La adherencia intestinal asociada con el pili tipo IV de Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7

Escherichia coli endohemorrágica (EHEC) O157:H7 causa colitis hemorrágica y síndrome urémico
hemolítico (HUS) al colonizar la mucosa intestinal y producir toxinas de Shiga (Stx). El único factor
que ha demostrado claramente que desempeña un papel en la adherencia del EHEC a las células
epiteliales intestinales es la intimina, que se une a las integrinas de la célula huésped y a la
nucleolina, así como a un receptor (Tir) que inyecta en la célula huésped. Aquí reportamos que
EHEC O157:H7 produce adhesivo tipo IV pili, el cual llamamos coli pilus hemorrágico (HCP),
compuesto por una subunidad de 19-kDa pilin (HcpA) que está codificada por el gen cromosómico
hcpA. La HCP se observó como haces de fibras de más de 10 m de longitud que formaban puentes
físicos entre las bacterias adheridas a las células huéspedes humanas y bovinas. Los sueros de los
pacientes del SUH, pero no los individuos sanos, reconocieron el HcpA, lo que sugiere que los pili
se producen in vivo durante las infecciones de EHEC. La inactivación del gen hcpA en EHEC EDL933
resultó en una reducción significativa de la adherencia a las células epiteliales intestinales
humanas cultivadas y renales bovinas y a los explantes intestinales porcinos y bovinos. Un
mutante escN, que no puede translocar Tir, se adhirió menos que el mutante hcpA, lo que sugiere
que la adherencia mediada por interacciones intimin-Tir es un preludio a la adherencia mediada
por HCP. Un mutante hcpA y stx1,2 triple mutante y un mutante hcpA tenían niveles similares de
adherencia a las células epiteliales bovinas y humanas, mientras que un doble mutante stx1,2 sólo
tenía un defecto menor de adherencia, lo que indica que la adherencia mediada por HCP y la
citotoxicidad son eventos independientes. Nuestros datos establecen que el EHEC O157:H7 HCP
son factores de colonización intestinal que pueden contribuir al potencial patógeno de este
patógeno transmitido por los alimentos.

Introducción Desde su primera descripción a principios de la década de 1980 (1), la Escherichia coli
enterohemorrágica (EHEC) de O157:H7 y otros serotipos han surgido como una causa significativa
de enfermedad gastrointestinal humana grave en todo el mundo (2-4). Las infecciones por EHEC
pueden provocar diarrea de leve a sanguinolenta y pueden inducir colitis hemorrágica (2, 5), y
algunos pacientes con colitis hemorrágica desarrollan una complicación grave conocida como
síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH se define como una tríada de características clínicas
que incluye insuficiencia renal aguda, trombocitopenia y anemia hemolítica microangiopática, que
comúnmente conduce a la muerte (6). Esta enfermedad infecciosa mortal afecta a los seres
humanos de todas las edades, pero los jóvenes y los ancianos son los más susceptibles al
desarrollo del HUS (7). El ganado adulto, otros animales de granja y los animales salvajes son
reservorios comunes de muchos serotipos de EHEC (8, 9). La infección humana ocurre a través de
la adquisición de la bacteria a través del consumo de alimentos contaminados (carne molida o
vegetales), agua, jugos de frutas no pasteurizados y leche (10, 11). Las características distintivas de
la patogenicidad de EHEC son su capacidad de producir 1 ó 2 toxinas de Shiga (Stx), que son
responsables del HUS (6, 12), y de colonizar la mucosa intestinal, lo que conduce al desarrollo de
lesiones histopatológicas de fijación y borrado (AE). Las cepas EHEC contienen una isla de
patogenicidad llamada locus para el borramiento de enterocitos (LEE), que codifica la mayoría de
los elementos genéticos necesarios para la producción de lesiones de AE (5). Los EHEC son un
subconjunto del grupo patógeno Shiga-toxigénico E. coli (STEC), que abarca las cepas de E. coli que
producen Stx y que pueden o no contener la región LEE. Algunos casos de enfermedad grave,
incluido el síndrome urémico hemorrágico hemorrágico, son causados por cepas de ESL negativas
(13), lo que indica que la región de ESL no es esencial para la patogénesis del síndrome urémico
hemorrágico hemorrágico y que la enfermedad está relacionada con factores ajenos al ESL. La
colonización de la mucosa intestinal es fundamental para el establecimiento de la infección por
EHEC en humanos (4). Las cepas de E. coli O157:H7 se unen in vitro a varios tipos de células
cultivadas (14-16) e in vivo a los tractos gastrointestinales de pollos, lechones gnotobióticos,
conejos recién nacidos y terneros neonatales (14, 17-19). En el ganado adulto, se cree que la unión
recto-anal terminal es el sitio principal de colonización del tracto gastrointestinal bovino (20). A
pesar de los esfuerzos por identificar las adhesiones fimbriales putativas, el único factor que ha
demostrado claramente que juega un papel en la adherencia celular de las cepas positivas para
LEE es la intimina, una proteína adhesiva de membrana externa que media en la adhesión
bacteriana íntima mediante el reconocimiento de su propio receptor inyectado (Tir) o mediante el
reconocimiento de la integrina o nucleolina de la célula huésped (14, 21-24). Sin embargo, los
mutantes de la intimina todavía son capaces de colonizar las células epiteliales del huésped, lo que
sugiere que la bacteria produce otras adhesiones aún no identificadas. Se ha propuesto que otras
proteínas de superficie menos caracterizadas se asocien con propiedades de adherencia (13, 15,
16, 25). Sin embargo, algunas de estas adhesiones putativas sólo se encuentran en ciertas cepas
de STEC, y se necesitan más estudios para aclarar su función en la adherencia celular. El genoma
de E. coli O157:H7 contiene 16 loci que codifican genes supuestamente implicados en la
biosíntesis de fimbriae o pili (26-28), pero se desconoce cuántos de ellos son funcionales in vivo.
Se han identificado varias fimbriae en cepas EHEC, incluyendo la sorbitolfermentante EHEC O157
fimbriae plasmid-encoded (SFP) (29), 2 loci-encoding long polar fimbriae (30), curli (31), F9 (a type
I pilus homolog) (32), y un tipo IV pilus (TFP) en LEE-negativo no O157: H7 STEC (33). Se desconoce
el papel de la mayoría de estos pilis en la colonización del huésped. Las largas fimbrias polares de
EHEC O157:H7 parecen jugar un papel en la colonización de cerdos y ovejas (34). Curiosamente,
los mutantes EHEC en el F9 pilus mostraron más adherencia a las células epiteliales que la cepa
silvestre (32). Recientemente, informamos que las cepas EHEC producen un apéndice de adhesión
llamado E. coli common pilus o ECP, que también es producido por otras cepas patógenas y no
patógenas de E. coli (35). La EHEC y la flora normal E. coli incapaz de producir PAE se vieron
perjudicadas en su capacidad de adherirse a las células epiteliales cultivadas. Sin embargo, queda
por dilucidar si el pili desempeña un papel biológicamente significativo en la colonización del
intestino de sus huéspedes naturales bovinos o humanos accidentales por parte de la EHEC.

La PTF es un factor importante de virulencia en muchas bacterias patógenas Gram-negativas, ya

que media la adherencia a las células eucariotas y la colonización del huésped y está asociada con
otros fenómenos relacionados con la patogenicidad, como la agregación bacteriana, la formación
de biopelículas, la unión y absorción del ADN y la motilidad de los movimientos espasmódicos (36-
41). Hasta ahora, la PTF no se ha observado en los EHEC O157:H7 que producen AE. En este
estudio, demostramos la expresión y ensamblaje de la PTF en EHEC O157:H7 y proporcionamos
datos que muestran que estos pili están implicados en la adherencia a células epiteliales colónicas
humanas cultivadas y a explantes intestinales porcinos y bovinos y que los pili inducen una
respuesta inmunitaria de anticuerpos en pacientes con SUH. Estas observaciones contribuyen a
nuestro conocimiento de los mecanismos subyacentes a la interacción de la EHEC con las células
huéspedes. Visualización de los resultados de las estructuras pili producidas por EHEC O157:H7.
Durante los últimos 20 años, los intentos de expresar y caracterizar de forma reproducible el pili
producido por las cepas EHEC no han tenido éxito. El análisis de la secuencia del genoma del EHEC
EDL933 revela 16 loci con potencial para codificar proteínas de pili; sin embargo, todavía es un
enigma qué papel, si lo hay, juega el pili en la colonización del huésped. Estábamos interesados en
determinar si, además de ECP, EHEC O157:H7 podía expresar y producir estructuras pili adicionales
al interactuar con las células huéspedes. Se realizaron estudios ultraestructurales mediante tinción
negativa y microscopía electrónica de transmisión (MET) para investigar la presencia de pili en 3
cepas prototípicas y bien caracterizadas de EHEC O157: cepas H7 (EDL933, 86-24 y 85-170)
cultivadas a 37°C en medios bacteriológicos como Luria-Bertani (LB), Mueller-Hinton, agar CFA o
agar sangre. No se observó ningún pili en estas cepas bajo estas condiciones de crecimiento
(Figura 1A y datos no mostrados). Estas observaciones indican que la expresión del pili depende de
la composición del medio de cultivo y está sometida a un estricto control reglamentario y
ambiental. Dado que el EHEC es un comensal de ganado, decidimos utilizar un medio de caseína
mínima (Minca), ya que este medio se utilizaba en el pasado para inducir con éxito la expresión de
fimbriae en E. coli enterotoxigénico bovino (ETEC) (42). Después del crecimiento a 37°C en agar
Minca, pudimos ver pili largo (>20 m), delgado, parecido a una caña (Figura 1, B y C) que se asoció
lateralmente en haces, morfológicamente evocador de la ETEC Longus TFP (43). Similar a la
producción de pili en otros patógenos de E. coli (43, 44), el grado de producción del nuevo EHEC
pili varió entre las 3 cepas de EHEC probadas. Caracterización bioquímica del nuevo pili. Para
determinar la naturaleza de estas novedosas estructuras, se cosechó el EHEC EDL933 que crece en
agar Minca a 37°C con 5% de atmósfera de CO2 y se purificó el pili mediante cizallamiento
mecánico y centrifugación diferencial (45). Los pili purificados (Figura 2A) se disociaron en
monómeros de pilina de 19 kDa en geles de SDS-PAGE al 16% (Figura 2B). Esta proteína fue
sometida a un análisis de espectrometría de masas después de la digestión de tripsina. Los
péptidos obtenidos mostraron secuencias de aminoácidos que correspondían a la proteína PpdD
prevista, que está codificada por el gen de la prepilina dependiente de la peptidasa (ppdD) que se
encuentra en el genoma K-12 de E. coli (46, 47). La proteína PpdD posee características de las pilas
de clase A tipo IV, a saber, tiene una secuencia de líder corta, un residuo invariable de glicina que
precede al sitio de clivaje del péptido líder, y una región hidrofóbica, que contiene un par
invariable de aminoácidos de glutamatotirosina (48). Estudios previos reportaron que las cepas de
laboratorio o patógenas de E. coli no son capaces de ensamblar la proteína PpdD en una
estructura pilosa (49). El presente informe es el primero, hasta donde sabemos, en demostrar que
el EHEC O157:H7 o cualquier otro E. coli son realmente capaces de ensamblar el pilín PpdD tipo IV
en haces polares largos de filamentos agregados lateralmente, una característica morfológica
típica de la PTF. Por lo tanto, estamos proponiendo el nombre de coli pilus hemorrágico (HCP) para
describir la PTF producida por EHEC O157:H7 que se componen de la proteína HcpA (PpdD)
codificada por el gen hcpA (ppdD). Además, el monómero pilín reaccionó específicamente en
inmunobloques con un anticuerpo policlonal de conejo contra el E. coli K-12 PpdD clonado
fusionado con la proteína de unión maltosa/maltodextrina (Figura 2B). Los haces de HCP que
sobresalían de la célula bacteriana fueron etiquetados por el etiquetado de inmunogold (Figura
2C) con anticuerpos anti-PpdDK-12 (en adelante referidos como anti-HCP), confirmando la
identidad de HCP. No se observaron partículas de oro asociadas con la superficie bacteriana, lo
que demuestra la especificidad de la reacción. Organización del supuesto HCP operón en EHEC
O157:H7. La secuencia de aminoácidos de HcpA de EHEC es similar a la de la PTF producida por
algunos patógenos bacterianos que colonizan los tejidos del huésped, incluyendo PilA de
Pseudomonas aeruginosa (55%, número de acceso al GenBank AY113185), PilA de Moraxella
catarrhalis (61%, número de acceso al GenBank AY647185), y PilE de Neisseria gonorrhoeae (62%,
número de acceso al GenBank AF043652).

El HcpA de EHEC está altamente conservado entre las Enterobacteriaceae y comparte más del 95%
de identidad con el PpdD de las especies E. coli K-12 y Shigella. La biogénesis de la PTF
generalmente requiere la función de más de 16 genes, a menudo organizados en operones
multicistrónicos. Es particularmente interesante que la producción de HCP en EHEC es
aparentemente impulsada por los productos de menos genes, a saber, hcpA (gen pilin), hofB (gen
usher, aquí llamado hcpB), y hofC (gen chaperón, aquí llamado hcpC). Estos genes se localizan
inmediatamente aguas abajo de hcpA y comparten similitudes con los genes accesorios pilB y pilC,
respectivamente, implicados en la biogénesis de la PTF en P. aeruginosa (Figura suplementaria 1;
material suplementario disponible en línea con este artículo; doi:10.1172/JCI30727DS1).

Reactividad de la HCP con sueros de pacientes con HUS. La presencia de anticuerpos en pacientes
convalecientes es un marcador biológico de la producción de un antígeno in vivo. Se intentó
determinar si los pacientes que sufrían de SUH desarrollaron anticuerpos contra la HCP. Un grupo
de 5 sueros de pacientes con SUH reaccionó con HCP purificado por Western blotting (Figura 2B).
Se utilizó un grupo de sueros humanos normales como control negativo. La subunidad 19-kDa pilin
fue reconocida por los sueros del HUS pero no por los sueros humanos normales, lo que sugiere
fuertemente que la HCP podría producirse in vivo durante la infección del EHEC. Demostración de
HCP en EHEC adherido a células huéspedes. A continuación, se investigó la presencia de
estructuras similares a las píldoras en las bacterias EHEC que se adhieren a las células epiteliales
del colon HT-29 cultivadas mediante microscopía electrónica de barrido de alta resolución (SEM,
por sus siglas en inglés). Vimos que el EDL933 adherido a estas células epiteliales intestinales
humanas produjo estructuras similares a las de una mecha (de aproximadamente 20 nm de ancho)
que sobresalían de la superficie bacteriana (Figura 3A). Estructuras similares también se
observaron en EHEC adheridas a líneas celulares de colon humano (T84 y Caco2), líneas celulares
no intestinales (HeLa y HEp-2), y células epiteliales de riñón bovino (Madina-Darby riñón
bovino[MDBK]) (datos no mostrados). Estas estructuras parecían atar las bacterias entre sí dentro
del grupo bacteriano y mediar la unión directa de las bacterias a la membrana celular de los
mamíferos (Figura 3B). Se planteó la hipótesis de que estas estructuras podrían ser HCP, por lo que
la identidad de estas estructuras fue investigada mediante microscopía de inmunofluorescencia
(MFI). Las células HT-29 infectadas por EDL933 incubadas con anticuerpos anti-HCP revelaron la
presencia de un perfil de fluorescencia específico consistente con la presencia de pili (Figura 4A).
También se observaron estructuras fluorescentes similares en el EHEC incubado con otras líneas
celulares (datos no mostrados). La interrupción del hcpA reduce la adherencia del EHEC a las
células epiteliales. Para proporcionar evidencia genética sobre el posible papel de la HCP en la
adherencia de la EHEC a las células epiteliales, produjimos una deleción dentro del marco del gen
hcpA de las cepas EHEC O157:H7 EDL933 y 85-170 (Stx-), generando mutantes EDL933hcpA y 85-
170hcpA (mutante triple stx1,2hcpA), respectivamente. Los análisis de citometría de flujo, IFM y
Western blotting (de extractos de células bacterianas enteras) demostraron la falta de producción
de HCP en estos mutantes (Figura 4 y Figura 2A suplementaria). No se observaron estructuras
fluorescentes en el mutante isogénico hcpA con o sin vector pBAD-TOPO en presencia de células
epiteliales (Figura 4, B y E). La infección de las células HT-29 con EDL933hcpA complementada con
plásmidos pJX12 (portadores de hcpA) o pJX22 (portadores de hcpABC) causó la aparición de una
abundante red fluorescente de grandes haces de filamentos largos que sobresalen de las bacterias
y se extienden a través de los campos de observación (Figura 4, C y D). Estos datos indicaban que
la sobreexpresión de hcpA sola o junto con hcpB y hcpC era suficiente para el ensamblaje de HCP,
pero también que la adición de los factores de ensamblaje de HcpB y HcpC en la mutante de hcpA
era suficiente para aumentar la cantidad de HCP producido. Los paquetes largos de pili producidos
por EDL933hcpA complementados con pJX12 o pJX22 fueron decorados con anticuerpos anti-HCP
y anticuerpos secundarios conjugados con partículas de oro de 30 nm, según lo determinado por
inmuno-SEM (Figura 4F). No se observaron partículas de oro en el control con suero preinmune
(datos no mostrados). La especificidad del antisuero anti-HCP se demostró aún más con extractos
de células enteras de EDL933 (Figura 4I), en los que sólo se detectó la proteína reactiva HcpA. Para
juzgar la importancia de la pérdida de HCP, se utilizó el EDL933hcpA para medir la adherencia a las
células del colon humano (T84, HT-29 y Caco2), las líneas celulares no intestinales (HEp-2 y HeLa) y
las células epiteliales cultivadas de bovino (MDBK). La cepa 85-170hcpA fue probada sólo para la
adherencia a células MDBK y HT-29. Para estos experimentos de infección, propagamos todas las
cepas durante la noche en medio de Minca a 37°C con el fin de activarlas para la producción de
HCP. Las imágenes de microscopía de luz de las células infectadas teñidas con Giemsa muestran un
evidente deterioro de la adherencia del mutante hcpA en comparación con las cepas silvestres y
las complementadas (Figura 5).

El nivel de deterioro en la adherencia de EDL933hcpA se determinó contando las bacterias

adheridas a varias líneas de células del colon humano después de un extenso lavado y lisis celular.
Dependiendo de la línea celular empleada, la mutación del gen hcpA resultó en una disminución
de 3 a 5 veces en la adherencia en relación con EDL933 (P < 0.0001) (Figura 6). La
complementación del mutante hcpA con pJX22 aumentó la adherencia (P < 0,0001) a un nivel
ligeramente superior al observado en la cepa parental. El aumento en la adherencia podría
correlacionarse con la abundante HCP producida por esta cepa (Figura 4D). El mutante hcpA creció
normalmente en el caldo LB, descartando un defecto de crecimiento como causa de la reducción
de la adherencia. La adherencia de EHEC se redujo en gran medida, aunque no completamente,
por la eliminación de hcpA, lo que indica que otros factores de colonización (por ejemplo, intimin-
Tir y ECP) contribuyen a la adherencia de EHEC a diferentes líneas celulares. También observamos
una reducción de la adherencia de EDL933hcpA a otras líneas celulares humanas no intestinales
(HeLa y HEp-2) y bovinas (MBDK) probadas (datos no mostrados). Tomados en conjunto, los datos
indican fuertemente que el HCP media la adherencia a varias líneas celulares epiteliales, tal vez
por el reconocimiento de un receptor de superficie común. Adherencia a los explantes intestinales
de cerdo y vaca. Los explantes intestinales obtenidos de un cerdo sano de 3 semanas de edad
(íleon y colon) y de colon de vaca se utilizaron en experimentos cuantitativos para comparar la
capacidad de las cepas productoras de HCP y el mutante hcpA para adherirse. De acuerdo con los
resultados obtenidos en los ensayos de adherencia al cultivo de tejidos, el mutante hcpA también
se vio afectado en la adherencia al tejido intestinal animal en comparación con las cepas
productoras de HCP (Figura 7). Tomados en conjunto, los datos de adherencia sugieren
fuertemente que la HCP son factores de colonización intestinal con afinidad por células epiteliales
humanas, bovinas y porcinas. Se intentó determinar si EHEC produciría HCP mientras se adhería a
los explantes intestinales animales. Secciones finas de tejidos porcinos infectados reaccionaron
con anticuerpos anti-HCP por IFM, y encontramos que los HCP son producidos por EDL933 durante
la interacción con el tejido intestinal del cerdo y no por el mutante hcpA (Figura 8). Encontramos
que el tipo salvaje EDL933, el hcpA complementado (pJX22), y el mutante Stx se adhirieron
abundantemente al moco y a los desechos celulares presentes en la superficie lumínica de la
mucosa intestinal. Se observaron menos bacterias adheridas multifocalmente a la serosa; se
observaron dentro de la túnica muscular, la submucosa y las vellosidades desnudas; y
ocasionalmente se adhirieron al epitelio velloso escamoso (Figura 9, A, C y E). En contraste, los
mutantes hcpA, hcpAstx1,2 y escN se adhirieron en pequeñas cantidades a la mucosa intestinal
(Figura 9, B, D y F). Otra observación interesante fue que los explantes de cerdo infectados con
EDL933, EDL933hcpA(pJX22), y EDL933stx1,2 perdieron su arquitectura normal, ya que el epitelio
del revestimiento intestinal fue básicamente destruido, en comparación con el tejido infectado de
imitación (Figura 9, A, C, E y G). En contraste, los tejidos infectados con los mutantes hcpA, hcpA,
stx1,2 y escN mostraron menos daño (Figura 9, B, D y F). Estos datos sugieren que la presencia y
adherencia mediada por la HCP es importante para la colonización de la mucosa intestinal y para
el daño tisular posterior. Relación entre la interacción intimin-Tir, la adherencia mediada por HCP
y la citotoxicidad. EHEC causa lesiones de AE a través de la interacción intimin-Tir, que depende
estrictamente de la función del T3SS. En algunas bacterias patógenas como P. aeruginosa, la PTF
no se requiere específicamente para la translocación de exoenzimas dependientes del contacto
(50). En el caso de la E. coli enteropatógena (EPEC), se cree que la fijación inicial a las células
huéspedes está mediada por la PTF, y el T3SS es necesario en la formación de lesiones de EA (39,
51, 52). Aquí, exploramos la contribución de T3SS (interacción intimin-Tir), HCP y citotoxicidad
sobre la adherencia a las células huéspedes. Se intentó investigar si la adherencia mediada por
HCP era un prerrequisito para la adhesión íntima a las células huéspedes o si la adherencia
dependiente de T3SS conducía a la activación de la producción de HCP. Para probar esta hipótesis,
empleamos mutantes HCP y T3SS en ensayos de adherencia comparativos y cuantitativos.
Además, se incluyeron mutantes de doble stx1,2 y triple hcpAstx1,2 para determinar cómo Stx
podría influir en el resultado de la interacción de EHEC con las células huéspedes. Primero,
probamos el mutante EDL933 hcpA para la producción de las proteínas EspA, B y D segregadas por
T3 y encontramos que esta cepa era capaz de producir Esps al mismo nivel que la cepa silvestre
(Figura suplementaria 3), lo que sugiere que el mutante hcpA sigue siendo capaz de reclutar actina
e inducir la formación de lesiones AE.

Esta noción fue confirmada por el ensayo fluorescente de tinción de actina, que permitió la
detección de condensación de actina en las células huéspedes debajo de las bacterias adheridas
(datos no mostrados). Segundo, encontramos que el EDL933 mutado en escN (un gen de la ATPasa
asociado a T3SS) se redujo significativamente en la adherencia a las líneas celulares del colon (p <
0.0001), incluso más que el mutante hcpA (Figura 5, B y C, y Figura 6). Por último, la mutación en
los genes stx1,2 en EDL933 tuvo un efecto negativo en la adherencia pero no tan significativo
como la mutación en escN, hcpA o hcpAstx1,2 (Figuras 5 y 6). La cepa EHEC 85-170, que carece de
producción de Stx, sigue siendo capaz de adherirse a las células huéspedes, lo que indica además
que la citotoxicidad no es necesaria para la adherencia mediada por HCP (Supple mental Figure 2).
Por lo tanto, estos resultados sugieren que las funciones asociadas a T3SS y HCP actúan de forma
sinérgica para mediar el apego y la colonización de EHEC. En conjunto, estos experimentos han
arrojado luz sobre la secuencia y relevancia de los eventos y mecanismos de adherencia
empleados por EHEC O157:H7.
Inhibición de la adherencia con anticuerpos HCP. Se utilizaron anticuerpos de conejo dirigidos
contra HCP purificado para probar su capacidad de bloquear la adherencia de 3 cepas EHEC
O157:H7 (EDL933, 86-24, y 85-170). Se observó una sorprendente inhibición dependiente de la
dosis con las tres cepas utilizadas, pero en particular con las cepas 86-24 y 85-170 (>90% de
inhibición) (Figura 10). La diferencia observada entre las cepas es una indicación de que la
inhibición no se debe a la presencia de anticuerpos anti-O157 en el suero empleado. Estas
observaciones apoyan aún más el papel de la HCP en la adherencia a las células huéspedes.
Discusión El renacimiento epidemiológico y la importancia clínica de las infecciones transmitidas
por alimentos EHEC han estimulado un mayor interés en la comprensión de los mecanismos
patógenos de este organismo mortal (7). Aunque está bien establecido que el EHEC coloniza la
mucosa colónica humana y el recto terminal de los bovinos (20), no está claro qué papel
desempeña el pili en la colonización del huésped. La PTF no ha sido observada previamente en
EHEC O157:H7. Muchas funciones asociadas con la patogenicidad en las bacterias Gram-negativas
se atribuyen a la PTF, incluyendo la motilidad espasmódica, la adherencia a las células huéspedes,
la formación de biopelículas, la captación de ADN, la fijación de fagos, la señalización celular y la
evasión del sistema inmunológico (37). En este estudio, proporcionamos evidencia convincente
que demuestra claramente que EHEC O157: H7 es capaz de ensamblar pilina tipo IV HcpA en
paquetes largos de pili, que nosotros designamos HCP. Análogamente al papel que la PTF juega
como factor de colonización en otras bacterias patógenas, planteamos la hipótesis de que la PCH
es un factor de colonización de la EHEC. Encontramos que los HCP están involucrados en la
adherencia del EHEC O157:H7 a las líneas celulares intestinales (colónicas) y no intestinales
humanas, a las células epiteliales bovinas (renales), y a los explantes de intestinos de cerdos y
vacas. Nuestra observación de que los mutantes de hcpA mostraron una disminución significativa
del apego a las células epiteliales cultivadas (HT-29, T84, Caco2, HEp-2, HeLa y MDBK) que podrían
ser restauradas a la plena adherencia mediante la complementación con hcpA solo o en asociación
con hcpBC es una fuerte indicación de que el HCP promueve la adherencia bacteriana a las células
epiteliales intestinales y no intestinales del huésped. Los estudios comparativos de adherencia
también revelaron que todavía hay factores de adherencia adicionales presentes en EHEC, ya que
los mutantes hcpA mostraron cierta adherencia residual a células epiteliales humanas y bovinas
cultivadas. La adherencia residual puede atribuirse a la presencia de intimin-Tir y a la producción
de ECP. Se ha sugerido que el recto terminal, más que el intestino, es el sitio primario de
colonización de EHEC O157:H7 en bovinos y que los componentes codificados por el LEE4 operón
son necesarios para la colonización rectal (20). En este contexto, la HCP puede desempeñar un
papel accesorio en la colonización del huésped bovino en asociación con otras adhesinas con o sin
codificación LEE. Los cerdos gnotobióticos han sido utilizados como modelo para estudiar los
eventos de patogénesis de EHEC. De hecho, el papel de la intimina como adhesina in vivo se
demostró en un modelo porcino (21). Empleamos explantes intestinales porcinos y bovinos para
estudiar el papel de la HCP como factor de colonización in vitro. Como se predijo, el mutante hcpA
se vio afectado en la adherencia al tejido animal en comparación con las cepas productoras de
HCP. Interesantemente, mostramos que la HCP es producida por EDL933 infectando el tejido
intestinal del cerdo, ya que secciones delgadas de explantes de cerdo infectados reaccionaron con
anticuerpos anti-HCP por IFM. El tipo silvestre, el mutante Stx, y el EDL933hcpA(pJX22) observaron
daños considerables en los tejidos, mientras que los explantes incubados con mutante hcpA
conservaron su arquitectura aparentemente normal. En general, estos datos son evidencia
convincente que respaldan nuestra hipótesis de que la HCP son factores de colonización intestinal.

La interacción intimin-Tir, que depende de la presencia y función del T3SS, es crucial para el
desarrollo de la unión íntima y el borrado de la membrana del enterocito, aunque no es suficiente
para mediar la unión en ausencia de HCP. Además de su papel central en la citotoxicidad y el
desarrollo de HUS, se ha reportado que Stx induce la expresión de nucleolina expuesta a la
superficie en células de mamíferos (24), que actúa como un receptor alternativo para la intimina.
Se exploró si la adherencia dependiente de T3SS o inducida por Stx era un requisito o una
consecuencia de la adherencia mediada por HCP a las células epiteliales cultivadas. Con este fin,
analizamos en ensayos comparativos y cuantitativos la capacidad de los mutantes escN, stx1,2,
hcpA y hcpAstx1,2 para adherirse a varias líneas celulares del colon intestinal humano. Bajo
nuestras condiciones experimentales, la cepa EHEC 85-170, que no produce Stx, se adhirió a las
células del colon de forma tan eficiente como la Shiga toxigénica EDL933. Cuando los genes stx1,2
y hcpA fueron interrumpidos en EDL933 y 85-170 fueron mutados en hcpA, encontramos que
ambos mutantes mostraron niveles de adherencia similares a los del mutante único EDL933 hcpA.
Estos resultados sugieren que la adherencia mediada por HCP es independiente de la citotoxicidad
y que la adherencia mediada por Stx no contribuye a la función de la HCP. Cuando se comparó la
interacción intimin-Tir y la adherencia mediada por HCP, se observó que el nivel de adherencia del
mutante escN (incapaz de translocar Tir) y el mutante hcpA eran de 6 a 27 veces y de 3 a 5 veces
(dependiendo de la línea celular empleada), respectivamente, en comparación con la cepa
silvestre. Estos resultados apoyan aún más que el T3SS funcional y la adherencia mediada por
intimin-Tir son centrales para la interacción de EHEC con las células huéspedes y sugieren
fuertemente que el HCP funciona como un factor de colonización accesorio importante. Los
resultados de los estudios ultraestructurales y de IFM obtenidos aquí sugieren fuertemente que el
HCP contribuye a consolidar la formación de unidades infecciosas al unir las bacterias. Sin
embargo, no podemos excluir la posibilidad de que la HCP también mediara en el contacto directo
de las bacterias con un receptor en particular, el cual aparentemente está ampliamente
distribuido entre las células intestinales y no intestinales. En el caso de P. aeruginosa, la
translocación de exoenzimas y citotóxicos por contacto a través de T3SS se produce
independientemente de la PFT (50). Si el HCP actúa en las primeras o últimas etapas del proceso
de colonización requiere mayor investigación. Nuestra investigación de las condiciones in vitro
para la producción de pilus en cepas silvestres de EHEC O157:H7, utilizando diferentes ambientes
de crecimiento y medios de cultivo, reveló que EHEC produce HCP después del crecimiento en
medio Minca (42) y en contacto con las células huéspedes. Los datos sugieren que, al igual que la
producción de PTF en otros patógenos (53, 54), la producción de HCP en EHEC O157:H7 está
probablemente fuertemente regulada. Es posible que el crecimiento de las bacterias en Minca
alivie la regulación negativa ejercida en otras condiciones de crecimiento por un represor
desconocido o que las señales presentes en Minca induzcan la expresión de un activador
específico. Especulamos que las señales ambientales y nutricionales que desencadenan la
producción de HCP deben parecerse a las que se encuentran in vivo, tal vez durante la
colonización del intestino grueso de animales y humanos, y se están realizando esfuerzos para
identificar estas señales precisas. Estudios anteriores demostraron que las cepas de E. coli
patógenas o de laboratorio no eran capaces de producir pili que contenían HcpA (que contenían
PpdD), incluso cuando los niveles de expresión tanto de hcpA/ppdD como de los genes de
ensamblaje (hcpB/hofB y hcpC/hofC) se incrementaron. La producción de PpdD pili sólo se
observó en un huésped heterólogo como P. aeruginosa que carecía de PFT endógena (49) o en E.
coli que producía la secreción de pullulanasa tipo II de Klebsiella oxytoca (55). El hecho de que el
HCP se produzca en cepas EHEC O157:H7 sugiere la presencia de una maquinaria de biogénesis de
TFP y genes reguladores que están ausentes o son defectuosos en E. coli K-12 (45, 49). El
ensamblaje de la PTF requiere, dependiendo del organismo, de 16 a 40 genes de biogénesis (37).
Los estudios de complementación genética que involucran la transferencia de genes hcpABC en un
plásmido expresado a partir de un promotor inducible al mutante HCP de EHEC dieron como
resultado una cepa que era capaz de hiperproducir HCP. Esto sugeriría que la inducción de sólo
estos 3 genes es suficiente para la producción de HCP. No podemos descartar que otros genes
presentes en el cromosoma de la EHEC sean importantes para la biogénesis de la HCP. Los genes
hcpABC están notablemente bien conservados en E. coli, Shigella y varias otras especies
enterobacterianas, lo que sugiere que bajo ciertas condiciones ambientales, la HCP podría ser
producida por estos organismos y jugar un papel importante en la adaptación y supervivencia.

La elucidación de los mecanismos detallados de colonización de los huéspedes humanos y bovinos

será importante para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la EHEC y en el desarrollo
de estrategias para prevenir las infecciones de EHEC. En este contexto, la HCP debe considerarse
un factor de colonización accesorio que, junto con la intimina-Tir y la ECP, contribuye a la
colonización del tracto gastrointestinal de humanos y bovinos. Métodos Cepas bacterianas y
condiciones de cultivo. Las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran
en la Tabla 1. Las bacterias se cultivaban rutinariamente en caldo LB a 37°C con agitación, a menos
que se indique lo contrario. Cuando fue necesario, se añadieron a los medios antibióticos
kanamicina (100 g/ml) y ampicilina (100 g/ml). El medio mínimo de Minca (1,36 g de KH2PO4, 10,1
g de Na2HPO4.2H2O, 1 g de glucosa, 1 g de casinoácidos, 10 g de MgSO4.7H2O, 1 g de
MnCl2.4H2O, 0,135 g de FeCl3.6H2O y 0,4 g de CaCl2.2H2O por litro ajustados a pH 7,5) (42) se
empleó en la producción de HCP y en la preparación de cultivos bacterianos para ensayos de
adherencia comparativa. La arabinosa se utilizó a 100 mM en el caldo LB para inducir la
producción de recombinasa roja a partir del plásmido pKD46 (56). Para la inducción del promotor
inducible pBAD-TOPO, se añadió 0,8% de arabinosa al medio. Manipulaciones de ADN. La
electroforesis en gel de agarosa, la transformación, la PCR, la digestión de enzimas de restricción,
la ligadura y otros procedimientos rutinarios de ADN se llevaron a cabo como se describió
anteriormente (57). Construcción de mutantes EHEC pili. El sistema de recombinase roja se utilizó
para construir mutantes de borrado no polar hcpA de las cepas EHEC O157:H7 EDL933 y 85-170
(56). Se utilizaron cebadores G68 y G69, homólogos de las secuencias del gen hcpA dentro de 3′ 3′,
para reemplazar este gen por un cassette resistente a la kanamicina derivado de la plantilla
plásmido pKD4 (Tabla 1) (56). Para la mutagénesis de stx1,2 se utilizaron los cebadores G336 y
G337. Se utilizaron cebadores que flanquean los genes hcpA (G98 y G99) o stx1,2 (G338 y G339),
así como cebadores dentro del gen de resistencia a la kanamicina (K1 y K2) para confirmar el
reemplazo del gen requerido por PCR. Los mutantes hcpA resultantes en EDL933 y 85-170 se
denominaron EDL933hcpA y 85-170hcpA, respectivamente. Para complementar los mutantes
hcpA, la hcpA sola o junto con los genes hcpBC se amplificó a partir de EDL933 utilizando los
primers listados en la Tabla 2 y se clonó en el sitio NcoI y el excedente de timidina de pBAD-TOPO.
Los plásmidos resultantes (pJX12 y pJX22) se obtuvieron en HB101 y luego se electroportaron en
los mutantes hcpA para producir EDL933hcpA(pJX12) y EDL933hcpA(pJX22). Se indujo la expresión
de genes bajo control del promotor de araBAD con 0,8% de arabinosa. Antisueros. Se utilizó
anticuerpo de conejo contra una fusión de E. coli K-12 PpdDD-GST después de 4adsorción con el
mutante EDL933 hcpA para eliminar anticuerpos no específicos. En el texto, este anticuerpo se
denomina anti-HCP. Los antisueros contra EspA, EspB y EspD estaban disponibles en estudios
anteriores (58, 59). Los sueros humanos se obtuvieron de pacientes del SUH que dieron su
consentimiento informado y fueron un regalo amable de Phillip Tarr (Universidad de Washington,
St. Louis, Missouri, EE.UU.) a James B. Kaper, y los sueros humanos normales se obtuvieron de la
colección del Centro para el Desarrollo de Vacunas de la Universidad de Maryland. Microscopía
electrónica y etiquetado de inmunogoldes. Para la MET, se colocó una gota (10 l) de cultivo
bacteriano o muestra pili en una rejilla recubierta de carbono Formvar durante 3 minutos, se tiñó
negativamente con ácido fosfotúngstico sódico al 1% (pH 7,2) durante 1 minuto y se examinó bajo
un microscopio electrónico de transmisión Philips. Para el immunogold EM, las bacterias se
mezclaron con sueros anti-HCP diluidos 1:10 en PBS que contenían 1% (peso/volumen) de BSA
durante 1 hora y se lavaron con PBS-BSA. La inmunoglobulina anti-conejo de cabra etiquetada con
partículas de oro de 10 nm (BB International) diluido 1:10 en PBS-BSA se utilizó para detectar
anticuerpos unidos al pili y luego teñidos negativamente como se indica arriba (58). Para la MEB,
las células infectadas se fijaron con formalina al 2% en el PBS, se fijaron posteriormente con
tetraóxido de osmio al 1%, se deshidrataron mediante concentraciones secuenciales de etanol, se
secaron hasta el punto crítico y se recubrieron con una mezcla de oro y paladio. Las muestras se
examinaron en un microscopio electrónico de barrido Leo de alta resolución. Purificación de Pilus.
El HCP producido por EDL933 se desprendió de las bacterias cultivadas en 40 placas (150 15 mm)
de agar Minca complementado con 0,8% de arabinosa mediante un agitado vigoroso. La
purificación de Pilus fue supervisada por TEM y SDS-PAGE, como se describió anteriormente (39).
En resumen, las bacterias se separaron por centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos, y el
sobrenadante se centrifugó a 18.000 g durante 30 minutos para eliminar los flagelos, las
membranas externas y los residuos bacterianos. El sobrenadante que contiene el pili se centrifugó
a 78.000 g durante 2 horas y el precipitado se disolvió en agua destilada y luego se cargó en un
cloruro de cesio con un gradiente de Sarkosyl al 1% (densidad 1,2 g/ml) para obtener un pili
relativamente puro (58).

El gradiente se centrifugó a 50.000 g durante 24 horas a 18°C, tras lo cual se observó una banda
gruesa opaca en el centro del gradiente. El material en esta banda fue recuperado por punción
lateral, dializado contra agua destilada y observado por TEM.

Análisis de SDS-PAGE y Western blotting. Los preparados de pili de los pasos de purificación y los
lisados de células enteras normalizados se separaron con SDSPAGE en geles de acrilamida al 16%
(60). La Western blotting se realizó utilizando anticuerpos anti-HCP en una dilución de 1:2.000 y un
conjugado de peroxidasa de rábano picante (1:20.000). Los bloques fueron desarrollados con el
reactivo de detección de anticuerpos HRP quimioluminiscentes HyGLO (Denville Scientific Inc.).
Espectrometría de masas. Se extrajo una banda de proteínas de 19 kDa de los geles de
poliacrilamida y se sometió a un análisis de espectrometría de masas después de la digestión con
tripsina en el Centro de Proteómica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Arizona.
Citometría de flujo. La citometría de flujo se utilizó para detectar la expresión de HCP producida
por las cepas EHEC O157:H7 cultivadas durante la noche a 37°C en medio Minca. Los cultivos se
ajustaron a una densidad óptica (OD600) de 1.1, y se incubaron alícuotas de 45 l durante 1 hora en
hielo con 25 l de anti-HCP utilizando una dilución de 1:1.000. Después de 3 lavados suaves con
PBS, las bacterias fueron suspendidas en 25 l de una dilución de IgG de cabra anti-conejo (H+L)
conjugada con Alexa Fluor (Invitrogen). Después de una hora de incubación a 4°C, las bacterias
fueron lavadas suavemente 3 veces con PBS y resuspendidas en un volumen final de 800 l de PBS.
Para el análisis, las bacterias fueron etiquetadas con 5 l de una solución de yoduro de propidio
(Sigma-Aldrich). El yoduro de propidio fue visualizado a través de una banda de 42 nm centrada a
585 nm. Estos experimentos se repitieron 3 veces por triplicado. La emisión de fluorescencia del
FITC se recogió a través de un filtro pasa banda de 30 nm centrado a 530 nm en el que se midieron
50.000 eventos. Las muestras fueron analizadas en el ARL Biotechnology/ACCC Cytometry Core
Facility de la Universidad de Arizona, utilizando un FACScan (BD). Adherencia bacteriana a las
células epiteliales. Empleamos células epiteliales intestinales polarizadas humanas (HT-29, T84 y
Caco2) y células no intestinales (HeLa y HEp-2), así como líneas celulares de riñón bovino (MDBK).
Estas células fueron cultivadas a 37°C bajo una atmósfera de 5% CO2 en placas de poliestireno de
24 pozos (CellStar) que contenían cubreobjetos de vidrio, como se describió anteriormente (58).
Para el ensayo de adherencia, se lavaron y reconstituyeron con DMEM (Invitrogen) monocapas
celulares con una confluencia del 60%-80%. Como inóculo, utilizamos 107 bacterias cultivadas
durante la noche en caldo Minca a 37°C. Las células fueron infectadas de 3 a 6 horas, lavadas con
PBS para eliminar las bacterias no ligadas, fijadas con un 2% de formalina/PBS durante 20 minutos,
y teñidas con Giemsa durante 20 minutos. Los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos de
vidrio para ser observados mediante microscopía óptica. Para la evaluación cuantitativa de la
adherencia bacteriana (tipo salvaje versus mutantes) a las células epiteliales, las mono-capas
celulares fueron tratadas con 1 ml de Triton X-100 al 0,1% durante 5 minutos. Después de la lisis,
las bacterias fueron cuantificadas mediante el metalizado de las suspensiones bacterianas en
diluciones 10 veces mayores. Las cuantificaciones se realizaron por triplicado en 3 días diferentes,
y los resultados se expresaron como UFC adheridas. Para evaluar la capacidad de crecimiento de
los mutantes hcpA en comparación con la cepa silvestre, los cultivos nocturnos se estandarizaron a
un OD600 de 1.0 y se diluyeron 1:100 en 100 ml de LB en un frasco de 250 ml. Todos los cultivos se
incubaron a 37°C con agitación (200 rpm). El crecimiento de cada cepa bacteriana se evaluó
midiendo OD600 cada 30 minutos durante un total de 8 horas. Inmunofluorescencia. Se añadieron
anticuerpos primarios anti-HCP a las células fijas de formalina durante 1 hora en suero de caballo
al 10%, seguidos del conjugado secundario apropiado de Alexa Fluor y luego se visualizaron
usando un microscopio Axio Imager 1.0 Zeiss como se describió anteriormente (58). Inhibición de
la adherencia con anticuerpos. Se utilizaron anticuerpos contra la HCP para probar su capacidad de
bloquear la adherencia mediante 3 cepas EHEC O157:H7, es decir, EDL933, 86-24 y 85-170. Antes
del ensayo de adherencia celular HT-29 de 6 horas descrito anteriormente, se incubaron 10 l del
inóculo bacteriano durante 30 minutos con diluciones 1:10, 1:50 y 1:100 de los sueros anti-HCP y
preinmunes por triplicado. El número de bacterias adheridas por célula en cada muestra se
determinó mediante la observación directa de células infectadas de MDBK manchadas por Giemsa
bajo un microscopio de luz. Se observaron al menos 10 campos por muestra y se graficó el
promedio obtenido. Adherencia a los explantes intestinales de cerdo y vaca. Los tejidos animales
para este trabajo se obtuvieron después de la aprobación del protocolo animal ID 07-D/I-009-A/H
aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y el Comité
Institucional de Bioseguridad de la Universidad Estatal de Iowa. Se obtuvo tejido intestinal (íleon y
colon) de cerdos de 3 semanas de edad y colon bovino (un regalo del Laboratorio de Ciencias de la
Carne de la Universidad de Arizona) como se describió anteriormente (61). Los tejidos se
enjuagaron a fondo con tampón HEPES-Hanks (pH 7,4), cortado en trozos de 8,8 mm cuadrados.

Los tejidos fueron incubados durante 6 horas con 10 l de bacterias que crecieron durante la noche
en el caldo Minca para inducir la activación del HCP. Empleamos las cepas EDL933, EDL933hcpA,
EDL933hcpA(pJX22) y EDL933hcpA(pBAD-TOPO). Después de la infección, las bacterias no ligadas
se eliminaron lavándolas con el tampón de HEPESHanks, y las bacterias ligadas se separaron
mediante vórtices durante 10 minutos con perlas de vidrio y luego se diluyeron en serie y se
recubrieron con agar de sorbitol Mac-Conkey para obtener UFC. Los resultados mostrados son la
media de 3 experimentos realizados por triplicado. Estadísticas. Los datos correspondientes a los
ensayos de adherencia se compararon utilizando ANOVA y luego la prueba de Tukey. El nivel de
significación fue del 5% en todas las pruebas. Se utilizó el paquete estadístico del SPSS.

Traducción realizada con el traductor www.DeepL.com/Translator