ARTICULO7

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Figura 1 Microscopía electrónica de cepas EHEC O157:H7. (A) EDL933 cultivado en LB a 37°C no
muestra ningún pili; (B) EDL933 y (C) 85-170 muestran pili fino largo (flechas) que sobresalen de
las bacterias después del crecimiento en agar Minca a 37°C. Las cepas fueron teñidas
negativamente y observadas por TEM. Aumento original, 20.000.

Figura 2 Purificación, análisis bioquímico y reactividad de la HCP con sueros de pacientes con HUS.
(A) Micrografía de TEM que muestra haces de pili largo purificados de EDL933. (B)
Despolimerización de pili purificado en geles SDS-PAGE al 16% (MS, normas de masa). La proteína
19-kDa corresponde a la subunidad estructural tipo IV HcpA pilin. Los pili purificados reaccionaron
con anticuerpos anti-PpdDK-12 de conejo, un grupo de sueros humanos de casos de HUS y sueros
humanos normales (NH). Nótese la reactividad de la subunidad de pilin con los sueros HUS y no
con los sueros NH. (C) Etiquetado inmunogold específico de HCP producido por EHEC EDL933 con
anticuerpos anti-HCP.
FIG3

Figura 3 Análisis SEM ultraestructural de EDL933 adherido a células epiteliales HT-29. (A y B)

Micrografías de electrones que muestran la presencia de estructuras filamentosas (flechas)
parecidas a una vela que sobresalen de las bacterias que se adhieren a la superficie de las células
de los mamíferos. Estos filamentos parecen mediar las interacciones entre bacterias y el contacto
directo con la superficie de la célula.
Figura 4 Producción de HCP en cepas EHEC. (A-F) Inmunofluorescencia de células HT-29 infectadas
con cepas EHEC EDL933 (A), EDL933hcpA (B), EDL933hcpA(pJX12) (C), EDL933hcpA(pJX22) (D), y
EDL933hcpA(pBAD-TOPO) (E) utilizando anticuerpos anti-HCP. EDL933 muestra HCP corto (verde),
indicado por fibras fluorescentes; EDL933hcpA(pJX12) y EDL933hcpA(pJX22) muestran filamentos
fluorescentes extremadamente largos que se extienden a lo largo de varias micras a través de la
bacteria de filtración monocapa de la célula. El ADN de las bacterias y células eucariotas se tiñó de
rojo con yodo propídico. (F) Demostración de que las fibras producidas por EDL933hcpA(pJX22)
que se adhieren a las células HT-29 son HCP según lo determinado por el etiquetado de
inmunogold SEM usando anticuerpos anti-HCP. Aumento original, 15.000. (G y H) Producción de
HCP demostrada por citometría de flujo. (I) Western blotting of whole bacterial cell extracts
showing lack of HcpA in the hcpA mutant.
FIG5

Figura 5 Comparación cualitativa de la adherencia de EDL933 de tipo silvestre y mutantes

derivados a células HT-29. (A) EDL933; (B) EDL933escN (mutante T3SS-ATPase); (C) EDL933hcpA;
(D) EDL933stx1,2; (E) EDL933hcpAstx1,2; y (F) EDL933hcpA(pJX22). Las monocapas celulares HT-29
fueron incubadas con estas cepas durante 6 horas como se describe en Métodos.

FIG6
Figura 6 Cuantificación de la adherencia bacteriana a las células intestinales humanas. Las cepas
indicadas fueron incubadas con células humanas Caco-2, T84 y HT-29 del colon durante 6 horas y
las bacterias adherentes expresadas como UFC tras el metalizado de las diluciones en serie. Los
datos son representativos de al menos 3 experimentos realizados por triplicado. Nótese la
reducción significativa de la adherencia en las cepas EDL933ΔhcpA y EDL933ΔescN en
comparación con el tipo silvestre en todas las líneas celulares probadas.

FIG7
Figura 7 Adherencia de las cepas EHEC a los explantes intestinales de cerdo y vaca. Los tejidos
intestinales de cerdo (íleon y colon) y vaca (colon) se cortaron en cuadrados de 8 × 8 mm y 0,8 g
de peso, se lavaron e incubaron durante 6 horas en DMEM con cultivos de EDL933, EDL933ΔhcpA,
EDL933ΔhcpA, EDL933ΔhcpA(pJX22), y EDL933ΔhcpA(pBAD-TOPO) obtenidos en caldo de Minca.
Se muestra el promedio de 3 experimentos realizados por triplicado. Obsérvese la reducción de la
adherencia a las secciones intestinales animales del mutante hcpA.

FIG8
Figura 8 Detección de HCP en secciones delgadas de explantes intestinales de cerdo infectado.
Después de la infección con el tipo salvaje EDL933 (A) o el EDL933hcpA (C), los tejidos fueron
cortados e inmunizados con anticuerpos anti-HCP. El ADN de las células intestinales del cerdo y las
bacterias se tiñen de rojo (con yoduro de propidio), mientras que el HCP se tiñe de verde. Observe
la ausencia de HCP en el mutante hcpA. Se utilizaron tejidos infectados de imitación (E) como
controles negativos. B, D y F son imágenes ampliadas de A, C y E, respectivamente.

FIG9
Figura 9 Ileon de cerdo infectado con cepas de EHEC, rebanado y teñido con H&E. (A) EDL933; (B)
EDL933hcpA; (C) EDL933 hcpA(pJX22); (D) EDL933escN; (E) EDL933stx1,2; (F) EDL933hcpAstx1,2; y
(G) simulacro de infección. Véase el texto para la descripción.

FIG10
Figura 10 Inhibición de la adherencia a EHEC por anticuerpos anti-HCP. EDL933 fue preincubado
con diluciones de 1:10, 1:50 y 1:100 de anticuerpos anti-HCP durante 30 minutos antes de nuestro
ensayo de adherencia estándar de 6 horas. La adherencia (número de bacterias por célula) fue
registrada visualmente bajo un microscopio de luz. Los experimentos se repitieron al menos 3
veces por triplicado. Observe la inhibición de la dosis-respuesta observada con una alta
concentración de anticuerpos.