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JVI Manuscrito aceptado publicado en línea el 30 de

enero de 2019 J. Virol. doi:10.1128/JVI.02185-18
Copyright © 2019 Sociedad Americana de Microbiología. Todos los derechos reservados.

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3Arbidol y otros medicamentos de bajo peso molecular

4Que inhiben los virus de Lassa y Ébola
5
6
7 Hulseberg CEa1, Fénéant Lb, Szymańska-de Wijs KMb, Kessler NPb, Nelson EAb,
8 Shoemaker CJc2, Schmaljohn CSc, Polyak SJd,e , White JMa,b,
9
10
11 Departamento de Microbiologíaa y Departamento de Biología Celularb, Universidad de Virginia,
12 Charlottesville, Virginia, 22908; Virology Divisionc, United States Army Medical Research
13 Instituto de Enfermedades Infecciosas, Fort Detrick, Maryland, 21702; Departamento de Laboratorio
14 Medicined y Departamento de Salud Global, Universidad de Washington, Seattle, Washington,
1598104 .
16
17
18
19
20
21
22 Resumen: 247 palabras
23 Importancia: 147 palabras
24 Texto principal: 5.187 palabras
25
26
27
28Título de la carrera : Fármacos dirigidos a la entrada del virus del ébola y la fiebre de Lassa
29
30
31
32
33 Direcciones presentes: Christine E. Hulseberg, Centro de Ciencias del Genoma, US Army Medical
34 Instituto de Investigación de Enfermedades Infecciosas, Fort Detrick, Maryland; C. Jason Shoemaker,
35 División de Sistemas de Diagnóstico, USAMRIID; Katarzyna Szymańska-de Wijs: Instituto de
Virología,
36 Facultad de Medicina de Hannover, 30625, Hannover, Alemania
37
1
38# Autor correspondiente: Dpto. de Biología Celular, Univ. de Virginia, 1340 Jefferson Park Ave,
39Charlottesville , VA, 22908-0732. Teléfono: (434) 924-2593. Fax: 434-982-3912. Correo electrónico:
40jw7g@virginia.edu
41

2
42 Resumen

43 Las terapias antivirales que impiden la entrada del virus son atractivas porque actúan en la primera fase
de la

44 ciclo infeccioso. Los fármacos que se dirigen a vías comunes a múltiples virus son particularmente

45 deseable cuando la identificación viral basada en el laboratorio puede ser difícil, por ejemplo, en un
brote

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46 entorno. Estamos interesados en identificar fármacos que bloqueen tanto el virus del Ébola (EBOV)
como el de Lassa

47 (LASV), dos virus de la fiebre hemorrágica no relacionados pero altamente patógenos que han causado

48 brotes en regiones similares de África y comparten características de entrada del virus: uso de la
superficie celular

49 factores de fijación, macropinocitosis, receptores endosomales y un pH bajo para desencadenar la

fusión en la

50 endosomas. Con este objetivo, comparamos directamente la potencia de ocho fármacos conocidos por
bloquear

51 entrada del EBOV con su potencia como inhibidores de la entrada del LASV. Cinco fármacos
(amodiaquina, apilimod,

52 arbidol, niclosamida y zoniporida) mostraron una inhibición aproximadamente equivalente del LASV y
del EBOV

53 glicoproteína (GP); tres (clomifeno, sertralina y toremifeno) fueron

54 más potente contra el EBOV. A continuación, nos centramos en el arbidol, que está autorizado en el
extranjero como anti

55 de la gripe y presenta actividad contra una amplia gama de virus clínicamente relevantes. En

56 encontraron que el arbidol inhibe la infección por el LASV auténtico, inhibe la GP del LASV mediada
por las células

57 y la fusión de células del virus y, al igual que su actividad sobre la hemaglutinina de la gripe, estabiliza

58 LASV GP a la exposición a un pH bajo. Nuestros hallazgos sugieren que el arbidol inhibe la fusión del
LASV, que

59 puede implicar en parte el bloqueo de los cambios conformacionales en la GP de LASV. Discutimos

nuestros hallazgos en

3
60 en cuanto al potencial para desarrollar un cóctel de fármacos que pueda inhibir tanto el LASV como el
EBOV.

61 Importancia

62 Los virus Lassa y Ébola siguen causando graves brotes en humanos, pero sólo hay

63 opciones terapéuticas para tratar las enfermedades mortales de fiebre hemorrágica que provocan.
Debido a

64 coincidencia geográfica y las similitudes en el modo de entrada en las células, buscamos una

4
65 un fármaco práctico o un cóctel de fármacos que pueda utilizarse para tratar las infecciones por ambos
virus. Para ello

66 objetivo, comparamos directamente ocho fármacos, aprobados o en pruebas clínicas, por su capacidad
de bloquear

67 entrada mediada por las glicoproteínas de ambos virus. Identificamos cinco fármacos con
aproximadamente

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68 igual potencia contra ambos. Entre ellos investigamos los modos de acción del arbidol, un fármaco

69 autorizado en el extranjero para tratar las infecciones de gripe. Encontramos, como se demostró para la
gripe, que el arbidol

70 bloquea la fusión mediada por la glicoproteína del virus de Lassa. Nuestros hallazgos alientan el
desarrollo

71 de una combinación de fármacos aprobados para tratar tanto la enfermedad por el virus de Lassa como
la del Ébola.

72

73 Introducción

74 El virus de Lassa (LASV) es un virus de ARN ambisentido envuelto que pertenece al

75 Arenaviridae. Al ser el miembro más importante de esta gran familia desde el punto de vista clínico, el
LASV es un importante

76 en África Occidental, donde se estima que infecta a unas 300.000 personas cada año. El LASV también
ha

77 ha sido responsable de varios casos importados de fiebre hemorrágica de Lassa (FHL) en Europa

78 y Norteamérica en los últimos años (1). El brote de FHL de 2018 en Nigeria fue especialmente

79 grave, con más de 430 casos positivos confirmados y una tasa de mortalidad de ~25% (2). Clásico

80 Los síntomas de la FHL aguda incluyen malestar general, cefalea, fiebre, vómitos, dificultad
respiratoria, cara

81 edema y hemorragia de las superficies mucosas (3). Sin embargo, incluso en los casos mortales, los
pacientes pueden

82 no se presentan con síntomas de fiebre hemorrágica redolente, lo que complica el diagnóstico (4).

83 La única opción de tratamiento antiviral para la FHL es el análogo de la guanosina, la

ribavirina. En
5
84 hay un número importante de contraindicaciones y efectos adversos asociados a la ribavirina, y

85 su eficacia en los ensayos clínicos sigue siendo controvertida y poco evaluada. Además,

86 aunque la ribavirina es eficaz contra otros arenavirus de la fiebre hemorrágica, su eficacia es limitada

87 contra los filovirus. Por lo tanto, las directrices actuales recomiendan la ribavirina sólo después de las
exposiciones de alto riesgo

6
 88 al LASV (5). Dado el solapamiento geográfico parcial entre el EBOV y el LASV en África Occidental

89 y una presentación clínica similar en las primeras etapas de la infección, sería ventajoso contar con un

90 terapéutica común eficaz contra ambos virus (6, 7).

91 Se han identificado nuevos compuestos prometedores contra el LASV (6, 8-17), pero la
limitada

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92 La endemicidad geográfica del LASV, su ineficaz transmisión de persona a persona y la baja re

93 de infección hacen que la perspectiva de recopilar datos de ensayos clínicos adecuados sobre nuevos
fármacos

94 desafiante. Por lo tanto, un enfoque práctico para aumentar más rápidamente el arsenal de
medicamentos contra

95 estos virus altamente patógenos es examinar la actividad antiviral de los medicamentos aprobados.
Cuando este

96 de la FDA con potencial de reutilización se emplearon muchos compuestos

97 identificados que mostraron efectos inhibitorios contra el EBOV (18-24). Se cree que muchos de ellos
actúan

98 en las etapas de entrada de la infección por EBOV. Un examen reciente similar reveló que los
medicamentos aprobados por la FDA

99 con actividad potencial contra el LASV (8).

100 Los inhibidores de la entrada del virus son valiosos como terapia, ya que bloquean la infección
en las primeras etapas de la

101 ciclo de vida reducirá el daño celular y tisular asociado a la replicación de los

102 virus y la producción de progenie viral. El LASV emplea varias características clave en común

103 con el EBOV para su entrada: 1) es internalizado en la vía endocítica por un macropinocytotic-

104 como proceso después del contacto inicial con los receptores superficiales/factores de adhesión, 2) se
necesita un pH bajo para

105 desencadenar la fusión, y 3) un receptor endosomal, de unión al colesterol, promueve el escape

endosomal

106 (Lamp1 para el LASV y NPC1 para el EBOV) (12, 25-32). Por lo tanto, para este estudio,
seleccionamos ocho

7
107 de bajo peso molecular que han demostrado inhibir la entrada del EBOV y compararon directamente su
inhibición

108 actividad contra el LASV y el EBOV. Cinco de estos fármacos están aprobados por la FDA
(amodiaquina,

109 clomifeno, niclosamida, sertralina y toremifeno), uno está autorizado en el extranjero (arbidol) y dos

110 se han evaluado en ensayos clínicos (apilimod y zoniporida).

8
111 El compuesto que investigamos con más detalle fue el fármaco antigripal arbidol

112 (Umifenovir), que fue desarrollado y se utiliza actualmente como antiviral. Arbidol ha sido

113 se ha informado de que tiene efectos inhibitorios sobre una gran variedad de virus, incluidos los de
ADN y ARN

114 así como los virus con cápsula y membrana (33-36). Los estudios destinados a determinar la

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115 mecanismo de acción del arbidol implican una serie de posibles efectos antivirales, entre ellos varios

116 pasos de entrada, así como las fases posteriores del ciclo infeccioso (36). El principal efecto inhibidor

117 de arbidol sobre el virus de la gripe, para el que ha sido un tratamiento autorizado en China y Rusia
durante

118 muchos años, parece ser durante una etapa tardía de entrada, cuando la gripe se fusiona con un
endosoma

119 membrana. Mientras que el arbidol puede unirse directamente a la HA de la gripe e inhibir su
capacidad de transición a

120 una conformación activada (37-39), aún no está claro si ésta es su única o principal

121 mecanismo de actividad antigripal, o si el arbidol también perjudica la fusión por intercalación en el

122 viral o de la membrana objetivo, lo que hace que la membrana sea menos flexible para la fusión (35).

123123

124 MATERIALES Y MÉTODOS

125125

126 Productos químicos y cultivo celular. Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), libre de
rojo de fenol

127 DMEM, Opti-MEM (OMEM), piruvato sódico, antibiótico/antimicótico, tripsina-EDTA 0,05%,

128 El rojo fenólico libre de tripsina-EDTA 0,5 % y el rojo neutro eran de ThermoFisher Scientific.

129 La solución salina tamponada con fosfato (PBS) era de Corning. Suero de ternera cósmica (CCS), suero
fetal bovino

130 El suero (FBS) y el suero de ternera suplementado (SCS) eran de HyClone. La fibronectina era de

131 Millipore. La polietilenimina (PEI) y la solución de disociación celular no enzimática eran de

9
132 Sigma. La lipofectamina 2000 era de Invitrogen. El citrato de toremifeno era de Selleck

133 Productos químicos. La zoniporida, la amodiaquina, la niclosamida y el citrato de clomifeno eran de

Sigma.

10
134 El apilimod era de Axon MedChem. El HCl de sertralina era de Toronto Research Chemicals.

135 El arbidol fue sintetizado comercialmente, y la pureza y la estructura del producto fueron

136 confirmado como se ha descrito anteriormente (34).

137 Las células HEK293T/17 y BSC-1 eran del ATCC, las células HEK293T/17 KO de Lamp1

138 (clon 1D4) fueron descritas en Hulseberg et al., 2018. Las células COS7 procedían del ATCC y un

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139 regalo de Douglas DeSimone de la Universidad de Virginia. Las células BHK-21 proceden del

140 ATCC y una amable donación de James Casanova de la Universidad de Virginia. Las células
Vero76 fueron
141 del Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas del Ejército de los Estados
Unidos (USAMRIID).
142 Las células HEK293T/17 y BSC-1 se mantuvieron en DMEM con un 10% de CCS. Células
BHK21
143 se mantuvieron en DMEM con un 10% de SCS. Las células COS7 y Lamp1 KO HEK293T/17
fueron
144 mantenidos en DMEM con 10% de FBS, 1% de piruvato sódico y 1% de antibiótico/antimicótico.

145 Las
células Vero76 se mantuvieron en el MDE de Corning con un 10% de GibcoFBSyun 1% de
146 penicilina/estreptomicina, 1% de L-Glutamina y 1% de piruvato sódico.

147

148 Plásmidos y virus. El plásmido pCMV-LASV-GPC de la cepa Josiah era de F.L. Cosset

149 (Universidad de Lyon, Francia) a través de Gregory Melikian (Universidad de Emory), el LASV-
GPC-Flag
150 La cepa pCC421 Josiah es de Jason Botten (Universidad de Vermont). El plásmido VSV-G era de

151 Michael Whitt (Universidad de Tennessee); la cepa pDisplay-EBOV-GPΔ Mayinga fue de Erica

152 Saphire (Scripps Research Institute). El plásmido TG-Luc era de Jean Dubuisson (Centre

153 National de la Recherche Scientifique, Lille, Francia) a través de Gary Whittaker (Cornell
University),
154 El plásmido pCMV-Gag-Pol es de Jean Millet y Gary Whittaker (Universidad de Cornell) y Jean

155 Dubuisson; el plásmido Gag-βlaM fue elaborado por James Simmons (Universidad de Virginia). El

11
156 El plásmido pcDNA3-luciferasa (Firefly) era de Addgene. Los plásmidos DSP1-7 y DSP8-11 eran

12
157 de Naoyuki Kondo (Kansai Medical University, Japón). Los plásmidos WSN HA y NA fueron

158 de Gary Whittaker (Universidad de Cornell). Los plásmidos que codifican LCMV GP y Junin GP
fueron

159 de Jack Nunberg (Universidad de Montana).

160 El stock de LASV (cepa Josiah) utilizado se generó infectando células Vero E6 en

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161 EMEM completo (VWR) con un 10% de FBS (HyClone) y un 2% de L-Glutamina (ThermoFisher

162 Scientific). Las células infectadas se incubaron a 37°C/5% de CO2.Cultivo de células con virus

163 El sobrenadante se recogió 3 días después de la inoculación, se clarificó a 10.000 x g a 4°C durante 10
minutos y

164 congelado a -80°C. Todo el trabajo con LASV nativo se realizó en una sala de contención BSL4 con

165 el personal con trajes de encapsulamiento de presión positiva siguiendo los POE institucionales
adecuados.

166166

167 Anticuerpos y reactivos de inmunoprecipitación. Para el western blotting, se utilizó el anticuerpo de

ratón anti-LASV-

168 El GP L52-134-23A era de USAMRIID y el anti-mouse-IR680RD era de Licor. Para el LASV

169 Captura de cuentas GP, las cuentas magnéticas α-Flag®M2 eran de Sigma.

170170

171 Producción de pseudovirus. Para producir pseudovirus de VSV, se sembraron 1 x 106 células BHK-21
en

172 cada uno de los platos múltiples de 10 cm2. Las células de cada placa se transfectaron con 12 μ g de
plásmido

173 que codifica el LASV-GPC utilizando PEI. Al día siguiente, las células se infectaron con 40μl (por
placa)

174 Virus ayudante VSV-ΔG (a partir del eluato de la placa pretratada) que codifica la luciferasa Renilla
(diluida en

175 medios sin suero) durante 1 hora a 37°C. Después de la infección, las células se lavaron
abundantemente con PBS frío

176 y se incubaron durante la noche en DMEM completo. Los sobrenadantes que contenían pseudovirus se
13
177 recogido, clarificado y peleado a través de un 20% de sacarosa-HM (20 mM HEPES, 20 mM MES, 130

178 mM NaCl, pH 7,4). El pellet se resuspendió en sacarosa-HM al 10%. Ayudante VSV-ΔG

14
179 se produjo siguiendo el mismo procedimiento, infectando células transfectadas con VSV-G con

180 eluato de las placas VSV-ΔG.

181 Para los pseudovirus MLV, se sembraron células HEK293T/17 en placas de 10 cm2. Las
siguientes

182 día, las células se transfectaron con 6 μg de ADN total utilizando una proporción 2:1:1:1 de pTG-
Luc:pCMV Gag-

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183 Pol:Gag-βlam:glicoproteína. A las 48 horas después de la transfección, se recogió el medio que
contenía el virus,

184 clarificado, granulado a través de un cojín de sacarosa-HM al 20%, resuspendido en sacarosa-HM al

10% y

185 almacenado a -80C en alícuotas de un solo uso.

186186

187 Ensayo de reducción de la placa de LASV. Se sembraron células Vero76 en placas de 6 pocillos. A
plena confluencia,

188 células en pozos duplicados fueron pretratadas con la concentración indicada de arbidol, 25 mM

189 NH4Cl, o vehículo de etanol al 10% durante 1 hora a 37C. A continuación, las células se infectaron con
LASV a una

190 multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 durante 1 hora en presencia de la concentración indicada de

191 arbidol o vehículo. Las células se lavaron dos veces para eliminar el virus no unido y se incubaron
durante 24 horas a

192 37°C en un medio que contenía fármacos. Se recogieron los sobrenadantes y se realizaron diluciones
seriadas de 10 veces

193 para infectar monocapas confluentes de ~90% de células Vero76 en placas de 6 pocillos durante 1 hora
a 37°C, con

194 agitando cada 15 minutos. Una superposición primaria consistente en una mezcla 1:1 de agarosa
SeaKem al 1,6%.

195 (Lonza) y 2x EBME (ThermoFisher Scientific) suplementado con 20% de FBS y 8% de

196 A continuación, se añadió Glutamax (ThermoFisher Scientific) sobre las células infectadas y se dejó
que

197 solidificar. Las células se incubaron durante 4 días a 37°C, seguido de la adición de una capa
15
 secundaria

198 consistente en una mezcla 1:1 idéntica a la anterior pero con la adición de un 8% de Rojo Neutral (final

199 La concentración de NR fue del 4%). Las placas se contaron al día siguiente. Los recuentos de placas
fueron

200 promediado de los pozos duplicados y luego multiplicado por el factor de dilución para establecer el
título inicial de

201 sobrenadantes de entrada.

16
202202

203 Bioseguridad. Todas las manipulaciones en las que intervino el LASV vivo se realizaron en un nivel
de bioseguridad 4

204 de contención en el USAMRIID con personal que lleva trajes de protección de presión positiva
equipados

205 con filtros HEPA y aire alimentado por umbilical. USAMRIID está registrado en los Centros de

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Enfermedades

206 Programa de Control de Agentes Selectos para la posesión y uso de agentes biológicos selectos y
toxinas

207 y ha implementado un programa de garantía biológica de acuerdo con la regulación del Ejército de los
Estados Unidos AR

208 50-1 "Garantía biológica".

209209

210 Ensayo de infección por pseudovirus. Las células BSC-1 se sembraron en placas blancas de 96
pocillos (1,5 x 104

211 células/pocillo). Al día siguiente, las células se pretrataron con fármacos (o con un simulacro) durante 1
hora en OMEM y

212 luego, manteniendo la presencia del fármaco, se infectaron con un aporte de EBOV GP- y

213 Los pseudovirus LASV GP que habían sido pretratados para lograr señales RLU aproximadamente
equivalentes en

214 las muestras tratadas de forma simulada. Tras 24 horas a 37°C/5% de CO2, las células se lisaron con
Britelite

215 (PerkinElmer) y se midió la luminiscencia. Concentraciones IC50 y estadísticas

216 El análisis de todos los datos se realizó con GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.):

217 Log(Agonista) frente a la pendiente de la variable de respuesta (cuatro parámetros) restringida a

fondo=0.

218218

219 Ensayo de fusión célula-célula (CCF). Se sembraron células efectoras (HEK293T/17) en placas de 6
pocillos (6,75 x

220 105
células/pocillo). Las células objetivo (HEK293T/17) se sembraron en pocillos blancos opacos de 96-
17
221 placas de pocillos (3,5 x 104 células/pocillo). Las células efectoras se transfectaron con 1 µg/pocillo de
plásmido GP

222 y 1 µg/pocillo de plásmido DSP1-7. Las células objetivo fueron co-transfectadas con 33 ng/well de
pmLamp1 y

223 33 ng/pocillo de plásmido DSP8-11. Las células se transfectaron con Lipofectamine 2000, según

224 las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de las transfecciones, se cargaron las
células efectoras

18
225 con sustrato de luciferasa EnduRen™ (Promega) (60 µM en DMEM completo) durante 2 horas a 37oC.

226 Las células efectoras se enjuagaron con PBS y se levantaron con la disociación celular no enzimática

227 Solución. Las células efectoras se volvieron a suspender en DMEM completo y 1 x 105 células efectoras
se

228 sobre cada pocillo de células objetivo (placa de 96 pocillos). Las células se co-cultivaron durante 3
horas. En este

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229 tiempo, se aplicó un pulso de pH bajo con tampón de fusión (100mM NaCl, 15 mM HEPES, 15 mM

230 succinato, 15 mM MES, 2 mg/mL de glucosa) ajustado a pH 5.0, durante 5 min a 37oC. El pH se re

231 neutralizado sustituyendo el tampón de fusión por DMEM completo, y las células fueron devueltas a

232 37oC durante 1 hora antes de medir la actividad de la luciferasa.

233233

234 Ensayo de fusión forzada en la membrana plasmática (FFPM). Las células COS7 se sembraron en
pocillos de 6

235 placas (4 x 105 células/pocillo). ~24 horas después de la siembra, las células se transfectaron con 1 µg de
plásmido

236 codificación de la luciferasa de luciérnaga utilizando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las

237 instrucciones. ~24 horas después de la transfección, las células se lavaron, se levantaron y se
resembraron a 1,5 x 104

238 células/pocillo en placas de 96 pocillos blancas opacas recubiertas de fibronectina. Al día siguiente de
la resiembra, las células fueron

239 enfriados en hielo durante 15 minutos y los pseudovirus LASV-GP VSV-luciferasa (Renilla), que
habían sido

240 para alcanzar una señal objetivo de al menos 1 x 106 RLUs en un ensayo de infección estándar, se
añadieron

241 a las células por quintuplicado en DMEM sin suero. Los pseudovirus se unieron a las células mediante

242 centrifugación (250 x g, 1 h, 4°C). Las células se volvieron a colocar en hielo y se lavaron una vez con
PBS frío.

243 La fusión se desencadenó aplicando un pulso de tampón de fusión de pH bajo precalentado (como en el
ensayo CCF)

19
244 durante 5 minutos a 37°C ajustado a los valores de pH indicados. Las células se volvieron a colocar en
hielo y la fusión

245 El tampón se sustituyó por DMEM completo con 40 mM de NH4Cl (para bloquear la entrada del virus
por

246 la vía endocítica normal). Dieciséis horas después, se midió la actividad de la luciferasa utilizando

247 el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo® (Promega) según las instrucciones del fabricante

20
248 utilizando un luminómetro GloMax® de Promega. La relación de la actividad de la luciferasa Renilla
(un indicador de

249 infección por pseudovirus) sobre la actividad de la luciferasa de luciérnaga (para tener en cuenta el
número de células) fue

250 calculado para evaluar la fusión mediada por la GP viral con la membrana plasmática.

251251

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252 Ensayo de disociación de GP1. Se sembraron células HEK293T/17 KO de Lamp1 en placas de 6
pocillos (6,25 x 105

253 células/pocillo). Al día siguiente, las células se transfectaron con 1 µg de LASV-GPC-Flag utilizando
PEI.

254 A las 48 horas después de la transfección, las células se lisaron con el tampón NETI (150 mM NaCl, 1
mM EDTA,

255 50 mM Tris-HCl, 0,5% Igepal) a pH 8. Tras limpiar los restos celulares (centrifugación durante 15 min
a

256 21.000 x g), el lisado se incubó con α - F l a g ® M2 Magnetic Beads (que fueron prelavadas

257 dos veces en tampón NETI de pH 8) durante 1 hora a 4°C. A continuación, se añadió Arbidol al lisado
con microesferas

258 como se indica, y las muestras se incubaron durante una hora más a 4°C. Para el pH-

259 experimentos de disociación dependiente, perlas con LASV GP capturadas y pretratadas +/- arbidol

260 se volcaron en un soporte magnético y se lavaron rápidamente con tampón NETI frío (sin

261 arbidol) al pH indicado. El tampón NETI frío se sustituyó por NETI precalentado

262 tampón al mismo pH +/- arbidol, como se indica. Las muestras se incubaron a 37°C durante 1 minuto.
Para

263 experimentos de disociación en función del tiempo, perlas con GP de LASV capturada y pretratada +/-

264 arbidol como en el caso anterior se lavaron rápidamente con tampón NETI frío a pH 6,5. El tampón frío
de pH 6,5

265 se sustituyó por el tampón NETI precalentado a pH 6,5 +/- arbidol. Las muestras fueron entonces

266 incubadas a 37°C durante 0,5, 1,0, 2,5 o 5,0 min. Las muestras de "0 min" fueron tratadas con pre

267 tampón calentado, y se coloca inmediatamente en hielo después de la adición del tampón. Al final de la
21
268 período de incubación indicado, las muestras se colocaron inmediatamente en la gradilla magnética y

269 sobrenadantes recogidos. A continuación se eluyeron las proteínas de las perlas residuales utilizando
glicina 100 mM

270 pH 3,5 durante 15 minutos a 25oC con agitación constante, y las muestras eluidas se neutralizaron con

22
271 la adición de Tris-HCl 1M, pH 8,5. El sobrenadante y las muestras de microesferas se analizaron a
continuación mediante SDS-

272 PAGE y western blotting, con un anticuerpo primario contra LASV GP1. La intensidad de la señal de

273 las bandas de GP1 en el sobrenadante y en las muestras de perlas correspondientes se midió utilizando
ImageJ.

274 El porcentaje de disociación de la GP1 se calculó como la intensidad de la señal de la banda de la GP1

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en el

275 sobrenadante dividido por la intensidad de la señal sumada de las bandas de GP1 en el sobrenadante y
la perla

276 muestras.

277277

278278

279 RESULTADOS

280280

281 Comparación de la potencia de los inhibidores de moléculas pequeñas contra LASV GP- y EBOV
GP-

282 entrada mediada. Los virus envueltos que son endocitados dependen de sus glicoproteínas (GPs) para

283 median todo el proceso de entrada, desde la adhesión a la superficie celular hasta la fusión dentro de los
endosomas

284 membranas. Aquí comparamos directamente los efectos de ocho fármacos que bloquean la entrada del
EBOV para

285 sus efectos sobre la entrada mediada por la GP del LASV. Para ello, utilizamos virus de la leucemia
murina (MLV)

286 que llevan un reportero de luciferasa y están pseudotipados con LASV o EBOV GP. Dosificación del
fármaco

287 se determinaron estableciendo la concentración de cada fármaco necesaria para provocar una

288 inhibición total de la infección. Las dosis restantes de cada conjunto eran diluciones seriadas de dos
veces. Un simulacro de

289 (sólo vehículo) se incluyó como punto de anclaje en cada serie para evaluar el grado de

23
290 en las células tratadas.

291 Curvas comparativas directas representativas de respuesta a la dosis para el LASV y el EBOV
para cada

292 los ocho fármacos se presentan en la Fig. 1. Cada fármaco se probó en paralelo contra LASV GP- y

293 EBOV GP-MLV en tres a cinco experimentos independientes. En la Tabla 1 se informa de los

24
294 relación media del valor IC50 contra el LASV GP dividido por el del EBOV GP, analizado en

295 en paralelo, para cada uno de los ocho fármacos probados. Estas proporciones indicaron que los valores
de IC50 contra

296 Pseudovirus LASV GP-MLV para cinco medicamentos (zoniporida, amodiaquina, niclosamida,
apilimod,

297 y arbidol) eran aproximadamente iguales o inferiores a los valores correspondientes para

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298 EBOV GP-MLV, lo que indica una potencia similar o mayor contra LASV GP-

299 mediada por la infección. Para tres fármacos, clomifeno, sertralina y toremifeno, los valores de IC50
para

300 LASV son ~3-6 veces mayores que las del EBOV, lo que indica que estos fármacos son más potentes

301 contra el EBOV. Cabe destacar que estos tres últimos fármacos son anfifílicos catiónicos (CAD),

302 que puede ser especialmente activo contra el EBOV (19, 20, 23, 40).

303 Para el resto del estudio nos centramos en el arbidol, por las razones expuestas en el

304 introducción. Pécheur y sus colegas informaron de una EC50 de 5,8 µM en células Vero para el arbidol
contra

305 el arenavirus del Nuevo Mundo, el virus Tacaribe; hasta donde sabemos, este último es el único

306 evaluación publicada de la eficacia del arbidol contra un arenavirus. Utilización de pseudovirus MLV

307 Encontramos que además de inhibir la entrada mediada por la GP del LASV (Fig. 1), el arbidol inhibió

308 entrada mediada por las GPs de otros dos arenavirus, los de LCMV y Junin (Fig. 2A). En

309 también descubrió, utilizando pseudovirus MLV, que el arbidol es algo más potente contra el GP- de
LASV

310 que contra la infección mediada por la HA de la gripe de la WSN (H1N1)

311 cepa (Fig. 2B).

312312

313 El arbidol bloquea la auténtica infección por el LASV. Para evaluar la eficacia de arbidol contra la
auténtica

314 LASV, realizamos ensayos de reducción de placas de LASV (Josiah) en condiciones BSL4, probando la

25
315 efectos de concentraciones de arbidol de hasta 40 µM. Las células fueron pretratadas con arbidol
durante 1 hora y

316 luego se infectaron con LASV (Josiah) en presencia continua de arbidol durante 24 h. En la primera de

26
317 tres experimentos el IC50 fue de ~ 5-10 µM y la inhibición máxima fue del 98% (Fig. 3A); en

318 En el segundo, el IC50 fue de ~20 µM y la inhibición máxima fue del 100% (Fig. 3B). En un tercer

319 experimento, probando sólo 20 µM de arbidol, el porcentaje de inhibición fue del 74% (Fig. 3C). El
promedio de

320 El porcentaje de inhibición causado por 20 µM de arbidol en los tres experimentos fue del 72,5% (Fig.
3D). En

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321 La inspección visual de 40 µM de arbidol no tuvo ningún efecto sobre las monocapas de células Vero
hasta cinco días (datos

322 no se muestra). Observamos que el IC50 aparente para el arbidol frente al LASV auténtico (Fig. 3) es
mayor que

323 que la observada con los pseudovirus MLV que llevan el GP LASV (Figs. 1 y 2).

324324

325 El arbidol bloquea la fusión mediada por la GP del LASV. A continuación, nos preguntamos si el
arbidol impide la fusión de LASV GP-

326 mediada por la fusión, como ocurre con otros virus (33, 35, 38, 39, 41). Dado que la fusión óptima del
LASV

327 requiere la proteína endosomal Lamp1 (26, 31, 42), utilizamos células que expresan Lamp1 en el

328 membrana plasmática (pmLamp) como objetivos de fusión. A continuación se indujo la fusión célula-
célula (CCF) entre

329 co-cultivo de células efectoras (que expresan LASV GP en su superficie) y células diana (que expresan

330 Lamp1 en su superficie) exponiendo brevemente las células a un pH bajo, como se ha descrito
anteriormente (31). Para

331 evaluar los efectos del arbidol, las células efectoras (que expresan LASV GP) fueron pretratadas
durante 1 hora con

332 la concentración indicada de arbidol, co-cultivado con células objetivo que expresan pmLamp1, y

333 y luego se desencadena la fusión mediante una breve exposición a pH 5 (todo ello en presencia
continua de arbidol). El

334 La eficiencia de la CCF se determinó entonces midiendo la actividad del reportero de luciferasa que es

335 restaurado funcionalmente tras la mezcla citoplasmática de las células fusionadas (43). Como se
observa en la Fig. 4A, el CCF por
27
336 La GP de LASV (a pH 5,0) fue suprimida por 20 μ M y 40 μ M d e arbidol. Sobre la base de los
hallazgos en

337 experimentos paralelos (Fig. 4B), el arbidol parecía más potente para impedir el LASV-GP que

338 de la gripe mediada por la HA, en consonancia con su efecto algo mayor sobre la GP- de LASV

339 en comparación con la infección por el pseudovirus HA-MLV de la gripe (Fig. 2B).

28
340 Como complemento al estudio CCF (Fig. 4), empleamos una fusión forzada en el plasma

341 membrana (FFPM) y evaluó la fusión de los pseudovirus LASV GP-VSV con la superficie

342 de células que expresan pmLamp1 (es decir, con Lamp1 en la superficie de la célula), como se ha
descrito previamente (31).

343 Como se observa en la Fig. 5A, el arbidol suprimió el FFPM mediado por el LASV-GP con una fuerte
y completa

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344 inhibición observada con dosis de 20 y 40 μ M , respectivamente. El experimento mostrado en la Fig.
4A fue

345 realizado con un pulso de pH bajo de pH 5,0. Como se observa en la Fig. 5B, 40 μM de arbidol
inhibieron fuertemente

346 FFPM mediada por LASV GP tanto a pH 5,0 como a pH 5,5.

347347

348 Efectos del arbidol en la disociación de la GP1 del LASV. En el caso de la gripe, el arbidol estabiliza
la HA

349 (la proteína de fusión) tal que la dependencia del pH para su cambio de conformación que induce la
fusión es

350 desplazado en 0,2-0,3 unidades en la dirección más ácida (37, 39). La estabilización de la HA se
considera

351 parte del mecanismo del arbidol contra el virus de la gripe (38, 39, 44, 45). Dado que dos

352 de la fusión de la GP de LASV, a continuación, se ha demostrado que el arbidol afecta a la actividad de

fusión de la GP de LASV.

353 se preguntó si impedía un cambio conformacional en la GP1 necesario para la activación de la fusión.
En

354 exposición a un pH bajo, la GP del LASV sufre reordenamientos estructurales, siendo uno de los
primeros

355 disociación de GP1, la subunidad de unión al receptor, de GP2, la subunidad de fusión. Esta temprana

356 Se cree que el cambio autoriza los cambios posteriores que permiten al bucle de fusión (en GP2)
acceder a la

357 membrana de destino y luego permitir que GP2 se pliegue de nuevo en un trímero de horquillas, lo que
hace que la

29
358 membranas virales y endosomales en contacto íntimo que conduce a su fusión (46-49).

359 Los experimentos realizados con GP1/GP2 aislados de LASV capturados en perlas mostraron que en
este sistema,

360 la disociación de la subunidad GP1 de 44 kDa se produce de forma óptima a 37°C y la mitad de la
misma a un pH de ~6,4

361 a 37°C tras un pulso de pH bajo de 1 minuto (datos no mostrados). Por lo tanto, tratamos el LASV
GP1/GP2

362 inmovilizado en perlas con 0 o 40 µM de arbidol y luego se expusieron las perlas a tampones de

30
363 diferentes valores de pH durante 1 minuto a 37oC. Como se observa en la Fig. 6A, la presencia de 40
μM de arbidol desplazó

364 la dependencia del pH para la disociación de GP1 en ~0,5 unidades en la dirección más ácida, lo que
sugiere

365 que, como en el caso de la HA de la gripe, el arbidol puede estabilizar la GP del LASV. Si el arbidol
estabiliza la GP del LASV, entonces

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366 podría retrasar la disociación de la GP1 en este sistema. Para comprobar esta idea, volvimos a capturar
LASV

367 GP1/GP2 en perlas, se pretrataron las muestras con 0 o 40 μM de arbidol, se trataron las perlas a pH
6,5

368 y 37oC en presencia de arbidol, y luego se tomaron muestras de 0-5 min y se ensayaron para

369 disociación de GP1. Como se ve en la Fig. 6B, el arbidol parece introducir un retardo de ~30 segundos,
por lo que

370 ralentizando la disociación de la GP1.

371371

372 DISCUSIÓN

373 Fármacos que bloquean la entrada mediada por el LASV y el EBOV GP con una potencia
similar. Comenzamos esta

374 estudio comparando la capacidad de ocho fármacos para inhibir la GP mediada por el LASV y el
EBOV

375 infección. Las ocho son pequeñas moléculas estables a temperatura ambiente, disponibles por vía oral,
que bloquean

376 Los procesos de entrada del EBOV (18-20, 22, 23, 40, 50) y los procesos de entrada de los objetivos
también utilizados por el LASV (20-23, 51-

377 53). Seis están aprobados para uso clínico y dos están en fase de pruebas clínicas avanzadas. Este
conjunto de

378 características ofrecen ventajas prácticas (por ejemplo, costes netos y facilidad de transporte y entrega)
en comparación con

379 a los nuevos fármacos, muchos de los cuales están diseñados con un enfoque de "un fármaco-un bicho"
(54).

380 Cinco fármacos mostraron una potencia similar contra la entrada mediada por LASV y EBOV
31
 GP (Tabla

381 1). La zoniporida, un inhibidor del intercambiador Na+/H+ de la membrana plasmática, bloquea la
infección por el

382 arenavirus LCMV al impedir la captación macropinocítica de las partículas virales (52). Dado que tanto
el LASV

383 (30) y el EBOV (55, 56) se introducen en las células por macropinocitosis, esperábamos y encontramos

384 zoniporida para tener una actividad similar contra ambos. Dos fármacos que alteran la acidificación del
endosoma,

385 necesarios para la entrada de ambos virus (25, 49)---amodiaquina (un antipalúdico) y niclosamida (un

32
386 antihelmíntico)---también mostró una potencia similar contra ambos GPs virales en nuestra
comparativa directa

387 pruebas. Ambos han demostrado, aunque no en estudios comparativos directos, que inhiben muchos
patógenos

388 que entran en las células por endocitosis (21-23, 57-60). El cuarto fármaco con actividad similar contra
ambos

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389 virus es el apilimod, que inhibe la PIKfyve, una enzima necesaria para la maduración tardía del
endosoma

390 (51, 53, 61) y la entrada del EBOV (27). El apilimod bloquea el tráfico del VEB a los endosomas
tardíos (51,

391 53), que sirven como portales tanto para el EBOV como para el LASV (25, 26, 62-64). El quinto
fármaco con

392 El arbidol (Umifenovir) tiene una potencia similar contra la entrada mediada por la GP del LASV y la
GP del EBOV.

393 antiviral sintético aprobado y utilizado en Rusia y China para combatir la gripe, y que ha demostrado

394 tienen una actividad antiviral de amplio espectro (33, 34, 36, 38, 39).

395 Los otros tres fármacos (clomifeno, toremifeno y sertralina) mostraron un nivel de

396 mayor actividad contra la GP del EBOV que la entrada mediada por la GP del LASV. Son DAC que
bloquean

397 Las infecciones por EBOV (19, 20, 22, 23, 40) y causan la acumulación de colesterol en los endosomas
tardíos,

398 imitando los efectos del NPC1 disfuncional, el receptor del EBOV (27, 28, 65). Dado que el LASV
también

399 entra en las células a través de los endosomas tardíos (31), las EAC pueden interferir con la entrada del
LASV debido a la

400 alteraciones de la función del endosoma tardío. La mayor actividad del toremifeno y la sertralina

401 contra el EBOV (Tabla 1), puede deberse a que pueden unirse tanto a la GP del EBOV, como lo
demuestra la

402 de estabilidad y la cristalografía de rayos X (66, 67), así como a la

403membrana (35, 39, 45, 66).

33
404

405 Mecanismos por los que el arbidol puede bloquear la entrada y la infección del LASV. El arbidol
mostró

406 con una potencia más o menos equivalente contra la infección por pseudovirus mediada por el LASV y
el EBOV (Fig.

407 1, Tabla 1), bloqueó la infección por el auténtico LASV (Fig. 3), y fue algo más eficaz en

408 bloqueando la fusión y la entrada mediada por la GP del LASV frente a la HA de la gripe (Figs. 2B y
4B). Tres

34
409 Se han propuesto mecanismos para la acción del arbidol contra la gripe: unión directa a la HA

410 (Kd 47 μM a la HA de la gripe PR8) (38, 44) y, como se ha propuesto para otros virus, la unión a la

411 y/o la membrana objetivo para reducir la aptitud para la fusión (34, 35). Al unirse y estabilizar

412 HA, el arbidol desplaza el umbral de pH para los cambios conformacionales que inducen la fusión en
~0,2 a 0,3

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413 unidades en la dirección más ácida (37, 38). Esto es digno de mención, ya que incluso estos pequeños
cambios en

414 El pH de fusión puede influir significativamente en la infectividad de la gripe (67). De manera similar,
encontramos que el arbidol

415 desplaza la dependencia del pH para la disociación de la GP1 de la GP2 de LASV en ~0,5 unidades (en
la zona más ácida

416 dirección). Se cree que este acontecimiento desencadena la subunidad de fusión de LASV (GP2),
análoga a la

417 desprendimiento de la HA2 de la gripe y de la gp41 del VIH. Por lo tanto, además de su probable
fusión general-

418 efectos perjudiciales causados por la intercalación en la membrana viral y/o endosomal (35, 45, 66),

419 es plausible que el arbidol afecte adicionalmente a la estabilidad de la GP de LASV de forma similar a
su

420 efectos sobre la HA de la gripe (37-39). Y, como se ha revisado en otro lugar (36), el arbidol también
puede afectar a los pasos

421 antes o después de la fusión.

422422

423 Potencial terapéutico de fármacos con potencia similar contra el LASV y el EBOV. Como se ha
razonado

424 en la Introducción, un objetivo a largo plazo es identificar un cóctel de fármacos que inhiba tanto el
LASV como

425 EBOV. Nos centramos en fármacos estables a temperatura ambiente y disponibles por vía oral que se
dirigen a los procesos utilizados

426 en común para la entrada del LASV y el EBOV en las células. Aquí identificamos cinco fármacos que
se dirigen a

35
427 pasos discretos de entrada y muestran aproximadamente la misma potencia contra el LASV y el EBOV
GP-

428 mediada por la entrada: el inhibidor de la macropinocitosis, zoniporida; los inhibidores de la

acidificación del endosoma

429 amodiaquina y niclosamida; el inhibidor del tráfico, apilimod; y el inhibidor de la fusión,

430 arbidol.

36
431 Aunque la zoniporida no está aprobada, ha pasado a la fase II de los ensayos clínicos para el
tratamiento

432 de las enfermedades cardiovasculares. Como alternativa, el medicamento aprobado por la FDA
aripiprazol (nombre comercial

433 Abilify) puede ser útil. El aripiprazol bloquea la infección por EBOV y se sinergiza con otras entradas

434 inhibidores (20, 23). Los datos preliminares sugieren que bloquea la internalización de las partículas de

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EBOV así

435 como la infección mediada por LASV GP (Laboratorio White, datos no publicados). La acidificación
del endosoma

436 Los inhibidores de la amodiaquina y la niclosamida están disponibles por vía oral y están aprobados
por la FDA para tratar la malaria

437 y helmínticos, respectivamente. En ambos casos, la Cmáx está dentro del rango de la IC50 para los anti

438 Actividad contra el EBOV/LASV (20-23, 57, 68, 69). Los nuevos derivados de la amodiaquina (59) o
los sinérgicos

439 pares de fármacos que contienen amodiaquina o niclosamida y otro agente podrían reducir la

440 dosis (23). Y aunque el inhibidor del tráfico apilimod es bien tolerado y un potente antagonista

441 de EBOV y LASV (51, 53, 70) (y este estudio), en una primera prueba, no protegió a los ratones de

442 letal del EBOV (véase (23)), probablemente debido a su inhibición de la producción de IL12/23 ((61) y

443 Rogers et al, manuscrito presentado).

444 Entre los inhibidores de la fusión ensayados, el arbidol se perfila como un candidato para
futuras

445 consideración, ya que muestra una actividad similar contra el LASV y el EBOV y aparece, en nuestros
ensayos,

446 algo más potente contra la fusión mediada por el LASV y la GP del EBOV frente a la HA de la gripe y

447 entrada. Arbidol está aprobado y se utiliza en China y Rusia contra la gripe y ha demostrado

448 una actividad antiviral sorprendentemente amplia (33, 36, 71). Una única dosis humana estándar (200
mg) de

449 arbidol arroja una Cmax inferior (33, 72-74) a nuestra indicación preliminar (Fig. 3) de su IC50 contra

450 LASV auténtico. Sin embargo, observamos que los IC50 estimados para el arbidol contra el LASV
37
 auténtico

451 (Fig. 3) y de la gripe (39, 45, 75) son similares (aproximadamente ~10 μM; variable para las diferentes
gripe

452 cepas). Como la dosis estándar de arbidol para la gripe es de 200 mgs tres (72) o cuatro (75) veces por

453 día, y como el arbidol tiene una vida media larga (36), la Cmáx neta (acumulada) con dosis diarias
múltiples

38
454 se espera que sea significativamente mayor (S. Polyak y M. Paine, cálculo no publicado). Por lo tanto,

455 ya que la dosis estándar de arbidol es clínicamente beneficiosa contra la gripe (véase, por ejemplo,
(75)), es

456 puede tener utilidad contra el LASV y el EBOV. Sin embargo, la única y modesta reducción del título
observada

457 (Fig. 3), junto con la experiencia con otro virus de la fiebre hemorrágica (76), se oponen a

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458 proponiendo el arbidol como terapia independiente. Una dosis superior tolerada de arbidol (74), un
nuevo

459 derivado del arbidol (39, 44), o una combinación de arbidol con otro fármaco (23, 77, 78) podría

460 reducir la dosis necesaria para estar en línea con la eficacia antiviral alcanzable. Con respecto a un
potencial

461 cóctel de medicamentos que incluye arbidol, es interesante que la amantadina, la rimantadina, la
ribavirina y

462 Se ha informado de que el ribamidil potencia la actividad del arbidol contra la gripe (79).

463 Prevemos que un fármaco o cóctel aprobado, estable a temperatura ambiente y disponible por
vía oral

464 de fármacos aprobados podría desplegarse rápidamente para el tratamiento o la profilaxis contra la
(presunta)

465 casos de LASV y EBOV, especialmente en regiones del mundo que tienen problemas de

466 recursos, infraestructura y accesibilidad. Un medicamento de este tipo, o un cóctel de medicamentos,

podría ser valioso

467 antes de que se haya hecho un diagnóstico definitivo, simultáneamente con la vacunación (por ejemplo,
de

468 trabajadores y/o los primeros en responder a los brotes), y/o durante la puesta en marcha de la
vacunación en anillo. Aquí

469 hemos identificado varios fármacos con estos atributos que muestran una inhibición similar de LASV y

470 entrada del EBOV. Además, tres de ellos -amodiaquina, niclosamida y arbidol- inhiben

471 múltiples virus con envoltura (33, 36, 57, 60, 71, 80-83). Por lo tanto, un fármaco o un cóctel de
fármacos que contenga

472 estos fármacos podrían inhibir múltiples virus con envoltura que entran en las células a través de la vía
39
 endocítica

473 vía (49).

474474
475 AGRADECIMIENTOS

476 Los autores agradecen a la Dra. Aura Garrison (USAMRIID) su generosa donación del virus LASV
477 utilizado en los ensayos de reducción de la placa. También agradecemos a Mary Paine, del Estado de
Washington

40
478 University, por sus útiles discusiones sobre cómo calcular los índices de acumulación de fármacos. El
trabajo fue
479 apoyado por NIH RO1 AI114776 (a JMW).
480480

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41
481481
482482
483483
Medi Paso n Relación media (+/- SEM)
came Bloqueado IC50 LASV/ IC50 EBOV
nto
Zoniporida Internalización 3 0.72 +/- 0.14
Amodiaquina Acidificación 4 0.41 +/- 0.14
Niclosamida Acidificación 5 0.54 +/- 0.13

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Apilimod Tráfico 3 1.50 +/- 0.16
Arbidol Fusión 3 0.59 +/- 0.12
Clomifeno Fusión 4 4.72 +/- 2.41
Sertralina Fusión 3 4.99 +/- 2.37
Toremifeno Fusión 3 6.71 +/- 3.09
484484
485 Tabla 1: Capacidad comparativa de los fármacos para bloquear las infecciones por LASV- y
EBOV GP-MLV
486 pseudovirus. En cada experimento (n=3-5 como se indica) las células fueron pretratadas con 8 dosis
del
487 Medicamentos indicados y sus IC50 para bloquear las infecciones por LASV y EBOV GP MLV
488 Los pseudovirus se determinaron en muestras por triplicado como se describe en los Materiales y
Métodos
489 sección. Para cada experimento, se calculó la siguiente relación: el IC50 para el bloqueo
490 Infección por el pseudovirus LASV GP dividida por el IC50 para bloquear el pseudovirus EBOV GP
491 infección. Los valores de la columna 4 son los promedios de esos coeficientes +/- SEM. Los promedios
de IC50 y
492 Los valores máximos de inhibición porcentual en todos los experimentos para el LASV fueron:
zoniporida (88 M,
49387% ), amodiaquina (1,9 M, 82%), niclosamida (0,12 M, 100%), apilimod (0,04 M, 80%),
494arbidol (1,7 M , 95%), clomifeno (5,7 M, 100%), sertralina (2,6 M, 90%), toremifeno (2,9
495M , 96%). Los valores medios del IC50 y del porcentaje máximo de inhibición en todos los experimentos
para
496EBOV fueron: zoniporida (115 M, 98%), amodiaquina (6,6 M, 97%), niclosamida (0,24 M,
497100% ), apilimod (0,03 M, 100%), arbidol (2,8 M, 100%), clomifeno (1,8 M, 100%),
498sertralina (0,7 M, 100%), toremifeno (0,5 M, 100%). Se observan proporciones muy similares a las
presentadas en
499columna 4 anterior se obtuvieron para los cocientes de los valores medios de IC50 en todos los
experimentos.
500

42
501

502FIGURAS DE LEYENDAS

503

504 FIG. 1. Curvas representativas de respuesta a la dosis de ocho fármacos de bajo peso molecular
contra

invitado
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505 Infección por pseudovirus MLV mediada por LASV GP y EBOV GP. Las células BSC-1 fueron

506 pretratados con la dosis indicada del fármaco indicado durante 1 hora y luego infectados con MLV

507 pseudovirus que codifican la luciferasa. Las señales de luciferasa se midieron 24 horas después y se
normalizaron

508 a la señal máxima de un conjunto de células tratadas por triplicado. Los puntos de datos indican la
media

509 % de inhibición a partir de pozos triplicados. Las barras de error representan la desviación estándar
(SD). El rojo

510 La línea horizontal discontinua indica una inhibición del 50%. Cada comparación de dosis-respuesta se
realizó

511 3-5 veces, con resultados similares.

512512

513 FIG. 2. Efectos comparativos del arbidol en la infección por los pseudovirus MLV que llevan
LASV

514 u otras glicoproteínas virales: (A) LASV, LCMV y Junin GP; (B) LASV GP y

515 influenza HA. Los pseudovirus MLV que llevan LASV GP, LCMV GP, Junin GP o WSN influenza

516 La HA y la NA se prepararon como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Las células

BSC-1 fueron

517 pretratados con las concentraciones indicadas de arbidol y luego procesados y analizados para

518 como se describe en la leyenda de la Fig. 1. Los datos de (A) son las medias +/- SEM de tres

519 experimentos, cada uno de ellos realizado con muestras por triplicado. Los datos de (B) representan la
media +/- SD

520 de muestras por triplicado de un experimento.

43
521521

522522

44
523 FIG. 3. Arbidol inhibe la infección auténtica por el LASV. Los pozos duplicados de células Vero76
fueron

524 pretratados con la concentración indicada de arbidol (o vehículo o 25 mM NH4Cl) durante 1 hora y

525 Luego se infectó con el virus LASV (cepa Josiah) a una MOI de 0,01. Tras un periodo de unión de 1
hora

526 a 4°C, se eliminó el virus no adsorbido y se incubaron las células durante 24 horas en presencia de

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527 en una incubadora de CO2 a 37°C. Los sobrenadantes de los cultivos se cosecharon, se diluyeron en serie
10 veces en

528 medio fresco, y luego se tituló en células Vero76 mediante un ensayo de placas de 96 horas. Los
resultados de (A-C) son los

529 Títulos medios de pozos duplicados. Los valores en (D) indican el promedio de la infección
normalizada

530 en muestras tratadas con 20 μ M d e arbidol (+/- SD) de los experimentos mostrados en (A-C). La
dirección

531 El asterisco indica **p < 0,01.

532532

533 FIG. 4. Arbidol suprime la fusión célula-célula (CCF) mediada por la GP del LASV. Las células
efectoras fueron

534 generados mediante la transfección de células HEK293T/17 con plásmidos que codifican DSP1-7 (el
N-terminal

535 plásmido de luciferasa dividido) y (A) LASV GP o (B) WSN influenza HA y NA. Objetivo

536 se generaron transfectando células HEK293T/17 con plásmidos que codifican DSP8-11 (el C-

537 plásmido de luciferasa dividido terminal) y pmLamp1. Para los experimentos, las células efectoras
fueron

538 precargados con un sustrato de luciferasa y luego pretratados durante 1 hora con la concentración
indicada

539 de arbidol o EtOH al 10% (control simulado). A continuación, las células efectoras se co-cultivaron con
las células diana

540 HEK293T/17 (en presencia continua de arbidol o EtOH al 10%) durante 3 horas a 37oC. En este

541 tiempo los cultivos se pulsaron con tampón de pH 5 durante 5 minutos a 37ºC, se renutralizaron y se
45
 volvieron a

542 a la incubadora de CO2 a 37°C durante 1 hora, momento en el que se midió la señal luminiscente. Los
datos

543 representan la señal luminiscente normalizada (en relación con los controles tratados con simulacro) de
tres

544 experimentos, cada uno de ellos realizado con muestras por triplicado. Las barras de error indican la
DE. Los asteriscos indican:

545*p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

46
546

547 FIG. 5: El arbidol inhibe la fusión forzada mediada por el LASV-GP en la membrana plasmática

548 (FFPM). Se transfectaron células COS7 con plásmidos que codificaban pmLamp1 y luciferasa de
luciérnaga

549 (FLUC). Aproximadamente 24 horas después, las células fueron pretratadas con la dosis indicada de
arbidol (o

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550 tratado de forma simulada) durante 1 hora. En este momento, los pseudovirus de VSV que llevan la GP
de LASV y codifican Renilla

551 luciferasa (RLUC) se dejaron ligar a 4oC durante 1 hora. A continuación, las células se pulsaron
durante 5 minutos a

552 37°C con tampones precalentados a (A) pH 5 o (B) el pH indicado y luego el tampón

553 se sustituyó por un medio completo que contenía NH4Cl para evitar la infección a través del

554 vía endocítica. Después de 12-18 horas a 37ºC, RLUC (un indicador de la infección vía FFPM) y
FLUC

555 (para estandarizar el número de células transfectadas). La relación entre la luciferasa Renilla y la
luciérnaga

556 (RLUC/FLUC) fue entonces (A) normalizada a la relación RLUC/FLUC para las células tratadas con
mock o (B)

557 representado directamente. Los datos proceden de un experimento representativo realizado con
quintuplicados

558 muestras. Las barras de error indican la DE. ***p < 0,001, **** p < 0,0001. Cada experimento se
repitió

559 una vez con resultados similares.

560560

561 FIG. 6. El arbidol impide la disociación de la GP1 del LASV de la GP2. (A) La GP de LASV
marcada con una bandera de

562 lisados celulares de las células HEK293T/17 KO de Lamp1 se inmovilizó en el magnético anti-Flag
(M2)

563 que luego se trataron con 0 o 40 μM de arbidol durante 1 hora a 4°C. A continuación, las perlas se

564 sometidos a un pulso durante 1 minuto a 37°C al pH indicado en presencia o ausencia de arbidol.
47
565 El grado de disociación de la GP1 se determinó entonces mediante un análisis de Western blot de la
GP1 en el

566 sobrenadante y las fracciones unidas a las cuentas. Los datos son las medias de cuatro experimentos.
Barras de error

567 representan el MEB. (B) La GP de LASV marcada con bandera, preparada e inmovilizada como en el
panel (A), fue

568 pretratadas con 0 o 40 μM de arbidol. A continuación, las perlas se expusieron a pH 6,5, a 37°C para la

48
569 tiempo indicado, en presencia o ausencia de arbidol, y el grado de disociación de GP1

570 determinado como en el panel (A). Los datos son las medias de cinco experimentos. Las barras de error
representan

571 SEM.

572572
573573

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