impresiones de pantalla y la
interpretación que usted le da al resultado.

c. Prediga si se podría tener algún riesgo de sesgo de

codones al producir esta proteína en Escherichia coli,
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Nicoatiana
tabacum, Homo sapiens y Mus musculus, usando el
programa: http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html.
Presente los resultados con impresiones de pantalla y la
interpretación que usted le da a este análisis.

Interpretación de resultados: No se observó sesgo de codones para Saccharomyces cerevisiae,

Pichia pastoris o Nicoatiana tabacum. Sin embargo, si existe un sesgo de codones menor al 20%
en Escherichia coli, Homo sapiens y Mus musculus por lo tanto existe una mayor afinidad y
eficiencia para la sístesis de la secuencia proteica RBD en estos organismos.

Se debería hacer una optimización de codones mediante síntesis química o con

mutagénesis, debido a que la clonación de la secuencia tendrá lugar en E-coli y en este se pueden
observar sitios con una eficiencia menor al 20%. Dichos sitios se encuentran en los codones 50 y
200 y representan una baja en la productividad de la proteína recombinante en este organismo.
Interpretación del gráfico: En el grafico se observan 2 puntos, en el codón 50 y 200, los cuales
no atraviesan el umbral del 20%. Por tanto, existe un sesgo de codones para Escherichia coli.
Interpretación del gráfico: No se evidencia sesgo de codones
Interpretación del gráfico: No se evidencia sesgo de codones
Interpretación del gráfico: No se evidencia sesgo de codones.
Interpretación del gráfico: Se evidencia que en los codones 174, 200, 50 y 69 evidencian una
eficiencia de codones inferior al 20%. Por tanto, existe un sesgo de codones para Homo
Sappiens
Interpretación del gráfico: No se evidencia sesgo de codones.

d. Habiendo ejecutado los literales a-d escoja ¿qué

organismo (s) es o serían los más idóneos para la
producción de esta proteína de acuerdo a la información
obtenida cuando la síntesis química, y por tanto la
optimización de codones es una opción? Como en esta
materia solo profundizamos en los microorganismos,
explique dentro de este grupo cuál sería la mejor opción
de organismo hospedero.
COPIAR SEGUNDO PROGRESO
e. De acuerdo a lo respondido en el literal e, escoger un
vector de los disponibles en la lectura 10 o 17, o a su
vez cualquier vector que su grupo considere de las
diferentes bases de datos de las casas comerciales
disponibles online, el cual le permita la adecuada
 producción de la proteína de interés en grandes
cantidades. Expliqué el ¿por qué escogió ese vector de
manera específica? Enliste las partes del vector y
explique cada una.

COPIAR SEGUNDO PROGRESO

f. En la base de datos GISAID descargue las secuencias

correspondientes a Ecuador y realice un alineamiento
local de la secuencia génica que codifica para el
segmento de interés escogido por el grupo de cada una
de ellas. ¿Qué tan conservada esta esta región en las
cepas que circulan en Ecuador? Dependiendo de su
respuesta ¿Qué consideraciones debería tener su grupo
para su propuesta de candidato vacunal? Incluya estos
criterios en las actividades que realizará a continuación.
Por ejemplo si su grupo decide que va a clonar varios
segmentos RBD de cepas distintas en el mismo vector
pero en distintas células, especificar este tipo de
detalles.
 2. Para la siguiente parte del taller, escoja una de las 2
opciones que le planteó y resuélvalas. ¿Por qué escogió
ese camino? ¿Qué ventajas presenta frente al otro en la
producción de esta proteína en particular

COPIAR SEGUNDO PROGRESO Y AGREGAR MAS COSAS

 OPCIÓN 2
Considerando un diseño de propuesta con base a la
generación del ADN de interés por síntesis química, responda
los siguientes literales:
a. Realice la optimización de codones de su secuencia
para la producción de la proteína de ineterés
usando el programa Gensmart en el hospedero
seleccionado:
https://www.genscript.com/tools/gensmart-codon-
optimization y compare la secuencia original versus
la resultante. ¿Qué posiciones cambiaron en las
tripletas y con qué secuencia?
Secuencia WT:
AGA-GTC-CAA-CCA-ACA-GAA-TCT-ATT-GTT-AGA-TTT-CCT-AAT-ATT-ACA-AAC-TTG-TGC-
CCT-TTT-GGT-GAA-GTT-TTT-AAC-GCC-ACC-AGA-TTT-GCA-TCT-GTT-TAT-GCT-TGG-AAC-
AGG-AAG-AGA-ATC-AGC-AAC-TGT-GTT-GCT-GAT-TAT-TCT-GTC-CTA-TAT-AAT-TCC-GCA-
TCA-TTT-TCC-ACT-TTT-AAG-TGT-TAT-GGA-GTG-TCT-CCT-ACT-AAA-TTA-AAT-GAT-CTC-
TGC-TTT-ACT-AAT-GTC-TAT-GCA-GAT-TCA-TTT-GTA-ATT-AGA-GGT-GAT-GAA-GTC-AGA-
CAA-ATC-GCT-CCA-GGG-CAA-ACT-GGA-AAG-ATT-GCT-GAT-TAT-AAT-TAT-AAA-TTA-CCA-
GAT-GAT-TTT-ACA-GGC-TGC-GTT-ATA-GCT-TGG-AAT-TCT-AAC-AAT-CTT-GAT-TCT-AAG-
GTT-GGT-GGT-AAT-TAT-AAT-TAC-CTG-TAT-AGA-TTG-TTT-AGG-AAG-TCT-AAT-CCA-AAC-
CTT-TTG-AGA-GAG-ATA-TTT-CAA-CTG-AAA-TCT-ATC-AGG-CCG-GTA-GCA-CAG-CCT-TGT-
AAT-GGT-GTT-GAA-GGT-TTT-AAT-TGT-TAC-TTT-CCT-TTA-CAA-TCA-TAT-GGT-TTC-CAA-
CCC-ACT-AAT-GGT-GTT-GGT-TAC-CAA-CCA-TAC-AGA-GTA-GTA-GTA-CTT-TCT-TTT-GAA-
CTT-CTA-CAT-GCA-CCA-GCA-ACT-GTT-TGT-GGA-CCT-AAA-AAG-TCT-ACT-AAT-TTG-GTT-
AAA-AAC-AAA-TGT-GTC-AAT-TTC
Secuencia Optimizada:
AGA-GTT-CAA-CCC-ACA-GAA-TCA-ATA-GTA-AGG-TTC-CCG-AAC-ATC-ACC-AAT-CTG-TGT-
CCG-TTC-GGC-GAA-GTT-TTT-AAC-GCC-ACC-CGT-TTT-GCG-TCG-GTG-TAC-GCC-TGG-AAT-
CGT-AAG-CGC-ATT-TCC-AAC-TGC-GTT-GCG-GAC-TAC-AGC-GTT-CTG-TAC-AAT-AGC-GCA-
TCC-TTC-AGC-ACC-TTT-AAG-TGC-TAC-GGC-GTG-AGC-CCG-ACG-AAA-CTG-AAT-GAT-CTC-
TGC-TTT-ACC-AAC-GTG-TAT-GCG-GAC-TCT-TTC-GTC-ATC-AGA-GGT-GAT-GAG-GTT-CGT-
CAG-ATT-GCG-CCT-GGT-CAA-ACC-GGT-AAA-ATC-GCG-GAC-TAC-AAC-TAT-AAA-CTG-CCG-
GAT-GAC-TTC-ACC-GGT-TGC-GTG-ATC-GCT-TGG-AAC-TCT-AAC-AAC-TTG-GAT-TCG-AAA-
GTT-GGT-GGT-AAC-TAT-AAC-TAC-CTG-TAC-CGC-CTG-TTT-CGT-AAG-TCC-AAC-TTG-AAG-
CCG-TTT-GAA-CGT-GAC-ATC-TCA-ACC-GAA-ATT-TAT-CAG-GCA-GGG-AGC-ACT-CCG-TGT-
AAT-GGT-GTT-GAG-GGC-TTC-AAC-TGC-TAC-TTC-CCG-CTG-CAA-AGC-TAT-GGC-TTT-CAG-
CCA-ACC-AAT-GGC-GTG-GGC-TAT-CAA-CCG-TAT-CGC-GTG-GTG-GTT-CTG-AGC-TTC-GAG-
TTG-CTG-CAC-GCT-CCG-GCG-ACG-GTC-TGT-GGT-CCG-AAA-AAG-AGC-ACG-AAC-CTT-GTC-
AAG-AAC-AAA-TGC-GTA-AAT-TTC

b. Prediga nuevamente el sesgo de codones para esta

nueva secuencia en el hospedero escogido, usando
el programa:
http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html. Presente
los resultados con impresiones de pantalla y la
interpretación que usted le da al comparar con el
análisis inicial.
Sesgo de codones para la secuencia WT

Sesgo de codones para la secuencia optimizada:

c. Investigue específicamente la casa comercial con la
que va a realizar la síntesis química para que tome
en cuenta todos los requerimientos de esta en su
propuesta de proyecto.

INVESTIGAR LA CASA (LA UDLA TIENE EL PROTOCOLO)

d. Realizar la clonación de la secuencia obtenida por
síntesis química en el vector escogido usando Snap
Gene y mostrar el mapa de restricción general del
vector recombinante.
 e. Realizar el análisis a nivel de ADN
del vector recombinante en SnapGene, escogiendo una enzima que corte en el gen
de interés y otra en el vector, y simular un gel de agarosa, tanto para la inserción
del gen en posición correcta como para la incorrecta (de ser el caso). Si su vector
realiza clonación direccional, solo realizarlo con el gen en posición correcta y con
varios cortes para verificar la integridad de la secuencia.
f. Dentro del paso de análisis de ADN, investigue con que proveedor se podría realizar
la secuenciación de ADN, y en función de la tecnología escogida y el alcance en pb de
la misma, decida si es necesario diseñar más pares de cebadores para la
secuenciación, o si se puede mandar un amplicón de los ya obtenidos por su grupo en
literales anteriores para este fin.
Protocolo de secuenciación de la UDLA de hasta 600 pares de bases utilizando …. :

g. Diseñar y analizar (con los programas aprendidos) cebadores que permitan la

cuantificación vía qPCR con SYBRGreen del ARN de interés producido por la célula de
expresión. Correr la PCR in silico y simular el gel de agarosa utilizando SnapGene
 Para el diseño y analísis de los primer se utilizaron los programas de PrimerBlast y Oligoanalyzer.

TTabla analisis de los primers

Parámetro  Óptimo  Forward   Reverse 

    Valores resultantes  Impresión de pantalla del más Valores resultantes  Impresión de pantalla del más
estable (si aplica)  estable (si aplica) 

Secuencia  NA  CCAACGTGTATGCGGACTCT   GGTGAAGTCATCCGGCAGTT  

Longitud  18-30 pb     
20 20 
 
Tm  52-72°C     
58.8 ºC 58.8°C
 

%GC  40-60%     
55 % 55% 
 
Abrazadera GC   ≤ 3  bases G o    1G  
C en el 2C
1C
extremo 3’ 
 
Repeticiones ≤4    
de dinucleótidos  repeticiones NA  NA
consecutivas  de di-
nucleótidos
consecutivas 
  
Repeticiones de ≤4 nucleótidos    NA  
nucleótidos de de corrida  NA
corrida   
Horquillas 3’  ΔG>-2    
kcal/mol 

0.29
-0.29

Horquillas ΔG>-3      
internas  kcal/mol 

1.13 -1.13
Homodímeros 3’  ΔG>-5
kcal/mol  -1.94
-1.94
   
Homodímeros int ΔG>-6
ernos  kcal/mol  -1.95 -1.57

   
Heterodímeros 3’  ΔG>-5
kcal/mol  -1.34 -1.34

 
Heterodímeros in ΔG>-6
ternos  kcal/mol  -1.34 -1.34

 
 
BLAST (% de 100%, valor E
identidad contra significativo    3.2
especie 3.2
 
específica) 

h. Realizar el análisis in silico a nivel de proteína, verificar que no se haya corrido el

marco de lectura y que la traducción se dé correctamente en SnapGene. Comparar la
secuencia proteica recombinante obtenida con la secuencia de la proteína nativa
usando BLASTp, comprobando así que la secuencia de la proteína está intacta.

Parte 2: Propuesta de proyecto (documento escrito)

1. Redacte los antecedentes de su propuesta de proyecto con las correcciones indicadas en

la retroalimentación de progreso 1 (no más de 10 carillas), en donde hable acerca de:
Generalidades de SARS-CoV2, mecanismo de infección, situación actual de la pandemia,
tipos de vacunas que existen y explicación breve de cada una, resumen breve de vacunas
que se están desarrollando/usando para combatir SARS-CoV2 actualmente (puede usar la
información del archivo Excel
 del progreso 1 como base), explicación más puntual del
uso de la estrategia de vacuna de subunidad basada en
la proteína S del virus.
2. Con base a lo que ha leído y a los analizado en el taller
del progreso 1 (incluyendo el enfoque de candidato
vacunal escogido por el grupo), redacte la problemática,
justificación, el objetivo general, específicos y el tema
de su propuesta de proyecto.
3. Después de leer el manual del vector escogido por el
grupo a profundidad, redacte la metodología de su
propuesta de investigación incluyendo TODAS las
etapas aprendidas de IG así como las subetapas más
importantes dentro de cada una. Esta metdología
deberá ser similar a la de un artículo científico, no es
necesario que coloque todos los detalles del protocolo
en esta sección (esto irá en anexos).

1. Selección de las célula hospederas (mantenimiento y expresión)

2. Selección del vector de transferencia

3. Obtención del ADN exógeno de interés a ser insertado

3.1 Adquisición del material genético del hospedero

3.2 Adquisición del fragmento de ADN a ser insertado partiendo del material
genético obtenido antes

3.2.1 Síntesis química

3.2.2 PCR punto final
3.2.3 Inserción de extremos por PCR
3.2.4 Enzimas de restricción

: Obtención del ADN exógeno de interés a ser insertado

4. Unión del ADN de interés al vector
5. Transformación celular
6. Selección de células transformadas

7. Análisis a nivel de ADN de los clones seleccionados

Para la selección de las bacterias transformadas se empleó la metodología
expresada en el protocolo del vector de expresión.
Se eligieron 10 colonias y se las cultivaron toda la noche en LB o S.O.B. que
contengan 50 ug/ml de kanamicina.
Se aíslo el ADN plasmídico con el método Mini kit de purificación de plásmidos
PureLink ™ HQ.Posteriormente se analizó los plásmidos gracias al análisis de
restricción, esto para poder así confirmar la presencia y la correcta
orientación del inserto.
Para los cebadores de la PCR, el protocolo recomienda utilizar el primer
forward SUMO o el primer T7 Reverse y un primer que se pueda unir dentro de
su inserto. Una vez que se resuspendieron las muestras con un coctel de PCR y
se amplificaron durante 20-30 ciclos. Su visualización se la hizo mediante
electroforesis en gel de agarosa
8. Preservación de clones seleccionados
Luego que se identificó el clon correcto, se separó e inoculó la colonia original
se pasó a purificar la colonia en placas LB que contienen 50 μg / ml de
kanamicina y posteriormente se pasó a hacer una reserva de glicerol estéril
para almacenamiento a largo plazo en 80°C.
9. Obtención de ADNp recombinante puro

10.Transformación en célula de expresión

11.Inducción de la expresión
Se inocularon las bacterias transformadas BL21 en un medio de cultivo líquido
con 10mL en medio LB con 50ug/ml de kanamicina, una vez cultivado se
incubaron las bacterias a 37°C en el medio líquido, se seleccionó un
transformante positivo y se aisló el ADN plasmídico, para a continuación
inducir la expresión de las células BL21 transformadas con IPTG.
12.Análisis a nivel de ADN*, ARN y proteínas
13.Purificación de la proteína de interés
14.Preservación de clones productores

4. Redacte los anexos de su documento en donde deberá

incluir TODOS los protocolos necesarios a utilizarse en el
proyecto, adecuadamente enumerados y en orden
cronológico de flujo.
3.Obtención del ADN exógeno de interés a ser insertado

3.1 Adquisición del material genético del hospedero

3.2 Adquisición del fragmento de ADN a ser insertado partiendo del material
genético obtenido antes

3.2.1 Para realizar la síntesis química se utilizará el protocolo de Geneart®

por la casa comercial ThermoFisher
3.2.2 PCR punto final con el Taq PCR Master mix Kit

3.2.3 Para realizar la inserción de extremos por PCR se lo va a realizar en

SnapGene por lo tanto, en primera instancia se debe realizar el análisis de
restricción de nuestro gen de interés que en este caso es la región “RBD” de
la proteína S a continuación, se tiene que proceder a realizar el Análisis de
restricción del vector pETSUMO en el que vamos a proceder a incorporar la
región “RBD” usando Snap Gene, después se realizará la PCR de inserción
extremos de la región “RBD” en pETSUMO usando Snap Gene.

3.2.4 Para realizar el paso de enzimas de restricción se debe seguir los

siguientes pasos, los cuales son elaborar un análisis de restricción del vector
de origen que en este caso es el vector pETSUMO en Snap Gene, que en
primera estancia se debe importar la secuencia de SnapGene, luego a
continuación se
 NOTA: las partes 1 y 2 deberán ser subidas como un solo
documento en la actividad taller integrador # 3.- documento
escrito.
Parte 3: Presentación para defensa (archivo power
point)

Realice una presentación de 30 minutos en donde exponga en

el siguiente orden los puntos de su propuesta de proyecto,
deberán demorarse no más de 20 minutos en los puntos 1-6 y
dejar 10 minutos ara u explicación del taller in silico (punto
7):

1) Tema
2) Antecedentes
3) Problemática
4) Objetivo general y específicos
5) Justificación
6) Metodología COMPLETA (presentarlo a manera de
diagrama de procesos con los pasos generales de IG y las
subetapas macro, no a nivel de lisis, centrifugación, etc)
 7) Resultados y breve discusión del objetivo específico 1
(análisis in silico, no el paso a paso solo el resultados y
discusión)

NOTA: Esta presentación deberá ser subid únicamente por el

líder del grupo en la actividad llamada taller integrador # 3.-
defensa de taller.

INDICACIÓN FINAL:
La presentación será llevada a cabo por todos los integrantes
en el orden designado, y la respuesta de preguntas y defensa
se llevará a cabo de la misma forma. La defensa podrá incluir
repetir ensayos llevados a cabo en su taller en tiempo real,
por lo que se recomienda tener ese día acceso a una
computadora y de ser posible buena señal de internet. Las
preguntas también podrán ser de análisis o profundización de
escenarios. La nota será parcialmente grupal y parcialmente
individual de acuerdo a lo explicado en la rúbrica
correspondiente.

Para poder evaluar el trabajo colaborativo de forma objetiva,

el líder del grupo deberá grabar TODAS las reuniones que
realicen como grupo por teams, grabarlas y presentar al final
del documento escrito las tablas 1 y 2 en donde se muestre lo
especificado en cada una. Recuerden que solo se toman en
cuenta las reuniones grabadas, y la evaluación de la nota de
trabajo colaborativo será individual en cuanto al porcentaje
de participación de cada participante en las reuniones. Se
espera que este trabajo les tome mínimo 12 horas
(correspondiente a 4 horas semanales de trabajo autónomo),
de las cuales solo 10 horas deberán ser grabadas por teams
para llenar las tablas, y 2 horas serán de trabajo individual
previo a la reunión (lectura previa, redacción, investigación),
las cuales también debe ser registradas por el líder en la
tabla de acuerdo a la tarea pactada y el cumplimiento de la
misma que se evidencia en los productos y en la reunión.

Tabla 1.- Detalle

FECHA LINK DURACIÓN NOMBRES OBSERVA
EN HORAS DE CI ONES
DE DEL INTEGRAN (Integrante
REUNIÓN VIDEO T
DE LA
REUNIÓN
 ES que no
se
QUE conecta,
PARTICIPA baja
R ON EN participación
LA MISMA de alguno
de los

miembros
comprobable
en el
video,
etc)

Tabla 2.- Resumen para nota asignada por el líder

MIEMBRO # # TOTAL (#HORAS NOTA
DELGRUPO HORAS DE ACTIVAS/ SOBRE 5
ACTIVAS HORAS (REGLA
DE TRABAJADAS # TOTAL
TRABAJO POR EL DE 3)
POR GRUPO DE
PARTICIPAN HORAS)*1
TE 00
(DEMOSTRA
BL ES EN
EL
VIDEO)
Miembro 10 Mínimo 12 =(6/12)*1 2.5/5
1 00
(ejempl =50%
o)