FACULTAD DE CIENSAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

CURSO: ANALÍSIS CLÍNICO

PRODUCTO ACADÉMICO: MALARIA

INTEGRANTES:
1. Angeles Hoyos Azucena
2. Copia Perez José Marcelo
3. Cotrina Moran Daniel Fernando
4. Cueva Hernandez Abner
5. Estela Rojas Naywi Zuffely Paola
6. Lizana Campos Wilson
7. Pita Izquierdo Maricielo

CICLO:
VI

SECCIÓN:
A

Docente de la Asignatura:
DRA. WENDY CARPIO

Pimentel – Perú
2021
 INTRODUCCIÓN
La malaria es una enfermedad parasitaria que tiene una distribución amplia en
las regiones tropicales y constituye uno de los principales problemas de Salud
Pública en el mundo debido a su alta morbilidad, mortalidad e impacto
socioeconómico, ya que por siglos ha representado una amenaza para la salud
del hombre y la economía de los países endémicos en vía de desarrollo.

Es causada por un protozoario perteneciente al género Plasmodium, siendo

cuatro las especies que pueden parasitar al hombre: Plasmodium vivax,
Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale; además,
La malaria es transmitida a través de la picadura del mosquito hembra del
género Anopheles infectado, mientras que su ciclo de vida del parásito es muy
complejo e involucra una fase de multiplicación sexuada en el vector
(hospedador definitivo) y otra asexuada en el humano (hospedador
intermediario).

En el año 2019, se estimaron 229 millones los casos de paludismo en todo el

mundo, mientras que el número estimado de defunciones por paludismo fue de
409 000 en 2019 y siendo los niños menores de 5 años el grupo más
vulnerable afectado; en 2019, representaban el 67% (274 000) de todas las
muertes por paludismo en el mundo entero.

La malaria es una enfermedad parasitaria y endémica en el Perú,

especialmente en la selva, costa norte, centro y sur, además, más del 90% de
los casos son producidos por Plasmodium vivax. En Loreto (selva peruana), en
los últimos años, se registra un importante aumento de casos, inclusive se
tienen brotes epidémicos de malaria por Plasmodium falciparum en algunas
zonas. También en la costa centro, en los últimos dos decenios, ha habido un
incremento importante de casos, habiéndose incluso presentado en la ciudad
de Chiclayo (costa norte), casos de malaria por Plasmodium vivax, como
consecuencia de transfusiones sanguíneas (no se encontró otro antecedente
epidemiológico).

En el diagnóstico de la malaria, la detección precoz a través de la observación

directa de los parásitos maláricos en muestras sanguíneas coloreadas con
Giemsa, es fundamental para tomar medidas rápidas y eficaces que conlleven
a la reducción de la morbilidad y mortalidad por la enfermedad, sobre todo en
las áreas endémicas; ya que, El diagnóstico de la malaria se fundamenta en los
antecedentes epidemiológicos y cuadro clínico que presenta el paciente, pero
debe ser confirmada la presencia de parásitos en la muestra sanguínea, a
través del laboratorio.

MALARIA O PALUDISMO

• Esporozoarios del Género Plasmodium transmitidos por picadura

de Anopheles.
• Clínica: escalofrío, fiebre, sudoración
• Hospedero definitivo: Anopheles (reproducción sexual)
• Hospedero intermediario: el hombre (reproducción asexual)
• Forma infectante: esporozoito inoculado con saliva del mosquito
• Puerta de entrada: piel
• Transmisión: picadura del mosquito
o No vectorial: transfusión sanguínea, transplacentaria,
agujas hipodérmicas.

• BIOLOGÍA:
o EL PARÁSITO: 4 especies cuyo hospedero es el hombre:
P. Vivax P. Malariae P. falciparum P. ovale
Morfología del GR Modificada: No modifica tamaño del No modifica tamaño del

Granulaciones G. Schuffner G. de Ziemann G. de Maurer

Invaden GR. Jóvenes GR viejos GR todas las edades
12 8 : aspecto de ROSETA Y 16
MARGARITA(en forma
radiada y en la parte
central hay pigmento
N° merozoitos
malárico)
Periodo de fase 48 horas 72 horas 48 horas
eritrocítica y
rompimiento de
esquizontes
 Redondeados y Redondeados y ocupan Forma de medialuna o
ocupan todo el GR todo el GR de plátano
Gametocitos

• Reproducción sexual o ciclo esporogónico: 7-14 días,

inicia con la ingesta de sangre de una persona infectada
que contenga los gametocitos.
-Gametocitos: intraeritrocitarios
-cigoto: fusión de cromatinas de microgameto+ macrogameto
-ooquineto: cigoto se mueve hacia pared del
estómago del mosquito y luego se enquista,
formando un ooquiste
-ooquiste: 50 um
-esporozoito: elementos alargados 10-12 um producto
de la división del citoplasma y núcleo del ooquineto (se
rompe cuando abundan esporozoitos). Cuando salen del
ooquiste, se trasladan hasta las glándulas salivales del
mosquito.
• Reproducción asexual o ciclo esquizogónico: 2 fases
-Fase hepática o exoeritrocitaria: esquizonte tisular y criptozoito
o Esquizonte tisular: formado por fisión binaria del
esporozoito al penetrar el hepatocito.-Fase
eritrocitaria: trofozoito, esquizonte, merozoitos y
gametocito

o Trofozoito : primer estadío eritrocitario, núcleo rojo-

violáceo. Existe un trofozoito joven y adulto. El joven tiene
forma anular, y el adulto, forma ameboide.
o Esquizonte: cromatina abultada o globosa (esquizonte joven),
luego se divide en merozoitos y se rodea de citop (esquizonte
maduro).
o Merozoito: formado por la ruptura del esquizontes (ruptura
de GR parasitados, liberación de pigmento malárico.
Parasitan nuevos eritrocitos, dan lugar a trofozoitos.
o Gametocitos: microgametocito (masculino) + macrogametocito
(femenino). Se diferencian porque en el femenino la cromatina
es densa y en masculino es laxa.
Son ingeridos por los mosquitos en el momento de la
succión de sangre. Sobreviven en el GR por 120 días.
FISIOPATOLOGÍA DE MALARIA

Por dos componentes:

Mecánico:

• Lisis masiva de eritrocitos responsable de la formación de microtrombos en la

microcirculación sanguínea.

• Formación de “rosetas” de hematíes sanos alredor del hematíe parasitado.

• Citoadherencia de formas maduras del protozoo (que reciben el nombre de

“knobs”) a nivel del endotelio microvascular que interfieren en la oxigenación
celular, desencadenando el metabolismo anaerobio (glicolisis) y elevación del
lactato. Este efecto es más importante a nivel del SNC, pero también puede
afectar a otros órganos vitales como corazón, riñón, o intestino y tejidos
subcutáneos. (Dichas formas son responsables de la elevación de la
parasitemia hasta 48h posteriores al inicio del tratamiento debido a que son
desplazados desde la periferia hasta el torrente sanguíneo)

Inflamatorios:

• La lisis celular y los productos de degradación del parásito provocan

liberación de citoquinas de elevada toxicidad (TNF alfa) factor de necrosis
tumoral.

GOTA GRUESA:
Es una técnica de rutina y consiste en una muestra de una gota de sangre
conformada por numerosas capas en su mayoría de glóbulos rojos, los que son
deshemoglobinizados durante la coloración con Giemsa. Esta concentración de
glóbulos rojos facilita la detección de los parásitos que pudieran estar
presentes en su interior en densidades bajas.
INTERPRETACIÓN DE LA DENSIDAD PARASITARIA EN UN EXAMEN DE
GOTA GRUESA:
La determinación de la densidad parasitaria de los Plasmodios se efectuará a
través del método de conteo por cruces; y el cálculo de parásitos por microlitro
de sangre.

Método Semicuantitativo (Conteo por Cruces):

La lectura de las láminas se efectúa con el objetivo de inmersión del
microscopio y los resultados de la densidad parasitaria se determinan luego de
examinar 100 campos, debiendo informarse de la siguiente forma:

Nº de parásitos: Todo número inferior a 40 parásitos en 100 campos deberá

informarse
con el número de parásitos encontrados en la lectura:

 +/2: De 40 a 60 parásitos en 100 campos

 +:1 parásito por campo en 100 campos
 ++: De 2 a 20 parásitos por campo en 100 campos
 +++: De 21 a 200 parásitos por campo en 100 campos
 ++++: Más de 200 parásitos por campo en 100 campos

Método cuantitativo (Conteo de parásitos por microlitro de sangre):

Este método es empleado para el reporte de la carga parasitaria de los

pacientes con malaria por Plasmodium falciparum.
El número de parásitos por microlitro de sangre se mide comparando el número
de parásitos asexuados con el número de leucocitos en la gota gruesa en base
a un recuento medio estimado en cerca de 6000 leucocitos por microlitro de
sangre.
N° de parásitos x 6000 = Parásitos /µL
N° de leucocitos
Donde:
N° de parásitos = Número de parásitos contados.
N° de leucocitos = Número de leucocitos contados.
µL= microlitro

Esta fórmula se debe aplicar según se presente el caso:

a. Si después de contar 200 leucocitos, 10 o más parásitos han sido
identificados y contados, anotar los resultados en los formatos de
registro en términos de número de parásitos por 200 leucocitos.
b. Si después de contar 200 leucocitos, menos de 10 parásitos han sido
identificados y contados, continuar el recuento de leucocitos hasta Ilegar
a 500 leucocitos, para luego anotar los resultados en los formatos de
registro en términos de número de parásitos por 500 leucocitos.

c. En caso de parasitemia alta, realizar el recuento en función del número

de parásitos, registrando su recuento hasta 500 y reemplazar su valor en
la fórmula con la cantidad de leucocitos encontrados.

Para dar por negativo una lámina, se debe revisar mínimamente 500 campos
microscópicos.

MEDIDAS DE PROTECCIÓN:

 Lavarse las manos cada vez que sea necesario.

 Los objetos afilados y punzantes deben manejarse con sumo cuidado.
 Desinfectar, esterilizar o descartar adecuadamente los instrumentos
después de usarlos.
 Usar guantes cada vez que maneje sangre o productos de sangre así
como mascarilla, bata de protección, anteojos de protección, según los
requerimientos de cada procedimiento.
 Cubrir cualquier corte o abrasión de las manos con adhesivos.
 Cuidar de punzarse con cualquier instrumento agudo que haya estado
en contacto con sangre.
 Nunca utilizar lancetas o agujas más de una vez.
 Cualquier material contaminado con sangre, deber· ser colocado en un
envase con cloro o hipoclorito de sodio al 1%, y luego para mayor
seguridad disponer su entierro o incineración.
Para la toma de la muestra de sangre, para el análisis del examen de la
gota gruesa, se debe contar con los siguientes materiales:

 Alcohol isopropílico

 Lanceta

 Lamina porta objeto

 Algodón

Coloración de la muestra Hemática:

Para la preparación de la coloración de la muestra se necesitan los siguientes

materiales y reactivos.

 Colorante Giemsa
 Alcohol metílico (metanol)
 Agua
 Inyectadora
 Vaso precipitado
 Gotero

CONDICIONES GENERALES PARA LA OBTENCION Y MANEJO DE

MUESTRAS:

 Elegir el lugar correcto a partir del cual se obtendrá la muestra

empleando la técnica apropiada. Esta debe obtenerse del pulpejo del
dedo de la mano, de preferencia los dedos medio o anular por ser los
menos usados.
 Obtener una muestra adecuada para asegurar la calidad técnica.
 La muestra debe ser obtenida de preferencia antes de que el paciente
haya recibido tratamiento antimalárico.
 Enviar las muestras de gota gruesa al establecimiento de salud más
cercano para obtener el diagnóstico.
  Si fuera una muestra de suero mantenerla a 4° C si se procesará
inmediatamente, o a -20° C si el proceso se va a ejecutar después de un
tiempo.
 En el caso de sangre para cultivo, estas se enviarán inmediatamente
dentro de las 24 horas y a temperatura de refrigeración (2° C – 8° C). En
caso contrario, se debe criopreservar y guardar a -70 ° C o nitrógeno
líquido.
 Las muestras deben ser colocadas para su envío en un recipiente
apropiado para su transporte al laboratorio con la finalidad de evitar
cualquier derrame o rotura.

4. Desarrollo de prueba inmunocromatográfica

Las pruebas de diagnóstico rápido para malaria (RDT) son

inmunocromatografías que, utilizando diferentes tipos de dispositivos, detectan
antígenos producidos por el parásito que se encuentran en la sangre de las
personas infectadas. La presencia de estos antígenos se manifiesta mediante
un cambio de color en el soporte de nitrocelulosa en el que se desarrolla la
prueba y sobre el que se ha dispuesto la muestra. Pueden presentarse en
distintos formatos, como en cartucho o en tarjeta.

La sensibilidad de estas pruebas depende de numerosos factores, tales como

la especie de Plasmodium, la parasitemia, el antígeno que detectan, el estado
de la RDT, la ejecución de la técnica, la correcta interpretación, la viabilidad de
los parásitos o la variación en la estructura y expresión del antígeno12.
Generalmente no se usan como única técnica diagnóstica, sino que se usa
como prueba inicial de cribado, ya que el número de falsos negativos es muy
elevado, sobre todo cuando se trata de una infección por Plasmodium no
falciparum10y cuando la parasitemia es muy baja (menor de 0,1%). No
sustituyen al frotis y la gota gruesa puesto que no son pruebas cuantitativas y
no estiman el grado de parasitemia, muy relacionado con la gravedad y con
importante valor pronóstico1.

Esta relación entre la cantidad de plasmodios en sangre y gravedad varía en

función de las poblaciones y los grupos de edad, pero generalmente cuanto
mayor es la parasitemia, mayor es la gravedad. Al no cuantificar los parásitos,
se dificulta la adopción de medidas terapéuticas oportunas y se impide la
monitorización del tratamiento y la aparición de resistencias. Por ello, las
decisiones terapéuticas no deben basarse únicamente en los resultados de las
pruebas de diagnóstico rápido y es necesario confirmar siempre el diagnóstico
con microscopía

Fundamentos de la técnica

El fundamento de la técnica se basa en la detección de antígenos palúdicos

mediante inmunocromatográfica en una tira de nitrocelulosa que contiene
bandas de anticuerpos Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de
Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo
monoclonales específicas, apareciendo coloración en dichas bandas si el
resultado de la prueba es positivo.

Estas tiras de nitrocelulosa se encuentran introducidas en una carcasa de

plástico con distintos compartimentos, uno para añadir una gota de sangre, otro
para añadir el tampón, que se encarga de arrastrar la sangre a lo largo de la
tira de nitrocelulosa y, por último, uno para leer los resultados de la prueba,
mediante la aparición o no de líneas coloreadas. Figura 1: RDT cassette. How
malaria RDTs work. World Health Organization WHO. 2018 en un extremo de la
tira de nitrocelulosa, o bien en un pocillo, se sitúan anticuerpos libres
específicos para el antígeno que se quiere detectar marcados con un colorante.
Continuando a lo largo de la tira se encuentra la siguiente banda, que es la
banda de prueba ya que contiene anticuerpos específicos para el antígeno,
pero en este caso fijados a la tira. La última banda va a servir como control ya
que en ella hay anticuerpos bien contra el anticuerpo marcado, o bien contra el
antígeno. Siempre tiene que aparecer la línea de control para que el resultado
sea válido, aunque esto no significa que el resultado sea preciso.

Para comenzar el test se añade sangre y los reactivos necesarios, incluidos en

el kit, en los compartimentos correspondientes, de modo que, al entrar en
contacto con la tira, se mezclan con los anticuerpos marcados libres y van a ir
avanzando atravesando las bandas con los anticuerpos fijados. Si el antígeno
está presente, se unirá al anticuerpo marcado libre y, al llegar a la banda de
control donde hay un anticuerpo contra el antígeno, se unirá también a este,
formándose un complejo entre el antígeno y los dos anticuerpos (fijo y libre-
marcado), por lo que parte del anticuerpo marcado libre va a quedar atrapado
en la banda de prueba. Otra parte del anticuerpo marcado va a quedar
atrapado en la banda de control, ya que contiene anticuerpos contra el
anticuerpo marcado o contra el antígeno.

5. Desarrollo otros métodos diagnósticos (equipos, materiales, personal,

lugar, reactivos)

El poder realizar un diagnóstico confiable y temprano del paludismo es indispensable

para el correcto manejo clínico del paciente y la administración de un tratamiento eficaz
y oportuno, siendo la técnica de rutina disponible para el diagnóstico del Paludismo o
Malaria es el examen microscópico de la gota gruesa y el extendido hemático bajo
estándares de aseguramiento de la calidad del diagnóstico.

Pero, existen otras técnicas de diagnóstico como las pruebas de diagnóstico rápido,
capaces de otorgar un resultado al poco tiempo de haberse realizado la toma de muestra,
las técnicas inmunológicas y de biología molecular, pero estas no son utilizadas de
forma rutinaria ni se encuentran disponibles en todos los laboratorios.

1.1. Los Métodos de Diagnóstico Inmunológico de Malaria:

El Diagnostico Inmunológico de la Malaria o Paludismo abarca métodos que evalúan la

Inmunidad Humoral y Celular del huésped. Estos métodos diagnósticos son
suficientemente sensibles y específicas para detectar las infecciones cuya parasitemia es
baja, también diferenciar las infecciones pasadas de la actual, la primoinfección de las
recrudescencias y las reinfecciones.

Para el diagnóstico de la Malaria existen métodos inmunológicos como es el

radioinmunoensayo, la inmunofluorescencia, la hemaglutinación y la prueba de ELISA
o Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas; pero se debe tomar en cuenta que
estas pruebas no reemplazan a la microscopía y no son utilizadas de forma rutinaria,
pero son utilizadas principalmente para estudios epidemiológicos de Investigación.

Existen Métodos de Diagnóstico Inmunológico Directo e Indirecto:

A. Los Métodos de Diagnóstico Inmunológico Directo:

Detectan directamente la presencia del parasito mediante la captura de antígenos del

parasito durante la infección, estas fracciones antigénicas representan fracciones
específicas de la molécula antigénica; entre las principales pruebas que tienen estos
fundamentos podemos mencionas las pruebas diagnósticas inmunocromatograficas y las
pruebas diagnósticas de ELISA directo.

B. Los Métodos de Diagnóstico Indirecto:

Detectan principalmente a los anticuerpos, también inmunoglobulinas, que se producen

en respuesta al estímulo antigénico durante la infección del Plasmodium y su desarrollo
biológico en el huésped vertebrado, es debido a esta respuesta inmune que hace posible
el Inmunodiagnostico. Los principales métodos serológicos que se basan en este
fundamento son la inmunofluorescencia, la prueba de ELISA indirecta, el
radioinmunoensayo (ria) y la fitohemaglutinación indirecta

 La Prueba de ELISA o enzimoinmunoensayo y La Radioinmunoensayo

(RIA), pueden detectar muy bajas cantidades de células parasitadas y se
emplean para estudios de campo tanto epidemiológicos como de ensayo de
vacunas.
 La Prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI), Es el ensayo que se
utilizó originalmente para detectar anticuerpos contra plasmodios y se considera
como de referencia en el serodiagnóstico y la seroepidemiología de la malaria.
Además, Se ha establecido una guía para el uso de este método como
herramienta de diagnóstico:
a) Para un paciente febril con sospecha de malaria y repetidas examinaciones
microscópicas negativas.
b) En muestras de un dador de transfusión sanguínea que precedió a malaria en
el receptor
c) En caso de que los ensayos van a ser utilizados para investigación o
estandarización de sueros controles para protocolos de IFI.

Esta prueba sirve para detectar anticuerpos en los sueros, determinar los Títulos
de estos y seguir el curso de su producción, además, los antígenos se obtienen de
cultivos continuos o sangre de personas que tienen una Infección Primaria
Activa y estos son fijados en láminas portaobjetos sobre las que se agrega el
suero del paciente que contienen anticuerpos contra el agente etiológico
(Anticuerpo Primario) y que se unirán al antígeno, esta unión se podrá visualizar
mediante un microscopio de Fluorescencia utilizando una antinmunoglobulina
humana marcada con fluoresceína (Anticuerpo Secundario).

Esta Prueba es Útil en Zonas Endémicas de Malaria para medir el grado de

Endemicidad, para verificar la presencia o ausencia de infecciones Maláricas,
para delimitar Zonas Malaricas, para detectar cambios estacionales de
Transmisión y evaluar actividades Antimaláricas, incluso, en Zonas Endémicas
de Malaria puede ser utilizada para seleccionar donantes de sangre.

Los Requisitos para poder Realizar una Prueba de Inmunofluorescencia

indirecta (IFI) Optima:

 Tener una Fuente de Antígeno (Proporción de Esquizonte)

 La Preparación y Conservación de Antigenos en Láminas.
 Un Diluyente de los Sueros.
 La Calidad del Microscopio y Fuente de Iluminación Ultravioleta.

Las Ventajas y Desventajas de la Prueba de Inmunofluorescencia indirecta

(IFI):

 El Antígeno Obtenido en Cultivos es de superior calidad al obtenido en

Huéspedes Infectados.
 La Probabilidad de tener reacciones cruzadas es menor al de otros
Ensayos como el ELISA.
  Su Sensibilidad es de 80% y su Especificad es de 99%.
 El de Cohorte es de 1/16.
 Las Láminas de Inmunofluorescencia que contienen la suspensión
antigénica se pueden preservar con un agente desecador y por tiempos
prolongados a temperatura ambiente, sin pérdida de la actividad
inmunológica.
 Una Limitación para la ejecución del ensayo es la disponibilidad de
equipos especializados como microscopios de epifluorescencia,
incubadora de CO2 para cultivo de Cepas de Plasmodium Falciparum
con objeto de producción de antígeno parasitario para preparación de
láminas.

Materiales Utilizados en la Prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI):

 Frascos de vidrio de 1 L de capacidad.

 Laminas portaobjetos para Inmunofluorescencia indirecta, de12
excavaciones.
 Laminillas cubreobjetos.
 Micropipetas graduadas de: de 1 - 10 µL; de 10 - 100 µL; de 100 - 1000
µL.
 Micropipeta multicanal, de 8 canales: de 10 - 100 µL; de 100 - 1000 µL.
 Tips.
 Microplacas de 96 hoyos.
 Pizetas.
 Papel aluminio.
 Bombillas de jebe.
 Bandejas Coplin.

Reactivos Utilizados en la Prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI):

- Los Antígeno Utilizados:

De Plasmodium vivax / Plasmodium falciparum y Plasmodium malariae que son

obtenidos a partir de sangre de individuos con infección primaria reciente (de
preferencia) o a partir de cultivos continuos in vitro.

- Los Sueros utilizados:

  El Suero problema.
 El Suero control positivo y negativo.
 Los Conjugados fluorescentes Utilizados:
 Los Conjugados fluorescentes son La Anti IgG, La anti IgM, La anti Ig
totales y los marcados con isotiocianato de fluoresceína.
- Las Soluciones Utilizadas:
 Solución salina amortiguadora (PBS).
 Cloruro de sodio (NaCI) de 8,500 g
 Fosfato di sódico (NaHP04) de 1,280 g
 Fosfato mono sódico hidratado (NaH2P04 2H20) de 0,156 g
 Agua destilada de 1000 mL.

Los Equipos Utilizados en Prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI):

 Una Estufa de 37°C.

 Una Refrigeradora.
 Una Balanza.
 Un Potenciómetro o cinta para medir el pH de soluciones.
 Una Bandeja para cámara húmeda.
 Un Agitador manual o eléctrico.
 Un Microscopio de inmunofluorescencia.
 Un Reloj.
1.2. Las Técnicas de amplificación del ácido nucleico para Diagnostico
de Malaria:

Las técnicas de amplificación del ácido nucleico, los cuales son varios órdenes de
magnitud más sensibles que la microscopía y los Test de Diagnóstico Rápido, además,
se utilizan cada vez más en estudios epidemiológicos, investigaciones del origen de
infecciones y estudios específicos como el análisis de parasitemia en ensayos
controlados de infección de malaria en humanos, ensayos de eficacia de medicamentos
e investigación de resistencia a fármacos; También se están utilizando para evaluar
nuevas estrategias e intervenciones para reducir la transmisión, tales como la
administración masiva de medicamentos, la detección y tratamiento masivos, y la
detección y tratamiento focales.

1.3. Las Técnicas Moleculares para el Diagnostico de Malaria.

La Prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):

La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una amplificación enzimática específica de

ADN realizada in vitro, es decir, donde un segmento particular de ADN es copiado y
específicamente amplificado, por lo tanto, es una forma simple y muy rápida de
multiplicar el ADN presente en diferentes muestras biológicas, obteniéndose millones
de copias de una determinada secuencia de ADN.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se basa en la repetición de un ciclo

formado por tres etapas:

A. Primera Etapa: Desnaturalización del ADN doble cadena.

En la primera etapa de Desnaturalización: La doble hélice de ADN se separa en dos

hebras, para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas, entre 93 a
97ºC y la renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

B. Segunda Etapa: Hibridación de los cebadores a la zona 3´específica de cada

una de las hebras.

Mientras que en el segundo paso de hibridación: Los cebadores se unen a las zonas 3´
complementarias que flanquean el fragmento que se quiere amplificar y se realiza
gracias a la bajada de la temperatura de 50 a 65ºC.

C. Tercera Etapa: Extensión

del cebador por actuación de la
DNA polimerasa

En la tercera etapa de elongación: Se

produce la síntesis de una cadena simple
(produciéndose un fragmento de doble
cadena por la complementariedad)
en la dirección 5´- 3´ mediante la enzima
DNA polimerasa, la cual incorpora los
deoxiribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
presentes en el medio siguiendo la cadena
molde.
Componentes de la Prueba de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR):

a) Muestra de ADN:

Existen una serie de condiciones para que el ADN molde no sea un problema en la
reacción:

 La Integridad del ADN, El cual no puede estar fragmentado en trozos más

pequeños de lo que queremos amplificar.
 El Origen de la muestra y proceso de extracción, Siendo que la muestra no debe
contener inhibidores de la actividad de la polimerasa.
 La Cantidad de la muestra, Siendo que el mínimo oscila entre 10 a 100 ng y el
máximo entre 400 a 500 ng.
b) El ADN Polimerasa:

Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa, que es una enzima

termoestable que carece de actividad 3´-> 5´ exonucleasa y es por ello que hay que
intentar conseguir las mejores condiciones para que la fidelidad aumente tales como:
  No usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al
número de estos, normalmente el número de ciclos utilizado es de 25 a 30.
 Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.

c) Los Dexoribonucleótidos trifosfato (dNTPs):

Son cuatro, tenemos La dATP, El dGTP, El dCTP y La dTTP. Se deben añadir en la

solución de la reacción en concentraciones iguales que normalmente oscila entre los 20
y los 200 μM. Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las concentraciones de
ambos componentes deben guardar siempre la misma relación y no debemos variar
ninguno de ellos de manera independiente.

d) Los Buffer de la Reacción:

Los Buffer de la reacción Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a
temperatura ambiente), 50 mM ClK, y 1.5 mM MgCl2.

e) Las Sales:

Es de gran importancia la concentración de dos cationes que son añadidos en forma de

sales.

 El Cloruro potásico (KCl): Este Influye en la desnaturalización del ADN.

Elevadas concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de
secuencias cortas de ADN. Bajas concentraciones de K+ ayudan a la
desnaturalización de secuencias largas de ADN.
 El Cloruro de magnesio (MgCl2): Este Aumenta la temperatura de hibridación
del DNA. La concentración de este ion resulta fundamental para la optimización
de la reacción. Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la
PCR. Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción.

f) Las Temperaturas y Tiempo de Ciclos:

La PCR se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número
determinado de veces, además, el tiempo, la temperatura y el número de ciclos son
factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificándolos se
puede optimizar la reacción.

g) Número de ciclos

Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el
resto de factores han sido optimizados y es importante no realizar un número alto de
ciclos ya que puede dar lugar a la amplificación de productos no deseados originados
por hibridaciones no específicas.

Variaciones de la Prueba de Reacción en Cadena de Polimerasa:

 La Prueba de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) anidada:

Es una técnica muy sensible de

PCR en la que el producto de una
amplificación es utilizado como
molde para realizar una segunda
amplificación con cebadores que se
ubican dentro de la primera
secuencia amplificada, es decir,
cuando tenemos el primer amplicón
se pueden unir los cebadores y se
hace de nuevo una amplificación
dentro del amplicón inicial. Este
tipo de PCR tiene la ventaja de
brindar alta sensibilidad y
especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón
obtenido previamente, los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de la
molécula y el resultado será una única banda. Así, se evitan
posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores.

 La Prueba de Reacción en Cadena de Polimerasa

(PCR) Múltiple:
Es una PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se
combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los
reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente
varios segmentos de ADN. Tiene como ventajas información sobre varios locus en una
sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos,
rápida construcción de bases de datos. Entre sus desventajas está que para llevarla a
cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimización del
proceso.

 La Prueba de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) en tiempo real o

La Prueba de Reacción en Cadena de Polimerasa cuantitativa (qPCR):

En la PCR en tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de

manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior.
Además, mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación
la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia
producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado y esto permite
conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.

CASO CLÍNICO

Paciente masculino de 26 años de edad, procedente de

Jaén, con antecedentes de viaje a Alto amazonas, Loreto,
refiere que desde hace 5 días presento cuadro clínico de
alza térmica no cuantificada asociado a vómitos en número de 4 a 6 por día y diarrea a
similares repeticiones.

Relata que hace 3 días comenzó un cuadro de escalofríos asociado a sudoración profusa,
mialgia y astenia, por lo que acude al Servicio de Urgencias.

EXAMEN FÍSICO:

A la toma de signos vitales se vio lo siguiente:

PA: 85/50 mmHg FC: 128 lpm FR: 30 rpm T: 37.9°C

Peso: 70 Kg Talla: 171 cm IMC: 23.9

 No tiene comorbilidades asociadas

 Moderado Estado General, Moderado Estado de Hidratación, Moderado Estado
Nutrición.
 Paciente en Exploración Física presento Palidez generalizada, a la percusión del
abdomen se evaluó el hígado 7 cm por debajo del reborde costa derecho, bazo
no palpable, resto del examen físico sin alteraciones.

EXÁMENES DE LABORATORIO:

A) Biometría Hemática o Hemograma Completo:

Leucocitos 3600/mm3
Neutrófilos 88%
linfocitos 12.5%
Hb 15.2 g/ml
Hto 44.6 %
VCM 80 fl
HCM 27 pg

B) Uro análisis:

Densidad 1030
Aspecto Turbio
PH 6.2
Albumina 72 mg/24h

EXÁMENES DE IMÁGENES:
  Radiografía de tórax: Dentro de límites normales
 Ecografía abdominal total: Dentro de límites normales

Prueba de Gota gruesa:

 Positivo para Plasmodium Falciparum: 31.300 parásitos/ul

DESARROLLO DE CASO CLÍNICO.

DATOS BÁSICOS:

- Nombre: G.A.A

- Edad: 26 a

- Sexo: Masculino.

- Procedencia: Jaén.

- Tiempo de la enfermedad: 5 dias.

- Ocupación: -

- Factor desencadenante de la enfermedad:

El Paciente Varón de 26 años de edad presenta antecedentes de viaje a Alto amazonas

en Loreto, se debe tomar en cuenta que la malaria y otras arbovirosis en el Perú son
endémicas en algunas zonas de costa norte y la selva, siendo tres zonas definidas de
transmisión, la región costa norte, la región selva amazónica y la región selva central;
Por lo tanto, el Cuadro Clínico que presenta el Paciente es causado por la picadura de
mosquitos anofeles infectados con protozoarios del genero plasmodium.

ANTECEDENTES PERSONALES:

- PERSONALES

Paciente presenta Antecedente Personal General relacionado con viaje a Alto amazonas
en Loreto.

- FAMILIARES

Los Familiares no refieren enfermedades.

 - COMORBILIDADES:

Paciente no refiere comorbilidades asociadas.

ENFERMEDAD ACTUAL

- Motivo de consulta:

El Paciente acudió a emergencia debido a que hace que hace 3 días comenzó un cuadro
clínico caracterizado por escalofríos asociado a sudoración profusa, mialgia y astenia

- Tiempo de enfermedad: 5 días.

- Síntoma (s) principal (es):

Escalofríos, Mialgia, Astenia, vómitos, diarreas.

- Forma de inicio: Insidioso.

- Curso: Progresivo

- Tipo de anamnesis: Directa.

1. Enumerar lista de problemas

- Motivo de consulta: Fiebre, diarrea, vómitos, mialgia.
- Tiempo de enfermedad: 5 días
- Forma de inicio: Insidioso
- Curso: Progresivo
- Signos y síntomas:

SÍNTOMAS SIGNOS
1. Vómitos (4-6 veces x día) 5. Diarrea (4-6 veces x día)
2. Escalofríos 6. Diaforesis profusa
3. Mialgia 7. PA: 85/50 mmHg (Hipotensión)
4. Astenia 8. FC: 128 lpm (Taquicardia)
9. FR: 30 rpm (Taquipnea)
10. T: 37.9°C (Febrícula)
11. MEG
12. MEN
13. MEH
14. Palidez generalizada
 15. Hepatomegalia
16. Leucocitos: 3600 (Disminuido)
17. Neutrófilos: 88% (Aumentado)
18. Linfocitos: 12.5% (Disminuido)
Uro análisis:
19. Densidad: 1030 (Aumentado)
20. Aspecto: turbio ++
21. Albumina: 72 mg/dl (Aumentado)

2. Relación de problemas: Diagnostico sindrómico

 Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. (8,9,10,16)
 Diarrea aguda. (5)
 Deshidratación. (1,5,13,19,20,21)
 Hipotenso. (7)

3. Diagnostico presuntivo

Malaria por Plasmodium Falciparum no complicada, ya que, esta infección tiene

un patrón febril similar a otras enfermedades bacterianas, virales o parasitarias.
Entre las manifestaciones clínicas podemos estar ante un paciente con cefalea
asociado con tos, vómitos, dolor abdominal, algunos casos es común encontrar
esplenomegalia, anemia o trombocitopenia.

4. Plan de Trabajo Diagnostico:

El diagnóstico de la malaria se basa en la demostración de la forma asexuada

del parásito en el frotis de sangre periférica.

 Frotis de sangre periférica con tinción Giemsa:

- Gota gruesa: Extensión de gota gruesa con el contaje de al menos
100-1.000 glóbulos rojos. Se expresa en % en función de los
eritrocitos parasitados. Es útil como diagnóstico etiológico (pero no
de especie) y seguimiento de la respuesta terapéutica.
- Extensión fina: Extensión de sangre bemolizada al realizar el frotis
contra el porta, es por esto que el contaje debe realizarse en función
de los leucocitos que se objetiven en la muestra, que debe ser de al
 menos 100 leucocitos. Forma característica de los trofozoítos suele
ser de "media luna". Obtendremos el diagnóstico de la especie
productora de la enfermedad. Se expresa en parásitos/microlitros.
 Técnicas inmunocromatográficas (test Parasight, ICT, Optimal) que
detectan antígenos del parásito en sangre, con alta sensibilidad para el
P. falciparum y P vivax. Se pueden realizar en la urgencia. No detectan
el grado de parasitación.
 Prueba de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR): (detección
genómica del parásito en sangre), es una técnica sofisticada que detecta
parasitemias pequeñas que se escapan a la gota gruesa, es de Alta
sensibilidad y especificidad y solo en centros especializados; además,
es Útil en caso de parasitemias mixtas y por P. ovale y P. malariae.
 Serología: detección de anticuerpos IgM o IgG con poca utilidad en la
malaria aguda ya que pueden permanecer elevados tras una crisis
malárica durante meses o años. Actualmente se utiliza muy poco.
5. Plan terapéutico

Están indicados esquemas terapéuticos por vía oral, sobre la base de

Cloroquina - Primaquina para el tratamiento de la malaria por P. vivax y P.
malariae.

En caso de fracaso clínico (reaparición de parasitemia entre los días 7 y 28

días luego de habérsele administrado tratamiento completo y supervisado), se
debe usar:

Artesunato + Mefloquina + Primaquina

Para el tratamiento de la malaria por P. falciparum No Complicada, se usará un

solo esquema a nivel nacional.

 Mefloquina + Artesunato + Primaquina 0.75mg/Kg (45mg Primer día)

 Y el tratamiento de Segunda Línea será: Quinina + Clindamicina +
Primaquina. (Clindamicina desde el primer día)