Métodos X 3 (2016) 497-501

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Un biorreactor de ondas reutilizable para la producción

de proteínas en células de insectos

J. Scholz, S. Suppmann*
Instalación básica de bioquímica, Instituto Max-Planck de Bioquímica, Martinsried, Alemania

GRÁFICO ALABSTRACT

ABSTRAC T

Mezcla de olas Los biorreactores han reemplazado cada vez más a los reactores de tanque agitado de acero inoxidable en el inóculo de semillas.
producciones y desarrollos de procesos basados en células de mamíferos. Las bolsas de plástico preesterilizadas de un solo uso se utilizan para el
cultivo, lo que elimina el riesgo de contaminación cruzada y procedimientos de limpieza. Sin embargo, estas ventajas vienen con altos costos de
consumo, que es la principal barrera para una mayor adopción de la tecnología por parte de las instituciones académicas. Como una instalación
básica académica que enfrenta una alta demanda en la producción de proteínas a partir de células de insectos, por lo tanto, hemos desarrollado
una alternativa rentable a las bolsas desechables para olas. En nuestro estudio identificamosfied:
Un biorreactor reutilizable de policarbonato agitado por ondas para la producción de proteínas en células de insectos logra rendimientos de proteínas
comparables a las de las bolsas desechables.
Las ventajas de este biorreactor reutilizable son bajos costos, ciclo de vida largo, flexible configuración de accesorios y
cómodo manejo debido a su forma rígida.
a2016 Max-Planck Instituto de Bioquímica. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo el CC
POR licencia (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

ARTI CLEINF O
Método nombre: Un biorreactor de ondas reutilizable para la producción de proteínas en células de insectos
Palabras clave: Células de insectos, Sf9, Hi5, Exclusivo, Biorreactor, Bolsa de ondas, Producción de proteínas
Historia del artículo: Recibido el 20 de abril de 2016; Aceptado el 3 de agosto de 2016; On-line el 5 de agosto de 2016

* Autor para correspondencia en: Biochemistry Core Facility, Max-Planck-Institute of Biochemistry, D-82152Martinsried, Alemania.
Dirección de correo electrónico: suppmann@biochem.mpg.de (S. Suppmann).

http://dx.doi.org/10.1016/j.mex.2016.08.001
2215-0161 /a2016 Instituto Max-Planck de Bioquímica. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY (http://
creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
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Detalles del método

Preparación de biorreactor

1. Como contenedor de cultivo, se utilizó una caja de policarbonato 500U Eurostandard Typ IV S, TECNIPLAST, Italia, Tamaño
480 375 210 mm, Volumen 38 L, originalmente fabricada para alojamiento de animales. El material es transparente y
esterilizable en autoclave repetidamente a 121 ° C. El primer modelo de Cooper se esterilizó en autoclave y se usó 35
veces sin pérdida de rendimiento.
2. La tapa fue construida internamente. Consiste en policarbonato del tamaño correspondiente y está sellado con una capa
de espuma de goma. Seis abrazaderas metálicas en los cuatro lados garantizan una sujeción firme al contenedor base.

3. Dentro de la tapa, se insertan siete puertos con conectores tanto en el lado interior como en el exterior. Estas inserciones
son roscas de tornillo fabricadas internamente.
una. Dos aberturas son puertos estándar de 13.5Pg para pH o pO opcionales2 sensores (no utilizados en nuestra configuración).
B. Una única abertura de boca ancha de 5,4 cm de diámetro interior sirve como salida de aire, cubierta con
Tapa de silicona C55 (Hirschmann, VWR, Cat No 8905755) y protegida con papel de aluminio durante la esterilización
en autoclave.
Se han introducido otros cuatro puertos (un comodín) con un diámetro interior de 0,5 cm para
C. Entrada de aire estérilfifiltrado a través de un Acro 50, 0,2metrom PTFE filtro, (Pall, P / N 4151), también cubierto con papel de
aluminio para esterilizar en autoclave.
D. Muestreo aséptico con Super Safe Sampler (Infors, Cat No 65373) y tubería interior delgada (ID 2 mm, OD 4 mm), que
permite tomar los volúmenes de muestra más pequeños sin ningún riesgo de introducción
contaminaciones.
mi. Mediofill a través de un tubo largo (exterior de 2,30 m, interior de 24 cm), conectores a través de acero inoxidable rápido

conectados (Stäubli, Cat No RBE06.1806 / IC / OD / JE, RBE06.7806 / IC / JE) a 1 L Schott botella,

presión equilibrada por un Acrodisc CR 0,45metrom PTFE estéril filtro (Pall) para esterilizar en autoclave.
4. Tubos de silicona curados con platino que cumplen con las normas farmacéuticas (Fluidos críticos aplicados, Cat No I-SA P60 40-24-
88, ID 4,0, OD 8,8; Pared de 2,4 mm). Los tubos son aptos para bombas peristálticas y esterilizables en autoclave.

5. El biorreactor y la botella Schott conectada se esterilizan en autoclave (121 C, 15C, 20 minutos). Después de la esterilización, la
botella Schott se puede reemplazar por el depósito de medio o cultivo inicial, por ejemplo. en una botella de 2 L para ser bombeada
al reactor. Este puerto también se puede utilizar para la alimentación por lotes durante el cultivo.

Protocolos de cultivo de células de insectos a pequeña y gran escala

1. Se cultivaron células Sf9 (Life Technologies) o Hi5 (proporcionadas por Gene Center, LMU Munich) en suspensión en Ex-Cell
420 (Sigma, nº de cat. 24420C). El recuento celular, la viabilidad y el diámetro celular se analizaron utilizando el contador
celular Vi-cell XR (Beckman Coulter). Las células se mantuvieron a una densidad 1-
5 106 células / mL y 0,2-5 106 células / mL para células Sf9 y Hi5 respectivamente. El diámetro de la celda es de
aproximadamente 19metromy la viabilidad debe ser superior al 95%. Es importante asegurarse de que las células
tengan aproximadamente esos valores para mantener una alta calidad y reproducibilidad de los experimentos.
2. Las células se cultivaron en incubadoras agitadoras (Infors, 50 mm de diámetro giratorio) a 27 ° C en Erlenmeyer EM.
o Fernbach FB vidrio flpregunta cubierto con Silicon Caps (Hirschmann, VWR) en el siguiente volumen de cultivo
combinaciones de flpreguntar volumen velocidad de agitación: 30mL 250mL EM 120 rpm;
150 ml 1 L EM 120 rpm; 200 a 400 ml 1,8 L FB 90 rpm; 400 ml a 1 L 5 L EM 90 rpm
3. La expresión de baculovirus se realizó de acuerdo con Bac-to-Bac1 protocolo (Life Technologies). Las transfecciones de
bácmidos en células Sf9 se recolectaron después de 3-5 dias. El título del virus se determinó utilizando la línea celular SF9-
ET easy titer[1]. El virus fue amplifieditado en dos pasos subsiguientes para generar reservas de virus Passage 1 y
Passage 2 o utilizado para generar Células de Insecto Infectado por Baculo (BIIC) como se describió anteriormente [2].
Los BIIC congelados a 80 ° C sirvieron tanto para la expresión de proteínas como para el almacenamiento de virus. Para la
expresión de proteínas, las células Hi5 y SF9 se ajustaron a 1 106 células / mL e infectados con stock de virus o BIIC en
diferentes diluciones, típicamente en el rango de 1: 1000-1: 10,000.
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Figura 1. Producción de proteínas en matraces Erlenmeyer, Thomson y Fernbach de 5 L.

validación del método

Para la producción de proteínas a escala de 1 L utilizamos vidrio Erlenmeyer de 5 L flpregunta (modified en forma, ver
Figura 1) y también han probado los Matraces de Crecimiento Óptimo de Thomson (Cat No 931116) fiLleno de 2 litros de
volumen de cultivo. Para evaluar la escala superior a 5 y 10 L, la expresión de proteínas fuefiprimero comparado entre
flpregunta, Wave Desechable Bags (GE Healthcare, Cat No CB0010L10-01), y el biorreactor recientemente desarrollado,
llamado Cooper. Ambos contenedores se agitaron en un Wave System 20/50 EH. Los parámetros previamente optimizados a
pequeña escala fueron: temperatura 26 C; tiempo de producción 72h; densidad celular en la infección 1 106 células / mL. Las
velocidades y ángulos de balanceo óptimos se optimizaron individualmente para ambos biorreactores en función de la
viabilidad celular y la productividad de una proteína objetivo Zyx-LIM-eGFP. ForWave Bags, una velocidad de balanceo y un
ángulo de 28 rpm y 9 respectivamente, fueron recomendados por el fabricante y dieron como resultado la mejor
productividad (tabla 1). Para el biorreactor Cooper, la velocidad y el ángulo de oscilación se adaptaron para lograr unfl
uidwave comparable a TheWave Bag, así como máxima viabilidad celular y productividad ZyxLIM-eGFP. Los parámetros
resultantes fueron 30 rpm y 7,5. En resumen, la productividad de Zyx-LIM-eGFP fue comparable en todos los contenedores
de cultivo probados como se muestra entabla 1. Alentados por los resultados, a continuación se comparó la productividad a
una escala de 5 L en Wave Bags versus Cooper Bioreactor para tres proteínas más. El rendimiento, la concentración y la
pureza de proteínas en el biorreactor reutilizable fueron comparables en Cooper y Wave Bags (Tabla 2 y Figura 2). Las
comparaciones de los parámetros celulares en la cosecha muestran una mayor viabilidad celular en tres de cada cuatro
producciones de Wave Bag. A pesar de haber omitido cualquier reactivo antiespumante en el medio ExCell 420, no se
observó formación de espuma en ambos biorreactores, como se ilustra en el Resumen gráfico que muestra la producción de
Zyx-LIM-eGFP en el biorreactor Cooper.

Información Adicional

El espacio se está volviendo rápidamente limitado cuando se amplían los cultivos en suspensión de células de insectos
para la producción. Un agitador Infors tiene capacidad para 6 Erlenmeyer de 5 Lflpregunta, dando una capacidad de
producción de 6 L. Existen diferentes soluciones para esa limitación de espacio, cuya elección depende en gran medida del
equipo individual disponible. Los más comunes son los biorreactores, especialmente en la industria farmacéutica, aunque
menos representados en los laboratorios académicos. En los últimos años, han surgido opciones alternativas, como
protocolos de alta densidad celular.[4] o recipientes de cultivo que pueden ser fillenado hasta 5 L [5]. Teniendo disponibles
los biorreactores de tanque agitado y las plataformas de olas de Labfors, invertimos esfuerzos en el cultivo de biorreactores.
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tabla 1
Productividad en diferentes contenedores de cultivo.

Tipo de contenedor Volumen del contenedor Volumen de cultivo Rendimiento mg / L

Vidrio Fernbach 1.8L 0,5 L 29

Vidrio Fernbach 2,8 litros 0,8 litros 21
Vidrio Erlenmeyer 5 litros 1 litro 24
Matraz Óptimo Thomson 5 litros 2 litros 25
Bolso Wave 10 litros 5 litros 21
cobre 38 litros 5 litros 26

His-mZyx-LIM-eGFP (Limdomain frommouse Zyxin, Uniprot Q62523, fusionado a eGFP;) se produjo durante 72 h en células HI5. Proteína
era purified por un paso de metal inmovilizado afficromatografía de nitidez.

Tabla 2
Comparación de la producción de proteínas en Wave Bag versus Cooper.

Proteína Producir Células Viabilidad en Diámetro a la infección Viabilidad en la cosecha Diámetro en

(mg / L) infección (%) (metrometro) la cosecha (%)
(metrometro)

eGFP Cooper 34 Hola 5 96 19 75 25

eGFP Wave 39 Hola 5 96 20 84 25
ODC1Cooper 34 Hola 5 94 20 70 25
Onda ODC1 33 Hola 5 97 20 77 26
Spd-5 Cooper 83 SF9 97 21 80 27
Onda Spd-5 56 SF9 97 21 87 29
Zyx-LIM-eGFP 26 Hola 5 93 21 78 27
cobre
Zyx-LIM-eGFP 21 Hola 5 93 21 68 26
Onda

Las células estaban infectadas en 1 106 células / mL. Las proteínas se produjeron a una escala de 5 L durante 72 h. Todas las proteínas fueron etiquetadas con His y purifieditado por

un paso inmovilizado afficromatografía de nitidez. ODC1 (Ornitindecarboxilasa de Homo sapiens, Uniprot P11926; modified); Spd-5 ([3],C. elegans,
Uniprot P91349).

El nivel superior a 5 L fue fiPrimero realizado en un biorreactor de tanque agitado (Labfors, Infors, 7.5 L) adaptado a
cultivo de células de insectos con pH y pO integrados2 medición y regulación. Niveles de expresión
eran comparables a flpreguntar expresión (datos no mostrados). Lo más interesante fue el hecho de que el pH y la pO2
fue muy estable durante todo el proceso de cultivo y producción de proteínas y no necesitó
corrección. Como consecuencia, la configuración bastante laboriosa del biorreactor de tanque agitado de Labfors

Figura 2. SDS-PAGE teñido con Coomassie de proteínas producidas en biorreactores Wave y Cooper y purified por One-Step Immobilized Affi
cromatografía nity. La concentración de proteínas se midió mediante tinción de Bradford.
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fue descontinuado y reemplazado por Wave Bags. La ventaja de la agitación Wave-Mixed es la effidistribución de nutrientes,
suspensión de células fuera del fondo y efficiente transferencia de oxígeno sin las dañinas fuerzas de cizallamiento inducidas
por la agitación mecánica y el burbujeo de gas en biorreactores de tanque agitado [6]. Hay una variedad de sistemas
disponibles comercialmente, que difieren en el diseño de la bolsa, los tipos de sensores y el tipo de movimiento de la
plataforma (revisado en[7]). La mezcla es impulsada por el movimiento oscilante de una plataforma y la velocidad de mezcla
se controla modificando la velocidad de oscilación, el ángulo de oscilación,fivolumen de llenado y tasa de aireación de la
bolsa agitada. Con el desarrollo de un biorreactor agitado por ondas reutilizable1 que se pueden operar en estas
plataformas, aprovechamos todas estas ventajas sin aumentar nuestros costos de funcionamiento de los consumibles.
Aparte de esa reducción de costes, se identificaron algunas ventajas más de nuestro biorreactor Wave reutilizable.fied
durante el proceso de evaluación:

1. A pesar de una filtro de calefacción integrado en el sistema Wave, la salida de aire fiEl filtro de una Wave Bag se mojó
ocasionalmente al condensarse agua en el tubo y, como consecuencia, se bloqueó la transferencia de aire. Para evitar
este problema, se insertó como salida de aire un puerto de boca ancha cubierto por una tapa de silicona. Esto garantizó
una circulación de aire sin interrupciones y también aseguró la esterilidad.
2. El fiEl volumen de llenado de la caja es muy flexible en el rango de 2-10 litros
3. Un Wave Bag desechable obtiene su forma al fiLlenándolo de aire y la forma se mantiene mediante la circulación
constante de aire. Por el contrario, el reactor de policarbonato reutilizable tiene una estructura rígida y robusta.
forma que es insensible a errores en intercambio de aire como filtro mojado.
4. El geométrico forma de avión juntos con el la tapa con forma de agarre facilita manejo especialmente en
transporte.

En resumen, este nuevo biorreactor reutilizable es más adecuado para instituciones académicas y
producciones de productos de bajo valor, mientras que para productos de alto valor, se seguirán prefiriendo los
biorreactores de un solo uso. En las instalaciones básicas de bioquímica de MPIB, este biorreactor permitió la producción de
proteínas de alto nivel rentable en células de insectos para satisfacer las crecientes necesidades de los usuarios. Hasta el día
de hoy hemos realizadofiproducciones de fty Cooper en 2-Escala 10 L, entre ellos Spd-5 [3] y ATG1 [8], con una tasa de
contaminación del 0,5% y 35 ciclos de vida del biorreactor Cooper de 1ª generación.

Reconocimiento

MethodsX agradece a los revisores de este artículo por tomarse el tiempo para proporcionar comentarios valiosos.

Referencias

[1] RF Hopkins, D. Esposito, Un método rápido para valorar las reservas de baculovirus utilizando la línea celular Sf-9 Easy Titer, Biotechniques 47
(3) (2009) 785-788.
[2] DJ Wasilko, SE Lee, TIPS: preservación y escalado de células infectadas sin título, Bioprocess. J. (2006) 29-32.
[3] JB Woodruff, et al., Ensamblaje regulado de un andamio de centrosoma supramolecular in vitro, Science 348 (2015) 808-812.
[4] T. Ohki, SV Mikhailenko, T. Arai, S. Ishii, S. Ishiwata, Mejora de los rendimientos de actina recombinante y miosina V-HMM en el sistema de
células de insectos / baculovirus mediante la adición de nutrientes al cultivo de células de alta densidad, J. Muscle Res. Cell Motil.
(2012).
[5] S. Rieffel, S. Roest, J. Klopp, S. Carnal, S. Marti, B. Gerhartz, B. Shrestha, Cultivos de células de insectos en botellas de reactivo, Métodos X 1
(2014) e155-e161.
[6] V. Singh, Biorreactor desechable para cultivo celular mediante agitación inducida por ondas, Cytotechnology 30 (1999) 149-158.
[7] R. Eibl, S. Kaiser, R. Lombriser, D. Eibl, Biorreactor desechable: el estado actual de la técnica y las aplicaciones recomendadas en biotecnología,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 86 (2010) 41-49.
[8] Y. Rao, MG Perna, B. Hofmann, V. Beier, T. Wollert, The Atg1-El complejo quinasa une las vesículas Atg9 para iniciar la autofagia, Nat. Comun. 7
(2016) 10338, doi: http://dx.doi.org/10.1038/ncomms10338.

1
El Cooper Bioreactor está sujeto a un Modelo de Utilidad de Protección No 2 398 487-0001.