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Obtencin de cido ctrico por fermentacin con aspergillus niger utilizando sustrato de pltano dominico hartn (musa aab simmonds) maduro
Obtaining of citric acid trough fermentation with aspergillus niger using substratum of ripe dominico hartn plantain (musa aab simmonds)
Velsquez, J. A.I,II Beltrn, D.I Padilla, L.I y Giraldo, G.III

Resumen. Los frutos de pltano Dominico Hartn (Musa AAB Simmonds) en estado maduro se utilizaron en la elaboracin de un sustrato lquido a partir de la pulpa. Al sustrato se le determin el contenido de Mn, Zn, Fe, Mg, Cu, N y P, para evaluar si la concentracin de los metales estaba dentro de los rangos permitidos para los procesos metablicos del Aspergillus niger, descartndose la adicin o remocin de alguno de stos. En el trabajo del que da cuenta este artculo se obtuvo cido ctrico a partir de sustrato de pulpa de pltano Dominico Hartn en estado maduro, empleando la cepa del hongo Aspergillus niger (donada por la universidad EAFIT). Se utiliz un inculo al 5% de suspensin de esporas (concentracin aproximada de 1.0X107 esporas/mL) para proceso de fermentacin por lotes, se utiliz un volumen de 2 litros de sustrato de pltano al cual se le ajustaron el pH y la concentracin de azucares reductores, para alcanzar el mejor rendimiento en la obtencin de cido. En la evaluacin de la eficiencia de produccin se obtuvieron 13.5 g/L de cido ctrico. Palabras clave: Pltano, cido ctrico, Aspergillus niger. Abstract. Ripe Dominico Hartn plantain fruits (Musa AAB Simmonds) were used in the elaboration of a liquid substratum from the pulp. Contents of Mn, Zn, Fe, Mg, Cu, N and P in the substratum were determined, in order to evaluate if the concentration of the metals was among the appropriate ranges for the metabolic processes of Aspergillus niger, being discarded the addition or removal of some of these metals. In this paper we present some results of a work performed in order to obtain citric acid from substratum made with ripe Dominico Hartn pulp, using the stump of the Aspergillus niger fungus (donated by EAFIT university). It was used an inoculate to 5% of suspension of spores (approximate concentration of 1.0X107 spores/mL) for the in-batch fermentation process. A volume of 2 liters of banana substratum was used,

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Laboratorio Diseo de Nuevos Productos, Universidad del Quindo. Calle 12 Norte Cra 15, Armenia, Colombia. johnalexvelasquez@gmail.com Director del Grupo de Investigacin Agroindustria de Frutas Tropicales perteneciente a la Universidad del Quindo, Ingeniera de Alimentos.

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whose pH and concentration of sugar reducers were adjusted, in order to reach the best yield in the acid obtaining. In the evaluation of the production efficiency 13.5 g/L of citric acid were obtained. Key words: Plantain, citric acid, Aspergillus niger.

1. INTRODUCCIN El cido ctrico ha sido conocido como una sustancia natural de las plantas desde finales del siglo XIX, y desde 1893 los cientficos saben que es producido por hongos filamentosos. En 1923 se inici la primera fermentacin prctica para la produccin de este cido orgnico utilizando microorganismos que crecan sobre la superficie de los cultivos (1). En la actualidad el uso de hongos para la elaboracin de importantes productos comerciales ha aumentado rpidamente en los ltimos tiempos (2), instaurando un marco en el cual el cido ctrico se ha posicionado como el mayor cido orgnico producido por fermentacin con Aspergillus niger, a la vez que es ampliamente usado en la industria de alimentos, bebidas, farmacutica, qumica entre otras (3). Los microorganismos capaces de producir y acumular cido ctrico son las especies de los gneros Aspergillus, Citromyces, Penicillium, Monilia, Candida y Pichia, aunque para la produccin comercial slo se utilizan mutantes de Aspergillus niger. Comparados con las cepas de Penicillium, los Aspergillus producen ms cido por unidad de tiempo, debido a que presentan baja actividad de las enzimas isocitrato deshidrogenasa y aconitasa hidratasa, y una alta actividad de citrato sintetasa. Las anteriores constituyen ventajas importantes si se toma en cuenta que adems la formacin de productos laterales no deseados como cido oxlico, cido isoctrico y cido glucnico puede ser fcilmente suprimida en estos mutantes (4). En Colombia inicialmente se emple azcar refinada como materia prima para la obtencin de cido ctrico en Sucromiles, generando un alto costo de produccin. Con los aos se han buscado nuevas alternativas de produccin ms econmicas y se ha logrado cultivar A. niger con azcar morena obteniendo buenos resultados, pero el costo an es alto (5). En cuanto a la produccin de cido ctrico, Grewal y Kalra (6) afirman que el pH inicial requerido depende de la fuente de carbono utilizada, y Ruijter y sus colegas (7) mencionan que los hongos filamentosos Aspergillus niger acumulan altas concentraciones de cido ctrico a partir de hexosas o disacridos cuando es cultivado bajo

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condiciones particulares. El pltano Dominico Hartn en estado maduro es un fruto rico en carbohidratos, por lo que en el trabajo del que ac damos cuenta se emple como sustrato en un proceso de fermentacin por lotes, utilizando como agente fermentante el hongo Aspergillus niger, y evaluando el pH inicial y la concentracin del sustrato sobre la produccin de cido ctrico. 2. MATERIALES Y MTODOS 2.1 Sustrato de pltano Dominico Hartn El sustrato de pltano empleado en las fermentaciones se obtuvo con frutos en estado maduro, con rangos de color en la cscara para L* 64.310.33, para a* 7.310.89 y para b* 48.590.76. Se utilizaron los frutos sin cscara para la elaboracin del sustrato, tomando 100 g de pulpa fresca y 100 mL de agua destilada, los cuales se licuaron hasta obtener un lquido homogneo que fue prensado manualmente utilizando un lienzo, y posteriormente filtrado por gravedad y esterilizado en un autoclave a 120C durante 15 minutos para su posterior utilizacin como sustrato en las fermentaciones. 2.2 Cultivo Se emple la cepa de Aspergillus niger, donada por el centro de biotecnologa de la universidad EAFIT, sede Medelln. La preparacin del preinculo se realiz con base en la metodologa descrita por Delgado (8), desarrollando el proceso en una cabina de flujo laminar para evitar la contaminacin de los tubos inoculados. La preparacin de la suspensin de esporas se hizo conforme a la metodologa descrita por Sez y colegas (5): para lograr homogeneidad en el inculo se mezcl la suspensin de varios tubos y se inocul el sustrato de pltano maduro Dominico Hartn (Musa AAB Simmonds) con 5% de suspensin de esporas a una concentracin de 1.0X107 esporas/mL. Para todos los cultivos microbiolgicos se utiliz un fermentador tipo tanque agitado con capacidad para 5 L, utilizando un volumen de trabajo de 2 L. El fermentador consta de un sistema de agitacin de dos turbinas provistas de 6 paletas con eje vertical, operando a una velocidad de agitacin de 350 rpm. La temperatura de incubacin se mantuvo constante a 30 1C durante el periodo de fermentacin y se mantuvo una velocidad de flujo de aire en 1 vvm. Se emple como antiespumante 10% de polietilenglicol de uso industrial. El porcentaje de saturacin de oxgeno se mantuvo por encima de 75%. El pH del sustrato se ajust al valor deseado con adicin de HCl o NaOH 1.0 N, la concentracin de 100 g/L de azucares reductores

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en el sustrato se emple para evaluar el pH inicial de 4.0, 5.0 y 6.0. Para evaluar la concentracin del sustrato se ajust, diluyendo con agua o aumentando la concentracin utilizando rotavapor a 60 C y 75 mbar, para evaluar las concentraciones de 50, 100 y 150 g/L de azucares reductores, se utiliz el pH inicial de 5.0. Se tomaron las muestras cada 0, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 horas para realizar los respectivos anlisis. 2.3 Mtodos de anlisis El contenido de Mn, Zn, Fe, Mg y Cu se determin por absorcin atmica, empleando la metodologa para anlisis de minerales en jugos de frutas descrita por Ross y Price (9). El nitrgeno se cuantific por el mtodo de kjeldhal (10). La concentracin de fsforo se determin mediante U.V. visible empleando la metodologa de Norma (11). La concentracin de la solucin de esporas se cuantific en una cmara de Neubauer, y por dilucin se obtuvo la concentracin deseada para la inoculacin. Para la determinacin de biomasa se utiliz el mtodo de peso seco, mediante el cual se separ la biomasa del medio empleando filtracin por gravedad. La biomasa obtenida se sec en una estufa a 80C, posteriormente se registr su peso hasta obtener peso constante en la muestra. Los azcares reductores se cuantificaron empleando la metodologa descrita por Miller (12), mediante el uso del mtodo colorimtrico del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS). La concentracin de cido ctrico se determin por el mtodo espectrofotomtrico reportado por Marrier and Boulet (13), utilizando un espectrofotmetro U.V. visible. Se emple el mtodo emprico para evaluar las variables en el proceso fermentativo. Este mtodo tradicional emplea la estrategia de un factor al tiempo e involucra la variacin de un factor mientras que los otros permanecen constantes bajo unas condiciones especficas. Slo es til cuando se aplica a pocas variables, es simple de manejar y permite la interpretacin de resultados sin anlisis estadstico (14). 3. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.1 Sustrato de pltano De acuerdo a los resultados obtenidos sobre el anlisis de los metales en el sustrato (Tabla 1), se encontr que no se requiere ningn tratamiento previo para remocin de los mismos, debido a que los metales no estn en lmites extremos que puedan afectar el proceso de fermentacin sumergida para la produccin de cido ctrico. El Aspergillus niger produce poco cido ctrico a niveles bajos de Mn2+, debido a

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que afecta la actividad enzimtica en el ciclo de krebs (excepto la citrato sintetasa). As mismo se reportan prdidas en el rendimiento del 10 y 50% cuando se emplean melazas de remolacha con concentraciones de manganeso de 1 y 10 ppm respectivamente (6,15). El resultado en este trabajo se encuentra dentro de los valores aceptables para la produccin de cido ctrico, si se toma en cuenta que Moresi y Parente citan valores ptimos de concentracin de Zn2+ en un rango entre 0.2 a 1.5 ppm en los cuales el nivel superior (1.5 ppm) es usado para contrarrestar el efecto txico del Fe2+ y Mn2+ (16), se concluir que el resultado obtenido se encuentra en los lmites de referencia para la fermentacin. Papagianni seala que la produccin de cido ctrico con A. niger, se alcanza con valores ptimos de Fe2+ de 1.3 ppm, y Yigitoglu afirma que una concentracin de Fe2+ superior a 1 ppm es necesaria para obtener altos rendimientos de cido ctrico, pero que cantidades en exceso interfieren con la acumulacin del cido y favorecen la produccin de cido oxlico (2,15,17). Tambin se ha reportado que la adicin de Mg2+ y Cu2+ en pequeas cantidades incrementa la produccin de cido ctrico (4), Moresi y Parente muestran que rangos de 0.001 a 10.2 ppm de cobre favorecen la produccin de cido ctrico (16); el cobre reduce la participacin del Fe2+ debido a la formacin de compuestos tales como FeS y FeSO4 (15,18), el resultado en este trabajo se encuentra dentro del rango que permite la produccin de cido ctrico.
Elemento Hierro Magnesio Cobre Manganeso Zinc Nitrgeno Fsforo Concentracin 0,771 ppm 149,592 ppm 0,271 ppm 1,048 ppm 2,015 ppm 8,000 ppm 7,330 ppm

Tabla 1. Anlisis del sustrato de pltano Dominico Hartn.

3.2 Fermentacin 3.2.1 Evaluacin del pH El sustrato evaluado se emple como medio de cultivo en los procesos fermentativos por lotes, donde se evalu la produccin de cido ctrico a diferente pH inicial de 4.0, 5.0 y 6.0 (figura 1a).

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1a)
8 7 6 Acido Citrico g/L 5 4 3 2 1 0 -1 -20 0 20 40 60 Horas 80 100 120 140 160 pH6.0 pH5.0 pH4.0

1b)
28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -20 0 20 40 60 Horas 80 100 120 pH6.0 pH5.0 pH4.0

Biomasa g/L

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Parmetros evaluados a diferente pH inicial. Figura 1a. Produccin de cido ctrico. Figura 1b. Produccin de biomasa.

Como lo ilustra la figura 1a, se evidenci la mxima concentracin de 7,33 g/L de cido ctrico a pH 5.0 y 96 horas de proceso fermentativo, y se observ que despus de este periodo la concentracin del cido disminuye gradualmente, coincidiendo con lo reportado por Gkhan y sus colegas (19), quienes al utilizar un sustrato de

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remolacha como medio de cultivo obtuvieron la mxima produccin de cido ctrico a los cuatro das y a partir de este periodo la produccin decreci, debido a la disminucin de la fuente de carbono en el sustrato y su repercusin en la muerte del microorganismo. Este fenmeno se observa en la figura 1b, donde se muestran las fases de crecimiento del Aspergillus niger en el sustrato de pltano bajo diferentes pH. En ella para el pH de 5.0, no se hace evidente la fase de latencia, debido que en las primeras 24 horas ya existe un crecimiento micelial, indicando que esta fase se encuentra entre 0 y 24 horas. A partir de este periodo y hasta las 48 horas se presenta la fase exponencial, seguida por la fase estacionaria, que se extiende desde las 48 a las 96 horas, y por ltimo se presenta la fase de muerte a partir de las 96 horas. Al evaluar el factor del pH sobre la produccin de cido ctrico y el crecimiento del hongo, se evidenci el factor inhibidor de la disposicin de la fuente de carbono, por lo que se plante evaluar la concentracin de azucares reductores en el sustrato. 3.2.2 Evaluacin de la concentracin de azcares Se utilizaron concentraciones en el sustrato de pltano de 50, 100 y 150 g/L de azucares reductores, con el fin de evaluar la influencia de este factor sobre la produccin de cido ctrico y el crecimiento del Aspergillus niger. 2a)
14 12 Acido Citrico g/L 10 8 6 4 2 0 -2 0 50 100 Horas 150 200 conc.150 conc.100 conc.50

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2b)
conc.150 conc.100 conc.50

35 30 25 Biomasa g/L 20 15 10 5 0 -5 0 50 100 Horas 150

200

Parmetros evaluados a diferente concentracin de azucares. Figura 2a. Produccin de cido ctrico. Figura 2b. Produccin de biomasa.

En la figura 2a se muestra la produccin de cido ctrico a diferentes concentraciones de azcares. Se evidencia que la concentracin de 150 g/L, muestra la mayor produccin de 13,5 g/L de cido ctrico a las 196 horas del proceso fermentativo, y que la produccin de cido aumenta conforme aumenta la concentracin de azcares reductores, confirmando lo reportado por Papagianni y sus colegas (20), quienes estudiaron la influencia de la concentracin de glucosa sobre la produccin de cido ctrico y crecimiento de A. niger en fermentaciones batch y fed-batch, y reportaron una concentracin final de cido decreciente directamente proporcional con la disminucin de glucosa en el medio. Dicho comportamiento est relacionado con la produccin de biomasa, que aparece relacionada de manera directamente proporcional con la mayor concentracin de azcares reductores en el medio, lo cual se observa en la figura 2b. Adems se muestra que en todas las concentraciones evaluadas se presentan tres de las cuatro fases de crecimiento, sin que se haga evidente la fase de latencia, lo que confirma que se presenta antes de 24 horas. Tambin se observa que a medida que aumenta la concentracin se prolonga la aparicin de las diferentes fases.

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120 14 12 10 8 Azucares Reductores g/L Acido Citrico g/L 6 4 2 0 -2 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 0 50 100 Horas 150 200 6 80 60 40 20 0 50 100 Horas 150 200

a)
100

b)

c)

d)
4 pH 2 0 50 100 Horas 150 200

Biomasa g/L

50

100 Horas

150

200

Fermentacin a pH inicial 5.0 y concentracin inicial de 150 g/L de azucares reductores, donde se muestra. Figura 3a. Produccin de cido ctrico. Figura 3b. Produccin de biomasa. Figura 3c. Consumo de azucares reductores. Figura 3d. Variacin del pH.

Al evaluar el efecto del pH y la concentracin de azcares reductores en el sustrato de pltano sobre la obtencin de cido ctrico, se encontr que los niveles con los que se obtuvo la mayor concentracin de cido fueron a pH de 5.0 y la concentracin de 150 g/L de azcares reductores. El comportamiento sobre la produccin de cido ctrico, biomasa, consumo de azcares reductores y cambio del pH se presentan en las figuras 3a a 3d, dando un mximo de produccin de cido ctrico (13.5 g/L) a las 196 horas. El crecimiento del hongo muestra que la fase exponencial se prolonga debido a la alta disponibilidad de alimento, con lo que la fase estacionaria inicia a las 120 horas y llega hasta las 144 horas, momento a partir del cual se produce la fase de muerte. La concentracin de azcares reductores al inicio de la fermentacin tiene un ligero incremento debido a la hidrlisis de polisacridos que realiza el Aspergillus niger, obtenindose glucosa y fructosa que son la fuente de carbono consumidos por el hongo

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(21), y confirmando lo dicho por Nielsen en su trabajo de modelos de crecimiento de hongos filamentosos, en el cual argumenta que solamente la glucosa y fructosa pueden ser directamente metabolizadas por el Aspergillus niger (22). El pH del medio se estabiliza por debajo de 2.0 a partir de las 96 horas hasta el final del proceso de fermentacin, y est relacionado con la concentracin de azcares reductores, evidenciando que a mayor concentracin de stos mayor produccin de cido ctrico, y por ende mas cido en el medio al final del proceso. La mxima concentracin de cido ctrico reportada por algunos autores empleando medios alternativos como sustrato, y adicin de diversas sustancias para incrementar la concentracin final de cido, fue reportada en el trabajo realizado por Haq y sus colegas (23), quienes obtuvieron 96.1 g/L de cido ctrico, investigando la produccin en melazas de caa y empleando A. niger mutado por induccin U.V y por mtodo qumico. Tambin Nehad (24) investig el efecto de la adicin de aceites naturales a medios de melaza de remolacha, obteniendo 72.8 g/L de cido ctrico, y Lpez y sus colegas (4) investigaron la produccin de cido ctrico en suero de leche y obtuvieron la mxima concentracin de 38 g/L a las 240 horas de fermentacin. De igual manera, Snchez y sus colegas (25) evaluaron la produccin de cido ctrico en suero de leche y obtuvieron 5.7 g/L a las 240 horas de fermentacin, y Kilic y sus compaeros (26) obtuvieron esta misma concentracin de cido ctrico evaluando la concentracin de K4Fe(CN)6, aceite de maz y Hostarex. Samragy y sus colegas (27) evaluaron el efecto del pH inicial, concentracin de metanol y NaCl, en medios de fermentacin de suero de leche, empleando dos cepas diferentes de A. niger, y obteniendo para las dos cepas evaluadas 1.06 y 0.82 g/L de cido ctrico a pH de 3.5 y despus de las 216 horas de fermentacin. Con base en estos valores y la mxima produccin de cido ctrico obtenida en este trabajo (13.5g/L), se considera que es baja comparada con los medios de melaza de caa y remolacha, adems del medio de suero de leche evaluado por Lpez y sus compaeros (4). Sin embargo, a pesar de que el sustrato de pltano es un sustrato complejo, la mxima concentracin de cido ctrico obtenida en este trabajo es superior a los resultados logrados por otros autores que utilizaron medios no convencionales, y mayor a la concentracin reportada por algunos trabajos que emplean aditivos para mejorar la produccin de cido ctrico.

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4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Se encontr que el sustrato de pltano Dominico Hartn no es txico para el crecimiento del hongo filamentoso Aspergillus niger y la produccin de cido ctrico, a pesar de que este medio es un sustrato complejo y no convencional. Se obtuvo la mxima concentracin de 13,5 g/L de acido ctrico, utilizando un pH 5.0 y 150g/L de azcar reductores, a las 192 horas del proceso fermentativo. Resulta necesario evaluar el crecimiento de Aspergillus niger y la produccin de cido ctrico, utilizando sustrato de pltano con concentraciones de azcares reductores mayores a 150 g/L. Tambin sera de utilidad evaluar en el sustrato de pltano diferentes concentraciones de aditivos utilizados para mejorar el crecimiento de Aspergillus niger y la produccin de cido ctrico. AGRADECIMIENTOS Los autores manifiestan su agradecimiento al programa de Qumica de la Universidad del Quindo y al grupo de investigacin Agroindustria de Frutas Tropicales, perteneciente a los programas de Qumica y Ciencias Agroindustriales de la misma universidad. BIBLIOGRAFA
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Referencia

Fecha de recepcin

Fecha de aprobacin Da/mes/ao 27/09/2010

Velsquez J.A., Beltrn D., Padilla L. y Giraldo G. Obtencin de acido ctrico por fermentacin con aspergillus nger utilizando sus- Da/mes/ao trato de pltano dominico hartn (musa aab simmonds) maduro. 23/09/2010 Revista Tumbaga (2010), 5, 135-147

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