Técnicas Analíticas en

Estabilidad de
Medicamentos:
Estabilidad Química.

Vicente Merino Bohórquez

UGC Farmacia. HU Virgen Macarena (Sevilla)
20 de Octubre de 2017
 Un poco de Historia…
• Mijaíl Tsvet (1903):

• Botánico ruso

• El primero en usar la cromatografía en columna

• Fase estacionaria sólida INULINA en columna cilíndrica de vidrio

• Fase móvil líquida ETER DE PETRÓLEO

• Fenómenos de ADSORCIÓN Separación de clorofilas a y b

• Logró separar carotenoides y xantofilas

Ostrowski W. Michael S. Tswett--inventor of column chromatography. (On the occasion of 65th anniversary of his lecture on the column chromatography technique). Folia Biol
(Krakow). 1968;16(4):429-48.
Tipos de Cromatografía Líquida (I)

Método específico Fase estacionaria Tipo de Equilibrio

Líquido-sólido (adsorción) Sólido Adsorción

Líquido adsorbido sobre un Distribución entre líquidos

Líquido-líquido (Reparto)
sólido inmiscibles

Líquido-fase unida Especies orgánicas enlazadas a Distribución entre el líquido y la

químicamente (Reparto) superficie sólida superficie enlazada

Intercambio iónico Resina de intercambio

Intercambio iónico
(HPLC-IEC) iónico

Penetrabilidad en poros
Exclusión por tamaño Liquido en el intersticio de un
(Filtración en gel y Penetrabilidad en
(HPLC-SEC) líquido polimérico
gel)
Tipos de Cromatografía Líquida (II)
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ReversedPhase/
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/IonExchange/
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/SizeExclusion/
Cromatografía de Reparto (I)

Según la naturaleza de las fases líquidas implicadas:

Fase directa o normal:

• FM Apolar (apolar>>polar) n-hexano,etileter,CHCl3
• F Estacionaria Polar (ciano,amino,diol,…)
• Retención de sustancias Polares

Fase inversa o reversa (ampliamente

utilizada >90%)
• FM Polar (Polar>>apolar)H2O,ACN, MeOH, THF
• F Estacionaria Apolar (C18, C8, Fenilo,…)
• Retención de sustancias Apolares
Partes de un Sistema HPLC
Composición de un Sistema HPLC

Reservorio contenedor
Mantiene la
de vidrio
composición FM y la
alta presión

Inyecta un volumen de muestra

en el sistema sin perdidas de presión

Mantiene la Tª en la columna
(fase estacionaria)
Identificación y cuantificación
Diodos en serie (DAD)
Indice de Refracción
Fluorescencia
Columna HPLC-RP

• Es el “corazón” del equipo HPLC

• Material químicamente INERTE (acero inox).

• Resistentes desde punto vista físico

• Compuestas de partículas muy porosas de sílice

• Existen de diferentes optimización de la EFICACIA

• Diámetros (2-5 mm)
• Longitudes (50-250 mm)
• Tamaño poro interno (1.8-10 µm)

• Estables a pH=2-8 (algunas específicas pH extremos ZIRCONIO)

Fases Estacionarias HPLC
 Fases estacionarias de columnas HPLC-RP

• Distintas FE en función de lo que nos convenga:

C18-OCTADECILSILANO
C18-OCTADECILSILANO CIANO

AMIDA
Selección Fase Móvil (I)

• Dependerá del tipo de cromatografía (Normal vs. Reversa)

• Disolventes muy puros (grado HPLC)

• Parámetros: viscosidad, tensión de vapor, compresibilidad, absorción UV,…

• Polaridad: es el parámetro más importante DEFINE EL TIPO DE

CROMATOGRAFÍA

• Los DISOLVENTES más utilizados en fase REVERSA:

• Agua (tamponada o no)
• Acetonitrilo
• Metanol
• Tetrahidrofurano (THF)
Selección Fase Móvil (II)

• Según la composición FM:

1. Condiciones ISOCRÁTICAS: composición constante de FM

durante todo análisis. Problema general de la elución.

2. Condiciones GRADIENTE: varía la composición, se va

aumentando la fuerza eluotrópica del disolvente con el
tiempo de análisis.
Isocrático: TMD-DKTP-DROP

FM: 40%ACN:60% buffer 0.01M KH2PO4 pH=4.1

Gradiente: TMD-DKTP-DROP

FM:10% ACN60% ACN (min 06)

90% buffer40% buffer
0.01M KH2PO4 pH=4.1
Dexketoprofeno

Tramadol

Droperidol
Detectores HPLC: posibilidades
Detector Características Sensibilidad
Específico de compuestos cromóforos
UV/Vis ng
UV
Idem UV/Vis + espectros completos
UV/Vis Diodos en serie ng
3D
Específico para compuestos
Fluorescencia fg-pg
fluorescentes
Universal: polímeros, azucares,
Índice de Refracción triglicéridos, ácidos orgánicos, 0,1-10 µg
excipientes

Universal: no volátiles, semivolátiles,

Detector de dispersión de luz (DLS) ng
compatible con gradiente

Específico: compuestos
Electroquímica pg
electroactivos

Específico: aniones y cationes, ácidos

Conductividad ng
orgánicos y surfactantes

Universal y específico. Identificación

Espectrometría de masas fg-pg-ng
definitiva.
Detector UV Diodos en Serie
(UV- Diode Array Detector)
• Útil para sustancias absorción UV (cromóforos)

• Permite barrido de λ 200-400 nm (espectro UV)

• Permite análisis espectral en 2D-3D

• Detección de un gran número de fármacos

Análisis espectral: Idebenona

Cromatograma

Espectro UV 2D
Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (I)

Técnica de Técnica de Técnicas de

supresión formación derivatización
ionización pares iónicos precolumna
Supresión de la ionización

• Objetivo conseguir moléculas en forma lipófila (no ionizada).

• Aumento de la interacción con la F Estacionaria Mejora la

separación de las moléculas.

• Control de pH de la fase móvil (pH±2 pKa)

• Dependerá de si son ácidos débiles o base débiles.

• Tener en cuenta el pH de estabilidad de la columna (2-8)

Ejemplo: ibuprofeno

• AINE (Derivado arilpropiónico)

• Aplicación HPLC Determinación contenido pa

• Supresión ionización:
• Columna C18 (4.6 mm x100 mm, 3.5 µm)
• Control por buffer KH2PO4/H2PO4 pH=2.5

Forma NO IÓNICA MEJOR RETENCIÓN en FASE REVERSA

Cromatograma Ibuprofeno

FM: 45% Buffer KH2PO4 (pH=2.5)

55% Acetonitrilo
Columna C18 (4.6x100 mm, 3,5 µm)
Tª 25ºC. UV=230 nm
Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (II)

Técnica de Técnica de Tecnica de

supresión formación derivatización
ionización pares iónicos precolumna
Formación de pares iónicos

• Objetivo conseguir pH todas las moléculas estén ionizadas

• A la FM se añade un contraión complejo neutro y liposoluble

• Mejora la retención en fase apolar permite separar iones

• Para ácidos (pH>pKa) Contraión + (tetrabutilamonio)

• Para bases (pH<pKa) Contraión - (octanosulfónico)

Ejemplo: clonidina
• Agonista α2-adrenérgico HTA,Crisis HTA,Sdme. Abstinencia opiáceos,
hiperactividad, …

• Uso pediátrico en forma de jarabe (clorhidrato de clonidina)

• Base débil (pKa=8,16) pH=10,16 desmoronamiento FE

• Análisis HPLC según USP formación pares iónicos:

Complejo neutro
+ Clonidina-Octanosulfonato
(forma no ionizada)

Formas ionizadas

The United States pharmacopeia, 34nd rev., and The national formulary, 29th ed. Rockville (MD): United States Pharmacopeial Convention; 2011:2574-75.
Cromatograma de clonidina

Jarabe SIN
conservante
Clonidina
2,6-Dicloroanilina

Jarabe CON
conservante Sorbato
potásico

Clonidina 2,6-Dicloroanilina

Proyecto GT Farmacotecnia: Estabilidad fisicoquímica y microbiológica de tres formulaciones orales pediátricas

Técnicas cromatográficas en HPLC-RP (III)

Técnica de Técnica de Técnica de

supresión formación derivatización
ionización pres iónicos precolumna
 m
AU

Fuentes en estabilidad
3
000

6.494
2
500

2
000 FORMACIÓN DE HIDRAZINA
40ºC

Derivatización precolumna EN LAS DOS FORMULACIONES

1
500

1
000

5
00 F1 40ºC F1 25ºC F1 5ºC F2 40ºC F2 25ºC F2 5ºC
• Técnica
0
30 útil en análisis de compuestos que no son detectables.
1 2 3 4 5 6 7 m
in
m
AU

3
000

25
• Mediante una transformación química se hacen “visible” al detector y se pueden
2
500
CONCENTRACIÓN (µCG/ML)
2
000

cuantificar.
1
500
20
25ºC
1
000

5
00

6.511
15
• Uso de reactivos derivatizantes.
0

1 2 3 4 5 6 7 m
in

m
AU

3
000 10

• Isoniazida tiene un producto de degradación

2
5

2
0
0

0
0

0
5ºC identificado como hidrazina (carcinógeno y

mutagénico)
1
500
5

1
000

5
00 0

• Derivatización
DÍA 0 conDIA 6 DÍA 10 DÍA
benzaldehido nos14permite
DÍA 21cuantificarlo
DÍA 28 DÍA 50 DÍA 70 DIA 90

6.510
0

1 2 3 4 5 6 7 m
in
Determinación de fármacos de origen
biológico
• Estudio caracterización infliximab biosimilar

• Comparan características FQ:

• IFX BIOSIMILAR (CT-P13) vs IFX ORIGINAL (RMP)

• Ensayo de pureza:
• Cromatografía de exclusión molecular (HPLC-SEC):
• TSK G3000SWXL (Tosoh®)
• FM buffer acuoso en ISOCRÁTICO
• DETECTOR UV 214 nm.
• Cumplen las especificaciones 99.4-99.9% en MONÓMEROS (Acmab)
• Ensayo de cargas de isoformas:
• Cromatografía de intercambio catiónico
• Propac WCX 10 (Dionex®)
• FM: NaCl en GRADIENTE
• DETECTOR UV 214 nm.
Jung SK, Lee KH, Jeon JW, Lee JW, Kwon BO, Kim YJ et al. Physicochemical characterization of Remsima. Mabs. 2014; 6(5):1163-77.
Fuentes en estabilidad
Espectrofotometría UV-Visible-IR
 Espectro UV-Visible e IR:

• Puede ser útil para cuantificación de sustancias farmacéuticas.

• Principios activos suelen absorber en el espectro UV-visible.

• Son técnicas poco específicas y selectivas (ojo en estudios de estabilidad)

• Especial interés de la espectroscopia IR cercano (FTIR) para identificación

rápida de materia prima y determinación de aguas.

• Cada compuesto tiene un espectro IR único (excepto los isómeros ópticos)

Fuentes en estabilidad
Fluorimetría
• Consiste en la medición de la emisión de luz de una sustancia química cuando se expone a
la radiación UV, visible u otra radiación electromagnetica.

• λexcitación<λemision (20-30 nm)

• Más sensible que la de absorción UV

• Mucho menor ruido de fondo (blanco señal baja) vs Absorción UV-Vis.

• Determinación de impurezas aminobutanol por derivatización con fluorescamina

 CT-P13 (biosimilar)
Fuentes en estabilidad
Espectrometría de Masas
• Se generan iones que se separan m/z y registra la abundancia relativa.

• Compuesto por:
• Fuente de iones: volatiliza la sustancia a estado gaseoso.
• Analizador: clasifica los iones en función de su m/z.
• Detector: registra los iones y registra la abundancia relativa

• Útil para cuantificación e identificación definitiva de todo tipo de

moléculas ionizables:
Infliximab (comparador)
• Fármacos y sus metabolitos.
• Sustancias endógenas polares.
• Macromoléculas (péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y oligosacáridos)
Experiencia HU Virgen Macarena
Control de Calidad
Forma Farmacéutica Estudios Estabilidad FQ
(contenido pa)

Dexametasona
Cápsulas -----
Etinilestradiol

Inyecciones Vancomicina -----

intravitreas Ceftazidima

Clonidina
Fenobarbital
-----
Soluciones orales Hidralazina
Isoniazida (Hidrazina)
Etambutol (aminobutanol)
-----
Preparados tópicos Gel Timolol

Mezclas iv TMD-DKTP-DROP N-Acetilcisteína

Conclusiones HPLC

• Gran versatilidad a la hora de analizar distintos productos

farmacéuticos (fármacos clásicos, Mabs, biológicos, etc.) tan sólo:
• Cambio de columnas
• Disolventes FM
• Variedad de detectores

• Universalidad: técnica de referencia de las principales

farmacopeas del mundoUSP,BP, EP,JP, RFE,..

• Herramienta de garantía de calidad en farmacotecnia:

• Control de calidad
• Estabilidad FQ
Para más información

• www.agilent.com

• www.thermofisher.com

• www.waters.com

• www.shimadzu.com