Capitulo 2
Replicación de virus
Bosquejo del capítulo
Crecimiento de virus
Reconocimiento del crecimiento viral en la cultura
Replicación de virus
Adjunto archivo
Entrada y Desencubrimiento
Síntesis de proteínas virales y ácidos nucleicos
En el capítulo anterior, los virus se definieron como parásitos intracelulares
obligados que no pueden dirigir ningún proceso biosintético independiente fuera de
la célula huésped. Además, se señaló que la complejidad genética de los virus
varía mucho entre las familias de virus individuales, desde los virus que codifican
solo unas pocas proteínas hasta otros que codifican varios cientos de proteínas.
Dada esta notable diversidad, no es de extrañar que los procesos de replicación
utilizados por virus individuales también sean muy variables. Sin embargo, todos
los virus deben seguir los mismos pasos generales para que se produzca la
replicación. Específicamente, todos los virus deben adherirse a una célula
hospedadora susceptible, ingresar a la célula, desensamblar la partícula del virus
(desencadenar), replicar su propio material genético y expresar las proteínas
asociadas, ensamblar nuevas partículas de virus, y escapar de la célula infectada
(liberación). Este capítulo describirá los procesos generales involucrados en cada
uno de estos pasos.
CRECIMIENTO DE VIRUS
Antes del desarrollo de in vitro técnicas de cultivo celular, los virus debían
propagarse en su hospedador natural. Para los virus bacterianos
(bacteriófagos), este fue un proceso relativamente simple. En consecuencia,
los científicos pudieron desarrollar métodos de investigación basados en
laboratorio para estudiar bacteriófagos mucho antes de poder realizar estudios
comparables con virus de plantas o animales. Para los virus animales, se
recolectaron muestras de los animales afectados y se utilizaron para infectar a
otros animales, inicialmente de la misma especie. Cuando se obtuvieron
resultados consistentes, generalmente se intentó determinar si otras especies
también podrían ser susceptibles. Este tipo de experimentos se realizaron
Virología veterinaria de Fenner. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-800946-8.00002-7
© 2017 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
17 Ejemplos representativos de ensamblaje y lanzamiento de estrategias de 28
18 replicación de virus 39
21 Ensayos cuantitativos de virus 41
22 Ensayos físicos 42
24 Ensayos biológicos 43
28 Caso especial de partículas defectuosas que interfieren (DI) 44
en un esfuerzo por determinar el rango de hospedadores de cualquier presunto
agente viral. Si bien se avanzó en la definición de las propiedades biológicas de
los virus, esta forma de propagación tenía evidentes inconvenientes importantes,
especialmente con los virus que afectan a animales grandes. Un problema más
grave fue el estado de infección de los animales receptores. Por ejemplo, un
agente infeccioso no detectado en una oveja podría alterar los signos clínicos
observados después de la inoculación de esa oveja con el agente de prueba, y
las muestras recolectadas de este individuo ahora podrían incluir varios agentes
infecciosos, lo que podría confundir los experimentos futuros. En un intento por
evitar este tipo de problema de contaminación, los animales que se iban a utilizar
en estudios de investigación se criaron en condiciones más definidas. A medida
que se descubrieron nuevos agentes infecciosos y se desarrollaron pruebas para
su detección, libre de patógenos específicos ”(SPF) nació el animal. Es de
destacar; sin embargo, los animales que se pensaba que estaban libres de
patógenos específicos podrían infectarse con patógenos que aún no estaban
definidos o no declarados. Por ejemplo, el virus de la neumonía de los ratones
(neumovirus de ratón) se descubrió cuando animales de control "no infectados"
inoculados con extractos de pulmón de otros animales de control murieron
durante estudios experimentales de infección por virus de la influenza. Muchos de
los primeros estudios virológicos e inmunológicos se vieron comprometidos por el
uso de roedores infectados sin saberlo con el virus de la hepatitis del ratón, el
virus que eleva la lactato deshidrogenasa u otros agentes. Aunque los animales
vivos ya no se usan comúnmente para el aislamiento / propagación de virus de
rutina, los animales todavía se usan ampliamente para evaluar propiedades
virales como virulencia, patogénesis e inmunogenicidad.
La búsqueda de sistemas de cultivo adecuados para la propagación y el
estudio de virus llevó al descubrimiento, en 1931,
17
18 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
que el virus de la vacuna y el virus del herpes simple podían desarrollarse en la
membrana corioalantoidea de huevos de gallina embrionados, como ya se sabía
para el virus de la viruela aviar, un patógeno de las aves. Pronto se determinó que
los virus de muchas familias de virus animales pueden cultivarse en huevos
embrionados, probablemente debido a la amplia variedad de tipos de células y
tejidos presentes en el embrión en desarrollo y su entorno. En consecuencia, el
huevo de gallina embrionado se convirtió en un sistema de cultivo estándar para el
aislamiento y la propagación de rutina de virus aviares y virus de mamíferos
seleccionados. En algunos casos, los huevos embrionados reemplazaron por
completo a los animales de investigación para el crecimiento de las reservas de
virus, y si la infección viral resultó en la muerte del embrión, este sistema también
podría usarse para cuantificar (valorar) la cantidad de virus en una reserva o
muestra de virus (como se describe con mayor detalle más adelante en este
capítulo). El sistema de huevos, que requiere mucha mano de obra y es caro, ha
sido reemplazado en gran medida por sistemas basados en cultivos de células de
vertebrados; sin embargo, todavía se usa ampliamente para el aislamiento y el
crecimiento de los virus de la influenza y muchos virus aviares.
Varios in vitro Se han utilizado sistemas de cultivo celular desde que
se desarrolló un medio artificial para mantener la viabilidad celular fuera
del animal de origen. Estos incluyen cultivos de órganos, cultivos de
explantes, cultivos de células primarias y líneas celulares. Un cultivo de
órganos consiste en un órgano intacto, que mantiene la diversidad celular
y la estructura tridimensional del tejido. Los cultivos de órganos se utilizan
para experimentos a corto plazo. Los cultivos de explantes consisten en
porciones (p. Ej., Un corte o fragmento) de un órgano o tejido. Aunque los
cultivos de explantes carecen de la complejidad del órgano intacto, sus
componentes celulares existen en un estado que modela más de cerca la en infeccioso pertinente. Los protocolos estándar para el uso de suero en sistemas
vivo medio ambiente que las células propagadas como cultivos celulares
primarios o líneas celulares. La creación de cultivos de células primarias
utiliza proteasas como la tripsina o la colagenasa para disociar las células
individuales de un tejido determinado, como el riñón o el pulmón fetal. A
continuación, se permite que las células individuales se adhieran a una
matriz de cultivo celular en la que se dividirán para un número limitado de
divisiones celulares. La vida útil limitada de la mayoría de las células
primarias requiere la producción continua de células a partir de nuevas
fuentes de tejido, lo que puede conducir a una calidad celular variable
entre lotes. Este problema se superó en gran medida con la generación de
líneas celulares inmortalizadas, que en teoría son capaces de divisiones
celulares ilimitadas. Inicialmente,
El advenimiento de in vitro El cultivo de células animales alineó los
estudios de investigación sobre virus animales con los relacionados con
bacteriófagos y mejoró la calidad y fiabilidad de las pruebas de diagnóstico.
La capacidad de aislar y propagar virus animales en células cultivadas
también lo hizo
Es posible identificar los virus como agentes etiológicos de enfermedades
específicas mediante la aplicación exitosa de los postulados de Koch. El
cumplimiento de los postulados de Koch requiere que el agente infeccioso se
aísle en cultivo puro; un logro que no era posible para los virus antes del
desarrollo de los sistemas de cultivo celular. El reemplazo de animales vivos por
sistemas de cultivo celular disminuyó, pero no eliminó por completo, los
problemas asociados con la presencia de virus adventicios. Por ejemplo, los
primeros lotes de la vacuna contra el poliovirus vivo modificado se contaminaron
con el virus SV40, un poliomavirus de simio que se origina en los cultivos
primarios de riñón de mono utilizados para la producción de vacunas. Similitud,
La interpretación de los resultados de algunos estudios iniciales sobre los virus
de la parainfluenza recientemente descritos es complicada debido a la
contaminación vírica de los cultivos celulares utilizados para el aislamiento del
virus. La contaminación de cultivos de células de rumiantes con el virus de la
diarrea viral bovina ha sido un problema especialmente insidioso y generalizado.
Algunas líneas y cultivos celulares contaminados probablemente se derivaron de
tejido bovino fetal infectado, pero con mucha más frecuencia, las células se
infectaron por exposición a suero bovino fetal contaminado con el virus de la
diarrea viral bovina. El suero fetal bovino se convirtió en un suplemento estándar
para el medio de cultivo celular a principios de la década de 1970. El hecho de
que muchas líneas celulares de rumiantes se hayan infectado a partir de suero
contaminado ha comprometido muchas investigaciones relacionadas con la
virología y la inmunología de rumiantes. confundió las pruebas de diagnóstico
para el virus de la diarrea viral bovina y causó pérdidas económicas sustanciales
como resultado de las vacunas contaminadas. El alcance del problema no se
definió completamente hasta finales de la década de 1980, cuando se dispuso de
reactivos de diagnóstico de alta calidad. Al igual que con los animales de
experimentación, los problemas con las infecciones virales contaminantes de los
cultivos celulares solo se definieron cuando se conoció la existencia del agente
de producción biológica requieren ahora la irradiación del suero para inactivar
todos los virus, conocidos o desconocidos. Con la tecnología actual que permite
la amplificación y detección de prácticamente todas las especies de ácidos
nucleicos en las células, junto con la secuenciación rápida de estos productos,
ahora es factible un perfil completo de cultivos celulares para organismos
contaminantes.
Reconocimiento del crecimiento viral en la cultura
Antes del desarrollo de los sistemas de cultivo celular, la identificación de la presencia
de un agente viral en un hospedador vegetal o animal dependía del reconocimiento de
signos que no se encontraban en un hospedador no afectado (control), siendo la
muerte el resultado más extremo y el más fácil de determinar. De manera similar, la
presencia de un virus replicante en células cultivadas puede detectarse identificando
características celulares específicas que surgen como consecuencia de la infección
por virus. En términos generales, cualquier

FIGURA 2.1 Efectos citopáticos producidos por diferentes virus. Las monocapas de células se muestran como normalmente se verían por microscopía de contraste de fase, sin fijar ni teñir. (A) Reovirus
aviar en células Vero con sincitio prominente (flecha). (B) Herpesvirus no tipificado en células pulmonares felinas. (C) Virus de la diarrea viral bovina en células primarias de riñón bovino. (D) Virus de la
parainfluenza 3 en células Vero detectado por hemadsorción de glóbulos rojos de pollo.
Cortesía de E. Dubovi, Cornell University.
La característica celular observable que está presente en las células infectadas por
virus y que está ausente en las células no infectadas mantenidas en condiciones
de crecimiento idénticas se denomina efecto citopático (CPE). Las formas de ECP
inducidas por virus se observan generalmente mediante un examen microscópico
del sistema de cultivo de prueba ( Figura 2.1 ). Las formas más comunes de CPE
observadas en células cultivadas son la lisis celular y cambios significativos en la
morfología celular. Los ejemplos de cambios morfológicos incluyen el redondeo,
agrupamiento, encogimiento y desprendimiento de células individuales de la matriz
del cultivo celular. La fusión de células vecinas inducida por virus representa otra
forma de ECP. Por ejemplo, las células infectadas con reovirus aviar comúnmente
se fusionan para formar células multinucleadas o sincitios ( Figura 2.1A ). Muchos
miembros de la familia
Paramyxoviridae puede causar este tipo de cambio morfológico en células
cultivadas, pero el grado de formación de sincitio depende del tipo de célula. El tipo
de citopatología que se observa en el cultivo puede ser característico de una
determinada clase de virus. Para
ejemplo, alfaherpesvirus Produce
citopatología caracterizada por células redondeadas, con o sin pequeños sincitios,
que se propaga muy rápidamente a través de un cultivo celular susceptible ( Figura
2.1B ).
Las células infectadas con algunos tipos de virus adquieren la capacidad de
unirse (adsorber) a los glóbulos rojos (sin., Eritrocitos)
Replicación de virus Capítulo | 2 19
en su superficie; una propiedad denominada hemadsorción. Por ejemplo, las
células infectadas con el virus de la parainfluenza bovina 3 adsorben glóbulos
rojos de pollo en la membrana plasmática ( Figura 2.1D ). La unión de los
glóbulos rojos a la superficie de la célula infectada en realidad está mediada
por glicoproteínas virales que se expresan en la superficie celular y que se
unen a los receptores de los glóbulos rojos. En consecuencia, la
hemadsorción solo ocurre con virus que brotan de la membrana plasmática y
puede ser específica para los glóbulos rojos de una especie animal
determinada. Los virus que inducen la hemadsorción también muestran la
capacidad de hemaglutinar los glóbulos rojos en un medio libre de células.
Como se analiza más adelante en el capítulo, esta propiedad se puede
utilizar como base para cuantificar la cantidad de virus en una muestra. Las
mismas proteínas virales que permiten la hemadsorción también son
responsables de la reacción de hemaglutinación. Sin embargo, existen virus
que pueden por sí mismos hemaglutinar los glóbulos rojos pero no causar
hemadsorción en las células infectadas con el mismo virus (p. Ej.,
distinto
Otro tipo de cambio morfológico comúnmente observado en células infectadas
por virus es la formación de cuerpos de inclusión ( Figura 2.2 ). Los cuerpos de
inclusión son anomalías intracelulares, comúnmente estructuras nuevas, que surgen
como consecuencia directa de la infección por virus. Los cuerpos de inclusión
pueden ser
20 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
FIGURA 2.2 Inclusiones típicas y morfología celular anormal en células infectadas por virus. (A) Inclusiones de reovirus ( flechas) en células Vero infectadas. (B) Inclusiones de virus del moquillo canino
( flechas) y sincitio puntas de flecha) en células Vero infectadas. (C) Adenovirus bovino 5 inclusiones intranucleares ( flechas) en células primarias de riñón bovino. (D) Micrografía electrónica de
transmisión de una inclusión nuclear de adenovirus no tipificado en células A459.
Cortesía de E. Dubovi, Cornell University.
observado con un microscopio óptico después de la fijación y el tratamiento con
tinciones citológicas, pero, como ocurre con la hemadsorción, no todos los virus
producirán cuerpos de inclusión obvios. El tipo de virus que infecta una célula
puede inferirse por la ubicación y la forma de las inclusiones. Por ejemplo, las
células infectadas con herpesvirus, adenovirus y parvovirus pueden tener
inclusiones intranucleares, mientras que las inclusiones citoplasmáticas son
características de las infecciones por poxvirus, orbivirus y paramixovirus ( Figura
2.2B, C ). La composición de las inclusiones variará según el tipo de virus. Los
cuerpos citoplasmáticos de Negri identificados en las células infectadas por el virus
de la rabia están compuestos por agregados de nucleocápsidas, mientras que las
inclusiones intranucleares que ocurren en las células infectadas por adenovirus
consisten en matrices cristalinas de partículas de virus maduros ( Figura 2.2D ). Las
tinciones citológicas rara vez se utilizan para identificar células infectadas con virus
específicos, pero se utilizan principalmente como prueba de detección para evaluar
la presencia de cualquier virus.
En ausencia de procedimientos de cribado metagenómico, la
detección de virus que no producen citopatología (ECP), no inducen
hemadsorción ni
El hemaglutinato, o no produce inclusiones definibles, se logra mediante
pruebas específicas de virus. Por ejemplo, este es el caso en el cribado de
células bovinas para detectar la presencia del virus de la diarrea viral bovina
no citopática. Las pruebas más utilizadas en este tipo de situaciones son los
ensayos de base inmunológica como el ensayo de anticuerpos
fluorescentes (ensayo de inmunofluorescencia, IFA) o el ensayo de tinción
inmunohistoquímica ( Figura 2.3 ). La calidad de estos ensayos depende de
la especificidad de los anticuerpos que se utilizan. Con el desarrollo de
anticuerpos monoclonales y antisueros monoespecíficos, este problema se
ha resuelto en gran medida. Otras pruebas específicas de virus se basan en
la detección de ácido nucleico específico de virus en las células infectadas.
Inicialmente, los ensayos de este tipo se basaron en el uso de sondas de
ácido nucleico capaces de hibridar de una manera específica de secuencia
con el ácido nucleico diana. Los ensayos basados en hibridación han sido
reemplazados en gran medida por los basados en la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) debido a su mayor sensibilidad y facilidad de
ejecución (consulte el Capítulo 5: Diagnóstico de laboratorio de infecciones
virales).

REPLICACIÓN DE VIRUS
Una característica fundamental que separa a los virus de otras entidades
replicantes es la forma en que se sintetizan las nuevas partículas de virus. A
diferencia de las células eucariotas y procariotas, que aumentan su número a
través de los procesos de mitosis y fisión binaria, respectivamente, las nuevas
partículas de virus se ensamblan de novo a partir de los diversos componentes
estructurales que se sintetizan durante la infección del virus. El reconocimiento
más temprano de este patrón de replicación único provino de estudios que
utilizaron bacteriófagos.
FIGURA 2.3 Detección indirecta de anticuerpos fluorescentes de células infectadas con el virus de
la diarrea viral bovina no citopática (BVDV). Las células bovinas se expusieron a BVDV durante 72
horas y luego se fijaron con acetona fría. Las células fijadas se sondaron con un anticuerpo
monoclonal específico de BVDV (20.10.6) seguido de tinción con suero anti-ratón de cabra
policlonal conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Cortesía de E. Dubovi, Cornell
University.
Replicación de virus Capítulo | 2 21
El esquema de la prueba de concepto experimental fue relativamente simple: (1)
agregar un fago resistente al cloroformo a un cultivo de bacterias durante varios
minutos; (2) enjuague las bacterias para eliminar los fagos no adheridos; (3)
incubar el cultivo y extraer muestras en varios períodos de tiempo; (4) tratar los
cultivos bacterianos muestreados con cloroformo para detener el crecimiento; (5)
cuantifique la cantidad de fagos en cada uno de los períodos de tiempo. El
resultado de este tipo de experimento es lo que ahora llamamos un curva de
crecimiento de un paso, que en principio, se puede realizar con cualquier virus que
se pueda propagar en cultivo celular ( Figura 2.4 ). El hallazgo notable de este tipo
de estudio fue que el virus infeccioso "desapareció" de los cultivos infectados
durante un período de tiempo variable, dependiendo del sistema de la célula
huésped del virus. Esto se conoce como el período de eclipse, y representa el
período de tiempo que comienza con la entrada / desprendimiento de la célula y
termina con la aparición de partículas de virus infecciosas recién formadas.
Después del final del período del eclipse, hay un aumento esencialmente
exponencial en la producción de partículas de virus infecciosos hasta que la célula
huésped es incapaz de mantener su integridad metabólica. Dependiendo del tipo
de virus, puede haber una liberación repentina de partículas de virus después de
la lisis de la célula huésped, como lo ejemplifican los bacteriófagos T-even, o una
liberación prolongada de partículas de virus a través de la gemación sostenida de
partículas de virus en un sitio de la membrana celular, como como ocurre con el
virus de la influenza A.
La curva de crecimiento de un solo paso se puede utilizar para dividir el ciclo
de replicación del virus en sus partes componentes, que incluyen la unión, el
período de eclipse (entrada, desvanecimiento, replicación de las partes
componentes, ensamblaje del virión) y liberación de partículas de virus. Aunque
los ciclos de replicación de todos los virus convencionales siguen estos mismos
FIGURA 2.4 Curva de crecimiento de un paso de un virus no
envuelto. La unión y la penetración van seguidas de un
período de eclipse de 2 12 horas durante el cual no se puede
detectar la infectividad asociada a las células. A esto le sigue
un período de varias horas durante el cual se produce la
maduración del virus. Los viriones de virus no envueltos a
menudo se liberan tarde y de forma incompleta cuando la
célula se lisa. La liberación de la mayoría de los viriones
envueltos ocurre al mismo tiempo que la maduración por
gemación de la membrana plasmática.
22 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
pasos, los detalles de cada paso pueden variar ampliamente según el virus
específico. Por lo tanto, la cinética de la curva de crecimiento en una etapa difiere
con las propiedades únicas del sistema específico de la célula huésped del virus
utilizado. Para garantizar que todos los pasos del ciclo de replicación del virus estén
sincronizados temporalmente, es importante que la infección se inicie con
suficientes partículas de virus para infectar simultáneamente todas las células del
cultivo. Esto se logra mediante el uso de una alta multiplicidad de infección
[típicamente 10 unidades formadoras de placa (ufp) de virus / célula].
A continuación, se presenta una discusión que se centra en los pasos
individuales del ciclo general de replicación del virus. Esta discusión incluye
descripciones ampliadas y detalles de ciclos de replicación completos para
virus modelo que representan cuatro grupos principales [virus de ARN de
cadena positiva (picornavirus), virus de ARN de cadena negativa (rabdovirus),
retrovirus y virus de ADN (adenovirus)]. En la Parte II de este libro se
encuentran discusiones más completas que cubren los detalles específicos de
las familias de virus individuales.
Adjunto archivo
El primer paso crítico en el ciclo de replicación del virus es la unión de la partícula
del virus a la célula huésped. La unión requiere interacciones específicas entre
componentes de la partícula de virus (p. Ej., Proteínas de la cápside o
glicoproteínas de la envoltura) y componentes de la célula huésped (p. Ej., Una
glicoproteína o un resto de carbohidrato). Este proceso puede ser
conceptualmente simple, por lo que la unión puede implicar interacciones entre
un solo componente del virus con un solo componente de la célula. Por ejemplo,
la unión del virus de la influenza A a una célula huésped requiere solo una
interacción entre la glicoproteína de hemaglutinina (HA) viral y un residuo de
ácido siálico en la superficie celular. Alternativamente, las interacciones
relacionadas con el apego pueden ser complejas e implicar interacciones
secuenciales entre múltiples componentes tanto del virus como de la célula. A
continuación se describen ejemplos de este tipo de unión celular en las
discusiones ampliadas de los ciclos de replicación de adenovirus y retrovirus.
Muchas proteínas del huésped no se expresan ampliamente, sino que se
expresan de una manera específica de células o tejidos. Por lo tanto, el uso de
receptores juega un papel importante en la definición de la especificidad de tejido
/ órgano ( tropismo) de un virus. A su vez, la especificidad de tejido y órgano de
un virus define en gran medida su potencial patógeno y la naturaleza de la
enfermedad que causa. De manera similar, los componentes celulares (p. Ej.,
Proteínas, estructuras de carbohidratos, etc.) pueden diferir notablemente entre
organismos, por lo que el uso de receptores también influye en los tipos de
organismos (especies hospedadoras) que un virus puede infectar ( rango de
host).
Las partículas de virus interactúan con moléculas de la superficie celular
que se denominan receptores, correceptores, factores de unión o factores de
entrada, según el papel que desempeñan en los procesos de unión y entrada.
Frecuentemente,
el término "receptor viral" se usa para describir estas moléculas de la superficie celular, que es un
nombre poco apropiado, ya que las células ciertamente no mantienen receptores con el propósito
de unirse a virus. Más bien, los virus han evolucionado para utilizar moléculas de células huésped
que realizan funciones relacionadas con los procesos celulares normales. El contacto inicial de una
partícula de virus con la superficie celular a menudo implica interacciones electrostáticas de corta
distancia con moléculas cargadas como los proteoglicanos heparán sulfato. Este contacto inicial
puede simplemente ayudar a concentrar el virus en la superficie de la célula, lo que facilita el
establecimiento de interacciones más específicas con otras moléculas similares a receptores. La
afinidad de unión entre un componente de virus individual y su ligando celular puede ser baja; sin
embargo, la superficie del virus posee muchos sitios de unión al receptor, por tanto, la afinidad de
unión entre el virus y la célula huésped se ve reforzada por el establecimiento de múltiples
interacciones virus / receptor. Aunque los virus requieren que se exprese al menos un receptor en
la superficie de la célula huésped, algunos virus también deben comprometerse con un receptor o
receptores intracelulares para iniciar una infección productiva. Estas interacciones intracelulares no
juegan un papel en el apego a la célula, sino que son necesarias para las etapas finales del
proceso de entrada / desrevestimiento; y por lo tanto, se discutirá con más detalle a continuación.
algunos virus también deben comprometerse con un receptor o receptores intracelulares para
iniciar una infección productiva. Estas interacciones intracelulares no juegan un papel en el apego
a la célula, sino que son necesarias para las etapas finales del proceso de entrada /
desrevestimiento; y por lo tanto, se discutirá con más detalle a continuación. algunos virus también
deben comprometerse con un receptor o receptores intracelulares para iniciar una infección
productiva. Estas interacciones intracelulares no juegan un papel en el apego a la célula, sino que
son necesarias para las etapas finales del proceso de entrada / desrevestimiento; y por lo tanto, se
discutirá con más detalle a continuación.
La identificación de los factores de la célula huésped que sirven como
receptores para la unión del virus es importante para comprender los detalles
moleculares de los ciclos de replicación de virus específicos y también tiene
implicaciones prácticas, ya que este conocimiento puede informar el diseño de
medicamentos antivirales. En los últimos años, se han identificado numerosos
componentes de la célula huésped capaces de funcionar como receptores / factores
de entrada de virus. Estos incluyen receptores de unión a ligandos (p. Ej.,
Receptores de quimiocinas, receptor de transferrina 1), moléculas de señalización
(p. Ej., CD4), receptores de adhesión / señalización celular (p. Ej., Molécula de
adhesión intercelular 1, ICAM-1), enzimas, integrinas y glicoconjugados. con varios
enlaces de carbohidratos, siendo el ácido siálico un residuo terminal común ( Cuadro
2.1 ). Como se muestra en Cuadro 2.1 , diferentes virus pueden usar el mismo
receptor / factor de entrada (por ejemplo, Coxsackievirus y algunos adenovirus), lo
que da como resultado que estos virus tengan un tropismo celular / tisular
compartido o superpuesto. El número y la identidad de las moléculas de la célula
huésped que desempeñan un papel en las interacciones iniciales del virus con las
células huésped ciertamente aumentará a medida que se identifiquen nuevos virus y
se caractericen mejor los virus existentes.
El proceso de identificación de receptores / factores de entrada es más
complicado de lo que se imaginó inicialmente, ya que los virus dentro de una
familia determinada pueden utilizar diferentes receptores. Además, diferentes
cepas del mismo virus pueden utilizar diferentes receptores y la adaptación de un
virus al crecimiento en cultivo celular puede cambiar el uso del receptor del virus.
Por ejemplo, las cepas naturales del virus de la fiebre aftosa se unen a las
integrinas. en vivo, pero cepas pasadas por cultivo celular
 Replicación de virus Capítulo | 2 23

TABLA 2.1 Ejemplos de macromoléculas celulares utilizadas por virus como virus receptores / factores de entrada

Familia Receptor

Virus de inmunodeficiencia humana Retroviridae CCR5, CCR3, CXCR4 (proteoglicano de heparán sulfato) Proteína TVB

Virus de la leucosis / sarcoma aviar Retroviridae relacionada con el factor de necrosis tisular

Virus de la leucemia murina E Virus Retroviridae MCAT-1

de la leucemia bovina Retroviridae Receptor 1 de BLV

Poliovirus Picornaviridae PVR (CD155) —Familia Ig

Coxsackievirus B Picornaviridae Coxsackievirus y receptor de adenovirus (CAR) - Familia Ig Molécula de

Rinovirus humano 14 Picornaviridae adhesión intercelular 1 d (ICAM-1) - Familia Ig

Ecovirus 1 Picornaviridae α 2 β 1 integrina VLA-2

Virus de la fiebre aftosa: virus de tipo salvaje Picornaviridae Varias integrinas

Virus de la fiebre aftosa: adaptado al cultivo Picornaviridae Proteoglicano de sulfato de heprano

celular

Calicivirus felino Caliciviridae Molécula de adhesión de unión felina-A (fJAM-A) familia CAR-Ig

Adenovirus 2 Adenoviridae

Adenovirus Adenoviridae α v β 3, α v β 5 integrinas

Virus del herpes simple 1 Herpesviridae Mediador de entrada del virus del herpes A (HveA), proteoglicano de heparán
sulfato, otros

Citomegalovirus humano Herpesviridae Proteoglicano de sulfato de heprano

Virus de Epstein Barr Herpesviridae CD21, receptor del complemento 2 (CR2) CD155:

Virus de la pseudorrabia Herpesviridae familia de Ig

Parvovirus felino Parvoviridae Receptor de transferrina-1 (TfR-1)

Virus adenoasociado 5 Parvoviridae α ( 2,3) ácido siálico

Virus de la influenza A Ortomixoviridae Ácido siálico

Virus de la influenza C Ortomixoviridae 9- O- ácido acetilsalico

Virus del moquillo canino Paramyxoviridae Molécula de activación de linfocitos señalizadores (SLAM); Nectina 4 Ácido siálico

Virus de la enfermedad de Newcastle Paramyxoviridae

Virus sincitial respiratorio bovino virus Hendra Paramyxoviridae Desconocido

Paramyxoviridae Efrina-B2

Rotavirus Reoviridae Varias integrinas

Reovirus Reoviridae Moléculas de adhesión a la unión (JAM) Antígeno

Virus de la hepatitis del ratón Coronaviridae carcinoembrionario (CEA): familia de Ig Aminopeptidasa N

Virus de la gastroenteritis transmisible Coronaviridae

Virus de la coriomenigitis linfocítica Arenaviridae α- Dystroglicano

Virus del dengue Flaviviridae Proteoglicano de sulfato de heprano

Virus de la rabia Rhabdoviridae Receptor nicotínico de acetilcolina (nAchR), molécula de adhesión de células neuronales
(NCAM)
24 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica

del virus puede usar heparán sulfato. Este cambio en la especificidad del receptor Entrada y Desencubrimiento
altera la patogenicidad del virus, lo que indica claramente que el uso del receptor
La unión de un virus a un receptor en una célula huésped representa el primer paso en el ciclo de
influye en el proceso de la enfermedad. Se cree que algunos virus con una amplia
replicación; sin embargo, no resultará en una infección productiva a menos que este evento
gama de hospedadores, como los virus transmitidos por artrópodos y algunos de
conduzca a la entrada del virus en la célula con el subsiguiente desprendimiento de la partícula
los alfaherpesvirus, utilizan varios receptores específicos del hospedador
viral y libere el genoma viral en el compartimiento intracelular apropiado (citoplasma o núcleo
diferentes, lo que explica su capacidad para crecer en células de muchos
dependiendo del virus). Aunque la membrana plasmática tiene solo unos 7 nm de grosor, sirve
hospederos. Alternativamente, un virus puede usar un receptor común que se
como una barrera física eficaz que bloquea el paso libre de virus a la célula. Sin embargo, los virus
expresa en múltiples especies de hospedadores. Por ejemplo, recientemente se
han desarrollado una variedad de estrategias para romper esta barrera y obtener acceso al interior
demostró que el virus Sindbis utiliza una proteína llamada proteína de macrófagos
de la célula. Dependiendo del virus específico, el desprendimiento de la partícula del virus ocurre
asociada a resistencia natural (NRAMP) como receptor en células de insectos, y
después de que la partícula ha entrado en la célula o al mismo tiempo que el proceso de entrada
usa el homólogo de mamífero (NRAMP2) para unirse a células de mamífero
de la célula. La partícula de virus es metaestable, lo que significa que su estructura es
cultivadas y en tejidos de ratones. .
generalmente lo suficientemente estable como para moverse como una entidad física de una

célula a otra o de un huésped a otro, pero está preparada para sufrir reordenamientos

estructurales y desmontarse cuando se expone a los estímulos biológicos adecuados. Como se

Se destacan dos problemas adicionales relacionados con el proceso de conexión de
detalla a continuación, los estímulos biológicos que inducen los procesos de entrada y / o
virus / células. Recientemente se propuso un modelo en el que los receptores celulares que
desrevestimiento para diferentes virus incluyen, pero no se limitan a, unión a proteínas específicas
normalmente funcionan en el reconocimiento y aclaramiento de células apoptóticas se utilizan
de la célula huésped, proteólisis por enzimas de la célula huésped y exposición a pH ácido. Esta
para la unión / entrada celular por el virus del dengue y quizás por flavivirus relacionados. Los
sección del capítulo se centrará en los mecanismos generales de entrada del virus en las células
flavivirus brotan a través de la membrana del retículo endoplásmico y, en consecuencia, se
hospedadoras e incluirá varios ejemplos de interacciones específicas entre virus y hospedadores
cree que incorporan fosfatidilserina (PtdSer) en la valva exterior de la envoltura viral. PtdSer
que inician el proceso de desvanecimiento. pero está preparado para sufrir reordenamientos
también se enriquece en la valva externa de la membrana plasmática de las células que
estructurales y desmontarse cuando se expone a los estímulos biológicos adecuados. Como se
sufren apoptosis debido a la reorganización de lípidos, y se une directa o indirectamente a
detalla a continuación, los estímulos biológicos que inducen los procesos de entrada y / o
miembros de las familias TIM y TAM de proteínas receptoras transmembrana,
desrevestimiento para diferentes virus incluyen, pero no se limitan a, unión a proteínas específicas
respectivamente. Las proteínas TIM y TAM son expresadas por varios tipos de células,
de la célula huésped, proteólisis por enzimas de la célula huésped y exposición a pH ácido. Esta
incluidos macrófagos y células dendríticas, que son objetivos normales de la infección por el
sección del capítulo se centrará en los mecanismos generales de entrada del virus en las células
virus del dengue. En circunstancias normales, la unión entre las proteínas TIM / TAM en las
hospedadoras e incluirá varios ejemplos de interacciones específicas entre virus y hospedadores
células mieloides y el PtdSer en las células apoptóticas conduce a la captación y eliminación
que inician el proceso de desvanecimiento. pero está preparado para sufrir reordenamientos
de la célula apoptótica. Al incorporar PtdSer en la envoltura viral, se cree que el virus del
estructurales y desmontarse cuando se expone a los estímulos biológicos adecuados. Como se
dengue imita una célula apoptótica, lo que permite que el virus se una e internalice por las
detalla a continuación, los estímulos biológicos que inducen los procesos de entrada y / o desrevestimiento para diferentes vi
células que expresan las proteínas TIM / TAM. Este mecanismo no parece ser exclusivo de
Una partícula de virus unida (o, a veces, el genoma del virus solo) ingresa
los flavivirus, ya que se ha propuesto un modelo similar para el virus de la vacuna (familia
a una célula huésped por uno de dos mecanismos generales: (1) entrada
permitiendo que el virus se una e internalice por las células que expresan las proteínas TIM /
directa a través de la membrana plasmática o (2) entrada a la célula dentro de
TAM. Este mecanismo no parece ser exclusivo de los flavivirus, ya que se ha propuesto un
una vesícula unida a la membrana. Como se describe a continuación, los virus
modelo similar para el virus de la vacuna (familia permitiendo que el virus se una e internalice
que ingresan a la célula dentro de las vesículas unidas a la membrana aún
por las células que expresan las proteínas TIM / TAM. Este mecanismo no parece ser
deben pasar a través de una membrana limitante para obtener acceso al
exclusivo de los flavivirus, ya que se ha propuesto un modelo similar para el virus de la
citosol. En ambos mecanismos, la (s) molécula (s) receptora (s) ayudan en el
vacuna (familia Poxviridae). Un segundo mecanismo algo indirecto de unión / entrada celular
proceso de entrada, y la naturaleza del receptor puede determinar el
también está mejor ejemplificado por el virus del dengue. Este mecanismo se denomina
mecanismo por el cual el virus ingresa a la célula huésped. Primero se
potenciación de la infección dependiente de anticuerpos, que se produce cuando la partícula
abordarán los mecanismos de entrada directa a través de la membrana
del virus se une a anticuerpos IgG no neutralizantes que, a su vez, se unen activando Fc. γ receptores
plasmática. La entrada celular de los picornavirus se utilizará como ejemplo de
expresados en la superficie de células fagocíticas mononucleares (p. ej., macrófagos). Esta
entrada directa de un virus no envuelto, y el mecanismo presentado se basa en
interacción conduce a la internalización del complejo anticuerpo / virus y, finalmente, a la
el modelo actual para la entrada directa de poliovirus. El poliovirus se adhiere a
liberación del virus infeccioso en el citoplasma de la célula fagocítica. El virus de la fiebre
una célula huésped al unirse al receptor del poliovirus (PVR, CD155). Las
aftosa y el coronavirus felino también pueden infectar células a través de este mecanismo de
interacciones no covalentes establecidas entre el receptor de poliovirus y las
mejora mediado por anticuerpos. in vitro,
proteínas que forman la cápside inducen cambios significativos en la estructura
de la cápside. Más significativamente, una proteína ubicada dentro de la
cápside (VP4) es expulsada de la partícula de virus, y la proteína de la cápside
VP1 sufre cambios conformacionales que hacen que el extremo N hidrófobo de
la proteína se

pero su importancia en el proceso de infección natural es conjetura.


FIGURA 2.5 La cápside icosaédrica de los picornavirus es capaz de crear un poro en el plasma o en la membrana endosomal para inyectar su ARN genómico. Cortesía de ViralZone y Swiss
Institute of Bioinformatics, con autorización. http://education.expasy.org/images/PV_pore.jpg
translocar desde el interior de la cápside a la superficie de la cápside donde
se inserta en la membrana plasmática de la célula huésped. Se cree que las
secuencias N-terminales de múltiples proteínas VP1 se asocian y forman un
poro en la membrana plasmática a través del cual se libera el ARN genómico
en el citoplasma de la célula huésped ( Figura 2.5 ).
Todos los virus envueltos deben mediar en el proceso de fusión de
membranas para ingresar a su célula huésped. Para los virus envueltos que
logran una entrada directa en la superficie celular, se produce la fusión entre la
envoltura del virus y la membrana plasmática, y este proceso se produce en
condiciones de pH neutro (entrada independiente del pH). Este modo de entrada
celular es característico de los paramixovirus (p. Ej., Virus de la enfermedad de
Newcastle y virus del sarampión) y algunos (p. Ej., Virus de inmunodeficiencia
humana, VIH) pero no todos los retrovirus. Las etapas iniciales del proceso de
entrada de estos virus son conceptualmente similares a las del poliovirus en que
la unión del virus a una molécula receptora apropiada estimula cambios
conformacionales en una proteína viral que a su vez facilita el paso del genoma
viral a la célula. En este caso, Los cambios conformacionales ocurren dentro de
una glicoproteína asociada a picos que pasa de una conformación nativa
(conformación de prefusión) a una conformación alternativa (conformación
posfusión) que es capaz de mediar la fusión entre la envoltura viral y la
membrana plasmática. En el caso del virus de la enfermedad de Newcastle, la
unión de los receptores de la célula huésped es realizada por las glicoproteínas
hemaglutinina neuraminidasa (HN), que forman picos homotetraméricos que se
proyectan desde la superficie del virión ( Figura 2.6 ). La unión del receptor
estimula los cambios conformacionales en HN, que a su vez desestabilizan e
inducen cambios conformacionales en una proteína vecina llamada proteína de
fusión (F). Las proteínas F consisten en
Replicación de virus Capítulo | 2 25
heterodímeros (F1 / F2), que se ensamblan en picos homotriméricos. Las
secuencias N-terminales de F1 son altamente hidrófobas y se denominan
"péptido de fusión". Antes de la unión al receptor, las proteínas F asumen su
conformación de prefusión, en la que las secuencias de péptidos de fusión se
secuestran del entorno hidrófilo que rodea al virus. Después de la unión del
receptor por HN, se inducen cambios conformacionales en las proteínas F que
dan como resultado la proyección de los péptidos de fusión hacia la célula
huésped donde se insertan en la bicapa lipídica de la membrana plasmática.
Los continuos cambios de conformación en las proteínas F atraen la
membrana plasmática hacia la envoltura del virus. Cuando las dos
membranas entran en contacto, se produce la mezcla de sus lípidos y,
finalmente, las membranas se fusionan para formar un poro de fusión. A
medida que el poro de fusión aumenta de tamaño, la envoltura viral se
incorpora completamente a la membrana plasmática de la célula y el genoma
del virus se libera en el citoplasma de la célula huésped. En los dos sistemas
de virus que se acaban de describir (poliovirus y virus de la enfermedad de
Newcastle), los procesos de entrada y eliminación de la cubierta ocurren
simultáneamente y solo se inician después de que la partícula del virus se ha
unido a una proteína receptora biológicamente relevante.
Las interacciones naturales de receptor / ligando en la superficie celular a
menudo inician vías de señalización y procesos celulares que conducen a la
internalización del complejo receptor / ligando en una vesícula unida a la
membrana. Muchos virus han desarrollado estrategias para explotar estas
mismas vías de señalización y procesos celulares para ingresar a la célula
huésped. La endocitosis es el mecanismo general por el cual los materiales
extracelulares se internalizan en vesículas unidas a la membrana ( Figura 2.7 ).
Una forma de endocitosis es
26 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica

FIGURA 2.6 Fusión de membrana mediada por el pico de glicoproteína de fusión trimérica (F) del virus de la enfermedad de Newcastle. A. Etapas secuenciales de fusión de membranas y formación de poros de
fusión que involucran la envoltura del virus de la enfermedad de Newcastle y la membrana plasmática de una célula huésped. B. La conformación de prefusión del pico de la glicoproteína F se altera en respuesta a
la unión de un receptor de la célula huésped por el pico de hemaglutinina neuraminidasa (HN). Estos cambios conformacionales dan como resultado la inserción de los componentes de la proteína de fusión de F
en la membrana plasmática de la célula huésped. Los cambios conformacionales continuos en F unen las dos membranas, facilitan la mezcla de componentes lipídicos y conducen a la formación del poro de
fusión.
De Smith, EC, Popa, A., Chang, A., Masante, C., Dutch, RE, 2009. Mecanismos de entrada viral: la creciente diversidad de entrada de paramixovirus.
FEBS J. 276, 7217 7227 http://dx.doi.org/10.1111/j.1742-4658.2009.07401.x . Reproducido con permiso de John Wiley & Sons, Inc.

FIGURA 2.7 Mecanismos endocíticos de entrada celular. La endocitosis en células animales puede ocurrir a través de varios mecanismos diferentes. Varios mecanismos se definen como pinocíticos, es
decir, implican la absorción de líquido, solutos y partículas pequeñas. Estos incluyen mecanismos mediados por clatrina, macropinocitosis, caveolares / mediados en balsa, además de varios mecanismos
novedosos. Algunas de estas vías involucran dinamina-2, como lo indican las perlas alrededor del cuello de las hendiduras endocíticas. Las partículas grandes son captadas por fagocitosis, un proceso
restringido a unos pocos tipos de células. Además, existen vías como la IL-2, la llamada vía GEEC, y las vías dependientes de flotilina y factor de ribosilación de ADP 6 (Arf6) que transportan una carga
celular específica pero que aún no son utilizadas por los virus. Adeno 2/5, Adeno 3, adenovirus 2/5 y 3; CME, endocitosis mediada por clatrina; VPH-16, virus del papiloma humano 16; HSV-1, virus del
herpes simple 1; LCMV, virus de la coriomeningitis linfocítica; mPy, poliomavirus de ratón; SFV, Virus del bosque de Semliki;

SV40, virus de los simios 40; VSV, virus de la estomatitis vesicular. De Mercer, J., 2010. Entrada de virus por endocitosis. Annu. Rev. Biochem. 79, 6,1 6,31. Derechos de autor r 2010 por Annual Reviews,
con permiso.

denominada endocitosis mediada por clatrina. Brevemente, la endocitosis
mediada por clatrina comienza con la difusión de complejos de receptor /
ligando a invaginaciones en la membrana que están recubiertas en su lado
citoplásmico por una red polimérica compuesta por la proteína clatrina.
Estos
Los “hoyos” recubiertos de clatrina eventualmente forman vesículas primarias
recubiertas de clatrina intracitoplasmáticas después de la escisión de la membrana
invaginable (un proceso que es asistido por una proteína celular llamada dinamina).
La celosía de clatrina se desprende rápidamente de la vesícula primaria que luego
ingresa

la vía endosomal temprana. El contenido del endosoma se enviará
posteriormente a los endosomas tardíos y, finalmente, a los endolisosomas. A
medida que las vesículas del endosoma avanzan a través de la vía, su pH
interior se vuelve cada vez más ácido y cambia la composición de las proteínas
celulares residentes. Para algunos virus, el pH ácido dentro del endosoma
sirve como estímulo para los cambios estructurales en la partícula del virus que
facilitan la salida del endosoma y la eliminación del virión (entrada dependiente
del pH). Este proceso se ha estudiado en detalle utilizando el virus de la
influenza A. La unión del virus de la influenza A a una célula huésped está
mediada por el pico de hemaglutinina (HA) viral, una estructura homotrimérica
compuesta por tres heterodímeros HA1 / HA2 unidos por disulfuro. El pico de
HA se une a los residuos de ácido siálico en la superficie celular y las
partículas de virus unidas se llevan a la célula dentro de los endosomas. La
disminución del pH dentro del endosoma induce profundos cambios
conformacionales en HA que hacen que las secuencias N-terminales de HA2,
que funcionan como un péptido de fusión, se extiendan hacia afuera desde el
virión y se inserten en la membrana del endosoma. Al igual que las proteínas F
del virus de la enfermedad de Newcastle, las proteínas HA continúan
replegándose, uniendo la envoltura del virus y la membrana del endosoma y,
finalmente, haciendo que se fusionen. La fusión entre las dos membranas da
como resultado la liberación del genoma del virus en el citoplasma. El genoma
del virus de la influenza A consta de ocho nucleocápsidas (ARN de sentido
negativo complejados en toda su longitud por la proteína NP) que están
asociados entre sí y con múltiples copias de la proteína M1. La proteína M1
parece agregar las ocho nucleocápsidas a través de interacciones proteína:
proteína no covalentes. A medida que el endosoma se acidifica, los iones de
hidrógeno se transportan a través de un canal iónico asociado al virión (canal
iónico M2) para acidificar el interior del virión. La caída en el pH intrapartícula
disocia M1 del complejo, lo que permite que el agregado de nucleocápside se
desarme en nucleocápsidas individuales que son lo suficientemente pequeñas
como para ser importadas al núcleo a través de un poro nuclear. Por lo tanto,
en el caso del virus de la influenza A, la exposición a un pH ácido estimula dos
procesos separados de desrevestimiento (es decir, fusión de membranas y
liberación de nucleocápsidas individuales). Como se predijo, la infección de las
células por los virus que ingresan a través de la endocitosis mediada por
clatrina es inhibida por compuestos que previenen la acidificación del
endosoma (p. Ej., Bafilomicina A1,
cloroquina, NH 4 Cl). Algunos virus que ingresan a la célula a través de
endocitosis mediada por clatrina requieren
estímulos más allá de la exposición a pH ácido para escapar del
compartimento del endosoma. El virus del Ébola media la fusión de
membranas en la etapa tardía del endosoma o endosoma / lisosoma de la
vía. La fusión de membranas está mediada por la glicoproteína de pico GP
que consta de heterodímeros GP1 / GP2. La proteína GP no se prepara por
completo para la fusión de la membrana hasta que es escindida por dos
proteasas de la célula huésped (catepsina L y catepsina B), que el virus no
encuentra hasta que llega al final.
Replicación de virus Capítulo | 2 27
endosoma / lisosoma. Además, la GP cebada no se estimula para realizar
los cambios conformacionales necesarios para la fusión de la membrana
hasta que se une a un receptor interno llamado Niemann-Pick C1 (NPC1),
que es una proteína residente de la membrana del lisosoma del endosoma
tardío. La capacidad del virus Lassa (familia Arenaviridae) salir del endosoma
también depende de la unión a un receptor interno.
Una segunda vía importante de endocitosis que los virus aprovechan para entrar
en las células huésped es el sistema de caveosomas ( Figura 2.7 ). En esta vía, los
virus unidos a la superficie celular ingresan a pequeñas invaginaciones de la
membrana llamadas caveolas. Las caveolas están recubiertas en su lado citoplásmico
por proteínas de caveolina. De manera similar al sistema endosómico, las
invaginaciones pueden unirse a moléculas de carga y pellizcar la membrana
plasmática para formar vesículas llamadas caveosomas. A diferencia del sistema
endosómico, los caveosomas mantienen un pH neutro dentro de la vesícula. Sin
embargo, parece haber una vía para que los caveosomas ingresen al sistema
endosomal, lo que permitiría la activación del pH de algunos virus. Alternativamente,
los caveosomas se pueden administrar al retículo endoplásmico. La entrada de virus a
través del sistema de caveosomas se ha estudiado ampliamente utilizando el virus
SV40 (familia Polyomaviridae). Como regla general, los virus envueltos no utilizan el
sistema de caveosomas; esto puede ser una función del tamaño de partícula, ya que
las vesículas formadas por el sistema endosomal son más grandes y pueden
acomodar el tamaño generalmente mayor de viriones que poseen envolturas lipídicas.
En muchos casos, la entrada de la partícula de virus, nucleocápside o
ácido nucleico genómico en el citoplasma no es el paso final en el inicio del
proceso de replicación del virus. Por lo general, los pasos iniciales de los
procesos de entrada y eliminación del virus no dan como resultado la liberación
del genoma en una forma que pueda iniciar procesos relacionados con la
replicación (por ejemplo, traducción, transcripción o replicación). Además, estos
eventos tempranos a menudo no colocan el genoma viral en el compartimento
celular adecuado para la replicación. Nuevamente, los procesos celulares están
involucrados en la estimulación de procesos adicionales de desvanecimiento y
en el transporte de las unidades virales a la ubicación requerida. Por ejemplo,
el virus del bosque Semliki (familia Togaviridae)
entra en la célula por endocitosis mediada por clatrina y la fusión de la
envoltura del virus con la membrana del endosoma libera la nucleocápside
icosaédrica en el citoplasma. La estructura de la cápside se desmonta
luego de la unión de las proteínas de la cápside por las subunidades
ribosomales 60S de la célula. El desmontaje de la cápside libera el ARN
de la hebra positiva viral, que luego está disponible para traducirse en las
proteínas virales que orquestarán los procesos de replicación posteriores.
De manera similar, los pasos iniciales de entrada celular por adenovirus
(descritos con más detalle a continuación) entregan una partícula de virus
modificada al citoplasma, pero la replicación del ADN del adenovirus
ocurre en el núcleo. Por lo tanto, la translocación de componentes virales
del citoplasma al núcleo es un paso necesario en la infección por casi
todos los virus de ADN (los poxvirus son una excepción notable).
28 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
necesidades de translocación, se utiliza el sistema de transporte de microtúbulos
y el movimiento de la partícula de virus a menudo se facilita mediante motores
moleculares como la dineína o la quinesina. Los filamentos de actina también se
pueden utilizar para movimientos más localizados. Para los virus de ADN y los
virus de ARN, como el virus de la influenza, que utilizan el núcleo para su sitio de
replicación, existen señales de localización nuclear en proteínas virales clave que
interactúan con proteínas celulares solubles del sistema de importación nuclear.
Estas proteínas unen las unidades virales al complejo de poros nucleares, ya sea
permitiendo la translocación de la unidad viral al núcleo (parvovirus) o induciendo
el transporte del ácido nucleico al núcleo (adenovirus, herpesvirus). El ciclo de
replicación de las familias de virus individuales se describe con más detalle en la
Parte II de este libro.
Síntesis de proteínas virales y ácidos nucleicos
Hasta este punto del proceso de replicación, la partícula del virus ha sido
algo pasiva ya que no se ha producido ninguna actividad biosintética
dirigida por el genoma viral. Los pasos preliminares del proceso de
infección han colocado al genoma viral en posición de tomar el control
activo del ciclo de replicación y remodelar la célula para ayudar en la
producción de partículas del virus de la progenie. Los detalles de las
próximas fases del ciclo de replicación, que incluyen la expresión de
proteínas virales y la replicación del genoma viral, difieren notablemente
entre virus y juegan un papel importante en la determinación de las
relaciones evolutivas entre virus y en la ubicación de los virus en el lugar
adecuado. agrupaciones taxonómicas.
Ejemplos representativos de estrategias de replicación de virus
Picornavirus
La familia Picornaviridae incluye varios patógenos importantes de animales y
seres humanos, por ejemplo, poliovirus, virus de la hepatitis A y virus de la
fiebre aftosa (véase el Capítulo 26: Picornaviridae). Los picornavirus son virus
pequeños, relativamente simples y sin envoltura. La partícula del virus tiene una
simetría icosaédrica y consta de una cápside de proteína y un genoma
compuesto por una sola hebra de ARN de sentido positivo. El ARN genómico
contiene una pequeña proteína codificada por virus (VPg) unida
covalentemente a su extremo 5 'y una cola 3' poli A codificada genéticamente.
El proceso de entrada de picornavirus difiere según el virus específico. La
cápside de algunos picornavirus (p. Ej., Poliovirus) sufre cambios
conformacionales en la membrana plasmática en respuesta a la unión del
receptor, y se cree que estos cambios crean un poro de proteína
transmembrana a través del cual se transmite el genoma del virus.
extruido del virión en el citoplasma de la célula huésped (como se describió
anteriormente, Figura 2.5 ). Otros picornavirus, como el virus de la fiebre aftosa,
entran en las células a través de una endocitosis mediada por receptores y liberan
su genoma en el citoplasma tras los cambios conformacionales inducidos por la
acidificación del endosoma. Independientemente del mecanismo utilizado, el
proceso de entrada da como resultado la liberación del ARN genómico en el
citoplasma de la célula huésped, donde se utilizará como plantilla para la síntesis
de proteínas y para la replicación de nuevos genomas virales como se muestra en Figura
2.8 .
Poco después de que el ARN genómico se libera en el citoplasma, la
proteína VPg es eliminada del ARN por una enzima celular que normalmente
funciona en la reparación del ADN celular. Tras la eliminación de VPg, el ARN
se asocia con el sistema de traducción celular y se utiliza como plantilla para la
síntesis de proteínas virales. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los
ARNm de células hospedadoras, el ARN genómico de picornavirus carece de
una estructura de capa 5 'estándar que normalmente se requiere para iniciar el
ensamblaje de un ribosoma en la plantilla de ARNm (traducción dependiente
de capa). Por lo tanto, los picornavirus han tenido que desarrollar un
mecanismo para ensamblar los ribosomas de las células hospedadoras en
ARNm virales en ausencia de un casquete 5 '(traducción independiente del
casquete). Esta función es proporcionada por secuencias de ARN ubicadas
cerca del extremo 5 'del ARN genómico en sí. En picornavirus, el codón AUG
que se usa para iniciar la traducción se encuentra a una distancia
inusualmente larga del extremo 5 'del ARN (743 nt en el caso del poliovirus).
La región larga no traducida entre el extremo 5 'y el sitio de inicio AUG asume
múltiples estructuras secundarias y terciarias debido al extenso
emparejamiento de bases intramoleculares. La mayor parte de esta región se
conoce como el sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) en función de su
capacidad para interactuar con los componentes celulares de la maquinaria de
traducción y ensamblar los ribosomas internamente en el ARN a una corta
distancia aguas arriba del codón de inicio. A medida que avanza la replicación
del virus, la traducción de proteínas celulares disminuye notablemente a
medida que los ribosomas se ensamblan casi exclusivamente en ARNm
virales. La restricción de la síntesis de proteínas celulares se debe a la
escisión y posterior inactivación del factor de iniciación de la traducción eIF4G
por una proteasa codificada por virus (denominada proteasa L o proteasa 2A
según el virus). Se requiere eIF4G para la traducción dependiente de la tapa y,
en su ausencia, los ribosomas no se ensamblan en el ARNm tapado. La
traducción de ARNm viral no se ve afectada por la escisión de eIF4G, ya que
estos ARNm carecen de un casquete y los ribosomas se ensamblan
internamente en ARNm virales mediante el IRES. La inhibición selectiva de la
traducción celular reduce la competencia por los ribosomas y reduce la
capacidad de las células para producir una serie de moléculas antivirales,
como los interferones de tipo I, que se producen en respuesta a la infección
viral (véase Capítulo 4: Inmunidad antiviral y vacunas contra virus).
 Replicación de virus Capítulo | 2 29

FIGURA 2.8 Ciclo de replicación unicelular de un picornavirus representativo (poliovirus). El virión se une a un receptor celular (1); Las interacciones del receptor del virus inducen cambios de conformación en
la estructura de la cápside que dan como resultado la liberación del genoma del poliovirus y su transporte a través de la membrana limitante (membrana plasmática o membrana endosómica) hacia el
citoplasma (2). La proteína VPg, representada como un pequeño círculo naranja en el extremo 5 'del ARN genómico, es eliminada por una enzima de la célula huésped y un ribosoma de la célula huésped se
ensambla internamente en el ARN genómico de una manera dependiente de IRES (3). La traducción se inicia en un sitio interno a 741 nucleótidos del extremo 5 'del ARNm viral y se sintetiza un precursor de
poliproteína (4). Las proteasas virales escinden la poliproteína co y postraduccionalmente para producir las proteínas virales individuales (no todas las escisiones están representadas) (5). Las proteínas que
participan en la replicación del genoma son transportadas a vesículas de membrana donde ocurre la síntesis de ARN (6). La síntesis de ARN se produce en las superficies de estas vesículas de membrana
inducidas por virus. Los ( 1) strand RNA is transported to these membrane vesicles (7), where it serves as a template for the synthesis of complementary ( 2) hebras (8). Recién sintetizado ( 2) las hebras a su vez
sirven como plantillas para la síntesis de ( 1) hebra de ARN genómicos (9). Algunos de los recién sintetizados ( 1) Las moléculas de ARN de cadena se traducen después de la eliminación de VPg (10). Las
proteínas estructurales formadas por la escisión parcial del precursor P1 (11) se asocian con ( 1) cadenas de moléculas de ARN que retienen VPg para formar viriones descendientes (12), que se liberan de la
célula tras la lisis (13). Tomado de Flint, SJ, Enquist, LW, Racaniello, VR, Skalka, AM, 2008. Principles of Virology, tercera edición, vol. 1, pág. 519. Copyright r 2008 Wiley, con autorización.

El ARN genómico de los picornavirus incluye solo un único marco de
lectura abierto que se traduce en una sola poliproteína grande que
posteriormente es escindida por proteasas codificadas por virus (que están
incrustadas dentro de la poliproteína) en las proteínas estructurales y no
estructurales individuales del virus. Los productos de escisión intermedia
se denominan P1, P2 y P3 ( Figura 2.8 ). Proteínas que se utilizan para
ensamblar la cápside (VP1, VP2, VP3 y VP4)
se derivan en última instancia de P1. Las proteínas necesarias para la
replicación del genoma y la interferencia con los procesos de la célula huésped
se derivan en última instancia de P2 y P3. El ARN genómico de entrada se
traducirá repetidamente para generar proteínas de virus, pero finalmente se
utilizará como plantilla para la replicación. La replicación del ARN de
picornavirus se realiza en estrecha asociación con las membranas celulares
remodeladas y requiere la mayoría de las proteínas derivadas.
30 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
de las proteínas precursoras P2 y P3, así como de varias proteínas
celulares. La célula huésped no proporciona una enzima ARN polimerasa
dependiente de ARN (RdRp) capaz de replicar el genoma del ARN viral; y
por lo tanto, los picornavirus (y casi todos los demás virus de ARN) han
desarrollado su propia enzima RdRp para este propósito. Los picornavirus
codifican una enzima RdRp llamada 3D pol que se deriva de la proteína
precursora P3. 3D pol es una cartilla
polimerasa dependiente y el cebador que se utiliza en el proceso de
replicación es la propia proteína VPg. Un residuo de tirosina dentro de VPg
dona el grupo hidroxilo al que se agregan dos nucleósidos de uridina
mediante 3D pol para formar VPg UU 2 OH. La adición de los nucleósidos de
uridina está modelada por dos nucleósidos de adenosina ubicados en la
región sin pares de bases de una estructura de bucle de tallo de ARN
ubicada internamente en el ARN genómico. Esta estructura de bucle de
vástago se conoce como cis- elemento de replicación actuante (CRE). La
secuencia real y la ubicación interna de CRE varía entre diferentes
picornavirus, pero todos contienen dos o más residuos de adenosina
adyacentes dentro de su estructura de bucle que sirven como plantilla para
la uridilación.
de VPg. Siguiente su síntesis, la
VPg UU 2 OH el cebador se transloca a las secuencias terminales del tracto
poli A 3 'donde se hibrida con el ARN a través del apareamiento de bases
A: U. El VPg UU 2 OH
la cartilla luego se extiende por 3D pol para formar una hebra negativa
complementaria de longitud completa. La hebra negativa termina en al
menos dos residuos de adenosina, lo que facilita el emparejamiento de
bases con otro VPg UU. 2 OH cebador y la síntesis de ARN de cadena positiva.
Muchos de los ARN de cadena positiva recién sintetizados se utilizarán como
ARNm después de la eliminación enzimática de VPg. Otros ARN de cadena
positiva retendrán VPg y se empaquetarán en viriones de progenie.
La estructura de la cápside de los picornavirus consta de múltiples copias
de una subunidad estructural llamada protómero. El protómero de la mayoría de
los picornavirus contiene copias únicas de las proteínas estructurales VP1, VP3,
VP0 (un precursor de VP2 y VP4), cada una de las cuales se deriva de P1.
Sesenta protómeros se asocian a través de interacciones no covalentes para
formar la cápside icosaédrica. El mecanismo exacto por el cual el genoma del
ARN se incorpora a la cápside en desarrollo sigue sin estar claro, pero se han
propuesto dos modelos principales. El primer modelo propone que los
protómeros individuales se ensamblan en un ARN genómico y la incorporación
del genoma ocurre coincidiendo con el proceso de ensamblaje de la cápside. El
segundo modelo propone que los protómeros interactúan en ausencia de ARN
para formar estructuras de cápside vacías en las que luego se inserta de alguna
manera el ARN genómico. En ambos modelos, el paso final de la maduración
de la cápside implica la escisión de VP0 en VP2 y VP4 mediante lo que se cree
que es un proceso autoproteolítico. El proceso que limita la velocidad para la
maduración de las partículas parece ser la disponibilidad de ARN que contiene
VPg. Todos los pasos de
El ensamblaje del virión de picornavirus ocurre intracelularmente, y al final de la
infección se forman matrices cristalinas de partículas de virus en el citoplasma de las
células infectadas. En última instancia, estas partículas de virus se liberan de la célula
en masa después de la disolución de la estructura celular.
El ciclo de replicación de los picornavirus ilustra varias propiedades
que son comunes a muchos virus basados en ARN de cadena positiva.
Primero, el genoma del ARN es infeccioso, lo que significa que el ARN
genómico en sí mismo es capaz de iniciar una infección productiva
cuando se introduce en una célula huésped en ausencia de proteínas
virales. En segundo lugar, el ARN genómico de sentido positivo puede
asociarse con los ribosomas y servir como plantilla para la producción de
proteínas virales que luego realizan los procesos de replicación del ARN
viral y de manipulación de procesos críticos relacionados con la defensa y
el metabolismo de la célula huésped. En tercer lugar, las proteínas virales
se pueden sintetizar como proteínas precursoras más grandes
(poliproteínas) que posteriormente se resuelven en proteínas estructurales
y no estructurales individuales mediante proteasas codificadas por virus.
Finalmente,
Rabdovirus
El virus de la estomatitis vesicular es el miembro prototípico del
Rhabdoviridae familia (ver Capítulo 18: Rhabdoviridae), y la siguiente
descripción de la replicación del rabdovirus se basa en el ciclo de
replicación de este virus ( Figura 2.9 ). Los rabdovirus son virus envueltos
que tienen una morfología distintiva en forma de bala. El genoma del
rabdovirus consta de una sola hebra de ARN de sentido negativo. A
diferencia del ARN genómico de los picornavirus, el ARN genómico de los
rabdovirus no está desnudo, sino que existe como una nucleocápsida que
consiste en un ARN complejado en toda su longitud con copias repetidas
de la proteína nucleocápsida (N) (proteína 1 N: 9 nt de ARN) . La infección
de una célula huésped se inicia mediante la unión de las glicoproteínas
del virus (G) a los receptores expresados en la membrana plasmática y
la entrada de la célula a través de endocitosis mediada por receptores. La
disminución del pH dentro de la vesícula endosómica induce cambios
conformacionales en las proteínas G, que a su vez median la fusión de la
envoltura viral con la membrana endosómica.
A diferencia de los picornavirus, el ARN genómico de los rabdovirus no
puede servir como molde para la síntesis de proteínas. En consecuencia, el
primer proceso biosintético iniciado tras la liberación de la nucleocápside es la
transcripción del ARN genómico en ARNm traducibles. Los virus de ARN de
cadena positiva, como los picornavirus, no empaquetan su enzima RdRp como
un componente estructural de la partícula del virus, ya que su genoma puede
traducirse fácilmente para producir los componentes de la enzima poco
después de su entrada en el citoplasma. Por el contrario, los virus de ARN de
cadena negativa
 Replicación de virus Capítulo | 2 31

FIGURA 2.9 Ciclo de replicación unicelular de un rabdovirus representativo (virus de la estomatitis vesicular, VSV). El virión se une a un receptor celular y entra en la célula a través de endocitosis
mediada por receptor (1). El ambiente ácido del lumen del endosoma induce cambios conformacionales en las glicoproteínas de punta que a su vez median la fusión entre la envoltura viral y la
membrana del endosoma. La fusión de membranas libera la nucleocápside viral alfa helicoidal en el citoplasma de la célula huésped (2). La nucleocápside consta de ( 2) hebra de ARN recubierta en
toda su longitud con proteínas de la nucleocápside y una pequeña cantidad de proteínas L y P, que catalizan la síntesis de ARN viral. Los ( 2) La cadena de ARN sirve como molde para la transcripción
de cinco ARNm subgenómicos por las proteínas L y P (3). Los ARNm que codifican las proteínas N, P, M y L son traducidos por ribosomas citoplásmicos libres (4), mientras que el ARNm que codifica
la proteína G es traducido por ribosomas unidos al retículo endoplásmico (5). Las proteínas N, P y L recién sintetizadas participan en la replicación del ARN viral. Este proceso comienza con la síntesis
de un complemento completo ( 1) hebra, que también está en forma de ribonucleoproteína que contiene las proteínas N, L y P (6). Este ARN a su vez sirve como plantilla para la síntesis de la progenie
( 2) hebra de ARN en forma de nucleocápsidas (7). Algunos de estos recién sintetizados ( 2) Los ARN de cadena se utilizan como plantillas para la transcripción adicional de ARNm (8). Las proteínas G
recién sintetizadas ingresan a la vía secretora (9), donde son glicosiladas, oligomerizadas y transportadas a la membrana plasmática (10). Las nucleocápsidas de la progenie y las proteínas M se
transportan a la membrana plasmática (11 y 12), donde la asociación con las regiones que contienen las proteínas G inicia el ensamblaje y la gemación de los viriones de la progenie (13). Tomado de
Flint, SJ, Enquist, LW, Racaniello, VR, Skalka, AM, 2008. Principles of Virology, tercera edición, vol. 1, pág. 534. Derechos de autor r Wiley (2008), con autorización.
32 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
como los rabdovirus, empaquetan su enzima RdRp dentro de la partícula de virus
porque la síntesis de proteínas virales no puede continuar hasta que el genoma viral se
ha transcrito en ARNm, y no hay enzima de la célula huésped capaz de realizar esta
función en el citoplasma. La enzima RdRp del rabdovirus es un complejo de múltiples
subunidades que consta de la proteína grande (L), que posee la actividad catalítica del
complejo, y la fosfoproteína (P), que funciona como un cofactor esencial, pero no
catalítico. El complejo RdRp ingresa al citoplasma como un componente de la
nucleocápside. La organización genética del ARN genómico está altamente conservada
entre los diferentes rabdovirus. Las secuencias del terminal 3 'codifican un ARN corto no
traducido ("líder"), seguido de las secuencias codificantes de 5 genes en el orden de N,
P, matriz (M), G y L, y concluye con las secuencias del extremo 5 'que codifican un ARN
corto no traducido "de cola". Cada una de estas secuencias está separada de las
secuencias adyacentes por una región intergénica corta y altamente conservada que
desempeña un papel importante en la transcripción, como se explica a continuación. La
capacidad de la enzima RdRp para utilizar el ARN genómico como molde para la
transcripción o replicación depende de dos parámetros críticos. Primero, el complejo
RdRp solo puede acceder al ARN genómico a través de las secuencias terminales 3
'altamente conservadas, por lo que los procesos de transcripción y replicación solo se
inician en este sitio. En segundo lugar, la RdRp solo puede acceder y utilizar el ARN
viral que forma un complejo con la proteína N; El ARN desnudo no puede servir como
molde funcional para ningún proceso viral mediado por RdRp. La transcripción de la
nucleocápside viral da como resultado la síntesis de una serie de ARNm
monocistrónicos poliadenilados con capuchón, que se logra de la siguiente manera. La
transcripción se inicia en el extremo 3 'y continúa hasta que la enzima RdRp entra en la
primera región intergénica. Cada región intergénica contiene una secuencia que señala
el final de la transcripción del gen aguas arriba y una secuencia que señala el inicio de
la transcripción del gen aguas abajo. Después de que RdRp encuentra la primera región
intergénica, deja de transcribir y libera el ARN líder corto. El RdRp luego escanea hasta
la siguiente señal de inicio de la transcripción y comienza la transcripción del primer gen
(gen N). Además de funcionar como RdRp, la proteína L tiene actividad de protección y
sintetizará una estructura de protección 5 'metilada en el ARNm nacente. Cuando el
RdRp encuentra la siguiente región intergénica, se detendrá en un tracto corto de
poli-uridina y, a través de un proceso que implica un deslizamiento iterativo, utilizará
estos residuos repetidamente para sintetizar una secuencia larga de poliadenosina
antes de liberar el ARNm (que ahora contiene un 5 metilado 'gorra y una cola de poli A).
Este proceso se repetirá hasta que se hayan transcrito los ARNm individuales que
representan cada gen viral. El reinicio de la transcripción después de la liberación de un
ARNm es un proceso propenso a errores y algunos complejos RdRp se desprenden de
la plantilla. Este proceso se repetirá hasta que se hayan transcrito los ARNm
individuales que representan cada gen viral. El reinicio de la transcripción después de la
liberación de un ARNm es un proceso propenso a errores y algunos complejos RdRp se
desprenden de la plantilla. Este proceso se repetirá hasta que se hayan transcrito los
ARNm individuales que representan cada gen viral. El reinicio de la transcripción
después de la liberación de un ARNm es un proceso propenso a errores y algunos
complejos RdRp se desprenden de la plantilla.
antes de reiniciar con éxito la transcripción del gen aguas abajo. Los
complejos RdRp que se desprenden de la plantilla no pueden volver a
acceder a la plantilla en un sitio interno y deben reiniciar la transcripción
en el extremo 3 'de la hebra negativa. Esta situación resulta en atenuación
transcripcional, en el que el gen más cercano al extremo 3 'del genoma
(gen N) se transcribe al nivel más alto, y la transcripción de genes
posteriores disminuye progresivamente con la transcripción del gen L (gen
terminal 5') que se produce en el nivel más bajo.
La replicación del genoma viral requiere un ARN de sentido positivo de
longitud completa que pueda servir como molde para la síntesis del ARN
genómico de sentido negativo. Cada uno de los ARNm virales tiene una
longitud subgenómica, por lo que ninguno de estos ARN puede servir para este
propósito. A medida que avanza la síntesis de proteínas, se produce una hebra
plus de longitud completa (antigenoma) de ARN viral y este ARN se utiliza en el
proceso de replicación del genoma. El cambio de la transcripción de ARNm
monocistrónicos a la síntesis de hebras positivas de longitud del genoma
parece ocurrir una vez que la concentración citoplasmática de proteína N
alcanza un nivel de umbral crítico. Los ARNm virales carecen de proteína, pero
los ARN de cadena positiva y negativa de longitud completa se unen en toda su
longitud mediante copias repetidas de proteína N. La proteína N es una
proteína de unión a ARN y se mantiene en un estado soluble, Forma libre de
ARN a través de una asociación con dímeros de la proteína P. Una vez que se
alcanza un nivel suficiente de proteína N, la proteína N se transfiere del
soluble N / P 2 forma complejos en los ARN líderes nacientes tan pronto
como son sintetizados por RdRp.
Las proteínas N adicionales continuarán uniéndose al ARN a medida que
se sintetiza. La presencia de proteína N en el ARN naciente tiene un efecto
profundo sobre la función RdRp que, en estas condiciones, no se ve
afectada por las señales reguladoras de las regiones intergénicas y
continúa sintetizando una hebra positiva de longitud completa. El ARN de
cadena positiva de longitud completa (en complejo con la proteína N) sirve
a su vez como plantilla para la síntesis de ARN de cadena negativa de
longitud completa. Los ARN de cadena negativa recién sintetizados
pueden servir como moldes para más ARNm (transcripción secundaria),
como moldes para la replicación o como genomas para la incorporación en
viriones de la progenie.
La maduración de los rabdovirus se produce por la gemación de viriones
recién formados a través de la membrana plasmática de la célula huésped.
Este proceso requiere interacciones específicas entre los componentes de los
tres elementos estructurales principales de la partícula del virus;
específicamente, la envoltura que contiene la proteína G, la matriz y la
nucleocápside. La gemación de partículas de virus ocurre a través de
regiones de la membrana plasmática que contienen una alta concentración
de proteína G. Las proteínas G se sintetizan en asociación con el retículo
endoplásmico rugoso y se transportan a la membrana plasmática a través de
la vía exocitótica.
 Replicación de virus Capítulo | 2 33

donde se concentran en los llamados microdominios de membrana. La Retrovirus

proteína M se sintetiza inicialmente como un monómero soluble, pero a
los Retroviridae familia incluye patógenos tanto de humanos como de
medida que avanza la infección, muchas copias de la proteína M se
animales (ver Capítulo 14: Retroviridae). La partícula de retrovirus está
localizan en el lado citoplásmico de la membrana plasmática, donde
envuelta y contiene picos de glicoproteína asociados a la envoltura. El pico
también se ensamblan en microdominios de membrana ricos en M. Las
es una estructura multiproteína que consta de subunidades transmembrana
nucleocápsidas interactúan con las proteínas M en los microdominios a
(TM) y subunidades de superficie (SU). Las subunidades TM y SU se
través de interacciones no covalentes entre las proteínas N y M. En el
asocian entre sí para formar heterodímeros. Luego, tres heterodímeros TM /
caso del virus de la estomatitis vesicular, la proteína M parece ser la
SU idénticos se ensamblan para formar el pico trimétrico funcional. Las
principal responsable de impulsar el proceso de gemación real, pero se
estructuras internas del virión incluyen una matriz que subyace a la
cree que esto se ve reforzado por las interacciones entre las proteínas M y
envoltura y se construye a partir de copias repetidas de la proteína de la
la porción citoplásmica de las proteínas G. Aunque no se detalla aquí, el
matriz (MA), una cápside que se construye a partir de copias repetidas de la
proceso de gemación también requiere funciones proporcionadas por
proteína de la cápside (CA) y dos nucleocápsidas basadas en ARN. Los
proteínas celulares. En lenguaje sencillo,
componentes de ARN de las nucleocápsidas son idénticos y consisten en
ARN monocatenario de sentido positivo (los retrovirus son diploides para
cada gen del virus). Cada ARN está protegido en su extremo 5 ', contiene
una cola poli A y está complejada en toda su longitud por múltiples copias de
la proteína nucleocápsida (NC). Aunque los retrovirus son virus de ARN de
cadena positiva técnicamente, su ciclo de replicación es marcadamente
diferente del de otros virus de ARN de cadena positiva como los picornavirus
Los rabdovirus producen moléculas de ARN que son ligandos
que se discutieron anteriormente. La siguiente descripción del ciclo de
funcionales para varios receptores de reconocimiento de patrones
replicación de retrovirus, y se muestra en Figura 2.10 , se basa en el de un
celulares diferentes [PRR, p. Ej., Gen 1 inducible por ácido retinoico
retrovirus simple, y algunos detalles no se aplicarán a todos los miembros
(RIG-I), proteína 5 asociada a la diferenciación de melanoma (MDA5) y
del Retroviridae familia.
receptor 7 de tipo toll (TLR7) )], y su reconocimiento puede estimular una
respuesta de interferón tipo I por parte de la célula huésped (ver Capítulo
4: Inmunidad antiviral y vacunas contra virus). Por ejemplo, el ARN líder
que se produce durante el proceso de transcripción y los ARN del genoma
y del antigenoma de longitud completa poseen un trifosfato 5 ', y estos
La infección de una célula por un retrovirus comienza con la unión del virus
ARN no encapsulados sirven como ligandos para RIG-I. Además, el ARN
a los receptores (y a los correceptores en algunos casos) de la célula huésped.
viral de sentido positivo o negativo puede unirse a TLR7 después de la
En general, la unión al receptor está mediada por el componente SU del pico.
administración de productos virales al endosoma, como ocurre durante la
La mayoría de los retrovirus parecen ingresar a la célula huésped a través de la
autofagia. Los rabdovirus son sensibles a los efectos antivirales de los
membrana plasmática y no se requiere ningún cambio en el pH para iniciar o
interferones de tipo I; sin embargo, al igual que los picornavirus, los
completar este proceso. Sin embargo, algunos retrovirus parecen ingresar a las
rabdovirus han desarrollado estrategias para inhibir este sistema innato de
células huésped a través de endocitosis mediada por receptores de una
defensa antiviral de la célula huésped. La inhibición del sistema de
manera similar a la descrita para los rabdovirus. Para los retrovirus que
interferón por el virus de la estomatitis vesicular está mediada por la
ingresan a la célula por la membrana plasmática, la unión al receptor estimula
proteína M que limita la síntesis de interferón tipo I y los productos de
cambios conformacionales en la subunidad SU, que a su vez inducen cambios
genes estimulados por interferón (ISG) al suprimir globalmente la
conformacionales en la subunidad TM que luego media la fusión entre la
transcripción de genes de la célula huésped e inhibir la exportación de
envoltura del virus y la membrana plasmática. La fusión de la membrana
ARNm celulares. fuera del núcleo. El virus de la rabia ha desarrollado una
provoca la pérdida de la envoltura, el desmontaje de la matriz, y liberación del
estrategia alternativa para interferir con la respuesta al interferón mediada
núcleo del virus. El núcleo está formado por la cápside, las nucleocápsidas y
por la proteína P. La proteína P interfiere con la vía de señalización RIG-I
dos enzimas virales [transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN)] que se
que previene la activación de los genes del interferón tipo I. Además, la
requieren al principio del proceso de infección.
proteína P del virus de la rabia inhibe la localización nuclear de las
proteínas STAT 1 y STAT 2 fosforiladas,

Aunque los detalles del siguiente paso en el proceso de infección no

se comprenden por completo, la evidencia sugiere que el núcleo sufre
cambios estructurales, probablemente mediados por proteínas celulares, y
estos cambios estructurales son necesarios para iniciar el proceso de
transcripción inversa por la RT asociada al núcleo. enzima. RT es una
enzima multifuncional que posee ADN dependiente de ARN
FIGURA 2.10 Ciclo de replicación unicelular de un retrovirus simple. El virus se adhiere mediante la unión de la proteína de la envoltura viral a receptores específicos en la superficie de la célula (1). El núcleo
viral se deposita en el citoplasma tras la fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática (2). La entrada de algunos beta y gammaretrovirus puede involucrar vías endocíticas. El genoma del ARN viral
se transcribe de forma inversa mediante la transcriptasa inversa del virión (RT) dentro de una partícula subviral (3). El producto de la transcripción inversa es un ADN complementario (ADNc) de doble hebra
lineal con extremos (repeticiones terminales largas, LTR) que se muestran yuxtapuestos en preparación para la integración. El ADN viral y la enzima integrasa (IN) acceden al núcleo con la ayuda de la
maquinaria de tráfico intracelular o, en algunos casos, mediante la explotación del desmontaje nuclear durante la mitosis (4). La recombinación integrativa catalizada por IN da como resultado la inserción del
ADNc viral en un cromosoma de la célula huésped, que establece el provirus (5). La transcripción del ADN proviral por la ARN polimerasa II produce transcripciones de ARN de longitud completa (6). Algunas
transcripciones de longitud completa se exportan desde el núcleo y sirven como ARNm (7), que son traducidos por los ribosomas citoplasmáticos para formar los precursores de poliproteínas virales Gag y Gag
Pol (8). Algunas transcripciones de longitud completa que están destinadas a encapsidarse como genomas virales de la progenie se asocian en dímeros (9). Otras transcripciones de longitud completa se
empalman dentro del núcleo antes de exportarse al citoplasma (10). Estos ARNm empalmados codifican el precursor de poliproteína Env y son traducidos por ribosomas unidos al retículo endoplásmico (11).
Las glicoproteínas Env se transportan a través del aparato de Golgi donde son procesadas y finalmente escindidas por una enzima celular para formar el complejo de espigas SU TM maduro (12). Las
proteínas maduras de la envoltura se envían a la superficie de la célula infectada (13). Los componentes internos del virión (ARN viral, precursores de Gag y Gag Pol) se ensamblan en los sitios de gemación
que contienen los picos virales (14). Los retrovirus de tipo C (p. Ej., Alfaretrovirus y lentivirus) se ensamblan en la cara interna de la membrana plasmática, como se ilustra. Otros tipos (A, B y D) se ensamblan
en las membranas celulares internas. Los viriones nacientes brotan de la superficie de la célula (15). La maduración (e infectividad) requiere la acción de la proteasa codificada por virus (PR), que es en sí
misma un componente de una poliproteína precursora central (Gag Pol en el modelo representado aquí). Durante o poco después de la gemación, PR escinde los precursores de Gag y Gag Pol en sitios
específicos para producir las proteínas virales individuales (16). Este proceso produce formas funcionales de RT e IN, y libera las proteínas NC, CA y MA para que se ensamblen en las estructuras internas del
virión (p. Ej., Nucleocápsidas, cápside y matriz). Tomado de Flint, SJ, Enquist, LW, Racaniello, VR, Skalka, AM, 2008. Principles of Virology, tercera edición, vol. 1, pág. 531. Derechos de autor r Wiley (2008),
con autorización.

actividad polimerasa (RdDp). La RT es una polimerasa dependiente de cebadores y utiliza el ARN
monocatenario viral como plantilla para sintetizar un producto de ADN bicatenario (ADNc)
complementario y lineal. El cebador utilizado para iniciar la síntesis de ADN es un ARNt derivado
de células que está emparejado por bases con un sitio de unión del cebador en el ARN. Este ARNt
se adquirió de la célula que generó la partícula del virus y entra en la célula recién infectada ya
unida al ARN viral. Los detalles moleculares del proceso de transcripción inversa no se presentan
aquí, pero deben tenerse en cuenta tres resultados importantes del proceso. Primero, el ARN viral
se degrada en el proceso, por lo que los segmentos de genes virales, que son completamente
capaces de funcionar como ARNm, nunca se traducen en proteínas. Segundo, el proceso provoca
la duplicación y transposición de secuencias virales específicas que juntas dan como resultado la
formación de secuencias repetidas en los extremos del cDNA. Estas repeticiones directas se
denominan repeticiones terminales largas (LTR) y realizan importantes funciones relacionadas con
la replicación, como se describe a continuación. En tercer lugar, una vez completado el proceso de
transcripción inversa, el producto de ADNc existe como un componente de un complejo de
nucleoproteínas llamado complejo de preintegración (PIC). El complejo también contiene la
proteína del virus (p. Ej., La enzima IN) y proteínas celulares que ahora están preparadas para
mediar en la integración del ADNc en un cromosoma de la célula huésped si se puede lograr el
acceso al ADN celular. Estas repeticiones directas se denominan repeticiones terminales largas
(LTR) y realizan importantes funciones relacionadas con la replicación, como se describe a
continuación. En tercer lugar, una vez completado el proceso de transcripción inversa, el producto
de ADNc existe como un componente de un complejo de nucleoproteínas llamado complejo de
preintegración (PIC). El complejo también contiene la proteína del virus (p. Ej., La enzima IN) y
proteínas celulares que ahora están preparadas para mediar en la integración del ADNc en un
cromosoma de la célula huésped si se puede lograr el acceso al ADN celular. Estas repeticiones
directas se denominan repeticiones terminales largas (LTR) y realizan importantes funciones
relacionadas con la replicación, como se describe a continuación. En tercer lugar, una vez
completado el proceso de transcripción inversa, el producto de ADNc existe como un componente de un empalmarse,
complejo de nucleoproteínas
La mayoría de los retrovirus no pueden transportar el PIC al núcleo y,
por lo tanto, estos virus solo pueden integrar su ADNc en un cromosoma
de una célula en división activa, ya que la división celular implica la
disolución temporal de la membrana nuclear. Retrovirus pertenecientes a
los géneros Lentivirus y Espumavirus han desarrollado mecanismos para
transportar su PIC al núcleo que hacen posible que estos virus integren su
ADNc en los cromosomas de células que no se dividen. La reacción de
integración es iniciada por IN, que escinde el ADN de la célula huésped en
el sitio seleccionado para la integración, y el proceso depende de las
interacciones entre IN y las secuencias de LTR del ADNc. Los pasos
finales del proceso de integración se llevan a cabo mediante enzimas de
reparación de ADN derivadas de células. La integración del ADNc en el
cromosoma de una célula huésped es esencialmente aleatoria y no
requiere secuencias específicas de ADN del huésped, pero la integración
ocurre generalmente dentro de regiones de un cromosoma que son
transcripcionalmente activas y, en consecuencia, más fácilmente
accesibles. El cDNA viral integrado se conoce como provirus,
Las secuencias de ADN que controlan la transcripción de los genes virales
se encuentran dentro de las LTR. Estas secuencias son similares a las que
regulan la expresión de genes celulares (por ejemplo, caja TATA, sitios de
unión para factores de transcripción celular, etc.). Por lo tanto, las secuencias
LTR son
Replicación de virus Capítulo | 2 35
accesible a la maquinaria de transcripción de la célula huésped y las
transcripciones virales son sintetizadas por el ARN celular pol
II, protegido por enzimas de protección celular y poliadenilado por la
enzima polimerasa poli A celular. La transcripción se inicia dentro de la
LTR que se coloca corriente arriba de los genes virales y continúa a lo
largo de toda la secuencia del provirus. Se utiliza una señal de
poliadenilación codificada por la LTR cadena abajo para la adición de una
cola poli A. Debido a su similitud de secuencia, ambos LTR son capaces
de iniciar la transcripción; sin embargo, la actividad de transcripción
iniciada por la LTR cadena arriba típicamente interfiere con el inicio de la
transcripción desde la LTR cadena abajo. Este fenómeno, que se conoce
como oclusión del promotor, normalmente evita que la LTR cadena abajo
inicie la transcripción de secuencias celulares cadena abajo.
El ARNm viral único contiene la secuencia de todos los genes virales en el
orden de mordaza que codifican proteínas MA, CA, NC y la enzima proteasa
(PR)), pol que codifican las enzimas RT e IN), y env ( que codifica el precursor
de glicoproteína de SU y TM). En algunos retrovirus, la enzima PR está
codificada en el pol región. Dependiendo del retrovirus particular, los marcos de
lectura abiertos que codifican Gag, Pol y Env pueden estar encuadrados entre
sí o fuera de marco, y los marcos de lectura abiertos que codifican Gag y Pol
pueden ser continuos o superpuestos. Las transcripciones encapsuladas y
poliadeniladas producidas por los retrovirus simples experimentan uno de dos
destinos alternativos. Si la transcripción se exporta desde el núcleo sin
servirá como
transcripción
llamado complejo de para la síntesis
preintegración deElla
(PIC). poliproteína
complejo también Gag
contiene la proteína del virus (p.
(que codifica solo MA NC CA PR) y / o una poliproteína Gag Pol más grande
(que codifica MA NC CA PR RT IN). El marco de lectura abierto de Gag
termina con un codón de parada; y por lo tanto, la mayoría de los ribosomas
que traducen la transcripción sin empalmar solo sintetizarán la poliproteína
Gag. Sin embargo, un pequeño porcentaje de ribosomas traductores sintetizará
la poliproteína Gag Pol más grande usando uno de dos mecanismos. Si los
marcos de lectura abiertos de Gag y Pol son continuos y están en marco,
entonces se puede producir la poliproteína Gag Pol si el ribosoma de
traducción lee a través del codón de parada Gag. Este proceso, en el que el
ribosoma trata el codón de terminación como un codón de sentido, se
denomina supresión del codón de parada. Si los marcos de lectura abiertos de
Gag y Pol se superponen y están fuera de marco, entonces se puede producir
la poliproteína Gag Pol si el ribosoma de traducción cambia de su marco de
lectura original (el marco de lectura de Gag) al marco de lectura de Pol. El
cambio de marco ribosómico se ve facilitado por secuencias dentro mordaza y
ocurre justo aguas arriba del marco de lectura abierto de Pol. Normalmente, las
poliproteínas Gag y Gag Pol no se resuelven en sus componentes proteicos
individuales dentro de la célula, sino que solo se someten a un procesamiento
proteolítico después de que se hayan incorporado a los viriones de la progenie
durante el proceso de ensamblaje del virus. Este proceso se describirá con
más detalle a continuación.
36 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica

Alternativamente, la transcripción se puede empalmar antes de exportarla Adenovirus

al citoplasma. El empalme elimina un intrón que incluye las secuencias
Los adenovirus pertenecen a la familia Adenoviridae ( ver el Capítulo 10: Adenoviridae).
que codifican Gag y Pol; y por lo tanto, las transcripciones empalmadas
A diferencia de los picornavirus, rabdovirus y retrovirus, el genoma del
solo retienen el marco de lectura abierto de Env y solo pueden traducirse
adenovirus consta de ADN. La partícula de adenovirus no está envuelta y
en la glicoproteína Env que sirve como precursora de SU y TM. La
consta de una cápside icosaédrica que se construye a partir de las
traducción de esta transcripción se produce en asociación con el retículo
subunidades hexón (trímeros de la proteína II) y pentona (pentámeros de
endoplásmico y las glicoproteínas Env se procesan y se encaminan a la
la proteína III). Las estructuras prominentes llamadas fibras (trímeros de la
superficie celular utilizando el sistema de exportación de proteínas del
proteína IV) están asociadas con las subunidades de pentón y se
retículo endoplásmico / aparato de Golgi. La glicoproteína Env se escinde
proyectan hacia afuera desde cada uno de los 12 vértices del icosaedro.
en sus componentes SU y TM por las enzimas de la célula huésped
La partícula de adenovirus también tiene numerosas proteínas localizadas
llamadas furina (o por una enzima similar a la furina) durante sus tránsitos
internamente; algunos de los cuales están en contacto con las
a través del trans-Golgi o después de su llegada a la superficie celular. El
subunidades pentona y hexón, y otros que están asociados con el
empalme de las transcripciones virales no es exclusivo de los retrovirus.
genoma del ADN. El ADN genómico consta de 30 36 kpb de ADN
Por ejemplo,
bicatenario lineal, contiene secuencias repetidas terminales invertidas que
juegan un papel importante en el proceso de replicación del ADN.

Orthomyxoviridae), Borna enfermedad virus (Familia

Bornaviridae), y de la mayoría de los virus de ADN.

Además de funcionar como ARNm para la producción de las

La siguiente descripción del ciclo de replicación de adenovirus y la representación del
poliproteínas Gag y Gag Pol, el transcrito sin empalmar también puede
proceso que se describe en Figura 2.11 , se basa en la del adenovirus humano 2. La interacción
incorporarse en viriones de progenie como ARN genómico. Estos ARN de
inicial del adenovirus con una célula huésped está mediada por las fibras que se unen a una
longitud completa poseen una señal de empaquetamiento ubicada dentro
proteína de la célula huésped llamada coxsackievirus y receptor de adenovirus (CAR). La unión de
de la secuencia de Gag. Las señales de empaquetado de dos ARN
alta afinidad entre la fibra y este receptor permite que las proteínas de base pentona entren en
interactúan entre sí, lo que facilita la formación de dímeros ARN: ARN. Los
contacto con las integrinas celulares, cuya función normal es unir la célula huésped a los
ARNm virales empalmados carecen de esta secuencia y no pueden
componentes de la matriz extracelular. Esta unión inicia el proceso de entrada mediada por clatrina
participar en la formación de dímeros. De manera similar a los rabdovirus, la
con la subsiguiente internalización del virión en fosas recubiertas de clatrina, e inicia los primeros
formación de la partícula de retrovirus generalmente requiere interacciones
pasos de la eliminación del recubrimiento del virión. Las interacciones que ocurren entre las fibras
específicas y coordinadas entre los componentes de los tres elementos
y los CAR y entre las pentonas y las integrinas, y quizás otros factores que aún no están
estructurales principales de la partícula de virus. Con respecto a los
adecuadamente caracterizados, inducen cambios sustanciales en la estructura de la cápside.
retrovirus, estos elementos estructurales incluyen los microdominios de
Estos cambios incluyen el desprendimiento de las fibras y la externalización de un factor lítico
membrana modificados con picos, las poliproteínas Gag y Gag Pol y los
(proteína VI) desde el interior del virión hacia la luz del endosoma. La proteína VI media la rotura /
ARN diméricos. Las interacciones clave responsables del ensamblaje y
fragmentación de la membrana endosomal que permite que la cápside modificada entre en el
gemación del virión incluyen las que tienen lugar entre el componente MA
citoplasma. Después de la liberación del endosoma, los viriones se asocian con el motor molecular
de las poliproteínas y las colas citoplasmáticas de TM (y con la membrana),
dineína que luego los transporta a lo largo de los microtúbulos hasta un poro nuclear. En el poro
y las que tienen lugar entre el componente NC de las poliproteínas y el
nuclear, la cápside establece interacciones con varias proteínas de la célula huésped, incluida la
dimérico. ARN. Estas interacciones ayudan a impulsar el proceso de
proteína del filamento del poro nuclear Nup214, kinesina-1 e histonas, que desestabilizan aún más
gemación mediante el cual se forman los viriones inmaduros. Los viriones
la estructura del virión y dan como resultado la liberación del ADN viral en el núcleo. La proteína VI
inmaduros recién brotados contienen las poliproteínas Gag y Gag Pol y
media la rotura / fragmentación de la membrana endosomal que permite que la cápside modificada
carecen de estructuras internas definidas, como una matriz, cápside o
entre en el citoplasma. Después de la liberación del endosoma, los viriones se asocian con el
nucleocápsides. Hasta este punto del proceso, la enzima PR ha estado
motor molecular dineína que luego los transporta a lo largo de los microtúbulos hasta un poro
inactiva; sin embargo, poco después de la formación del virión inmaduro, la
nuclear. En el poro nuclear, la cápside establece interacciones con varias proteínas de la célula
enzima PR se activa y procede a procesar las poliproteínas Gag y Gag Pol
huésped, incluida la proteína del filamento del poro nuclear Nup214, kinesina-1 e histonas, que
en sus proteínas constituyentes individuales. Una vez liberadas, estas
desestabilizan aún más la estructura del virión y dan como resultado la liberación del ADN viral en
proteínas se ensamblan en la matriz, cápside, y estructuras de
el núcleo. La proteína VI media la rotura / fragmentación de la membrana endosomal que permite
nucleocápside que son características de la partícula de virus infeccioso
que la cápside modificada entre en el citoplasma. Después de la liberación del endosoma, los
maduro. El procesamiento proteolítico de las poliproteínas Gag Pol también
viriones se asocian con el motor molecular dineína que luego los transporta a lo largo de los
libera RT e IN, que ahora están disponibles para realizar los primeros
microtúbulos hasta un poro nuclear. En el poro nuclear, la cápside establece interacciones con
eventos de replicación necesarios para infectar la siguiente célula.
varias proteínas de la célula huésped, incluida la proteína del filamento del poro nuclear Nup214, kinesina-1 e histonas, que d

Los programas de expresión génica de la mayoría de los virus de ADN están

regulados temporalmente con genes específicos que se expresan en diferentes
momentos. La expresión de genes de adenovirus ocurre en tres fases, que se
denominan temprana inmediata, temprana y tardía. Los genes de adenovirus están
ordenados
FIGURA 2.11 Ciclo de replicación unicelular del adenovirus humano tipo 2. El virus se une a una célula humana permisiva a través de la interacción entre la fibra y (con la mayoría de los serotipos) el
Coxsackievirus y el receptor de adenovirus en la superficie celular. El virus ingresa a la célula por endocitosis (1 y 2); un proceso que depende de la interacción de una segunda proteína virión, pentona
base, con una proteína integrina celular (cilindro rojo). El desensamblaje parcial del virión dentro del endosoma libera una proteína viral (proteína VI) que altera la membrana endosomal y facilita la
liberación del virión modificado en el citoplasma (3). Después de un desvanecimiento adicional, el genoma viral asociado con la proteína del núcleo VII se importa al núcleo (4). El sistema de ARN
polimerasa II de la célula huésped transcribe el gen El A temprano inmediato (5). Los ARNm se empalman alternativamente y luego se exportan al citoplasma (6), donde se traducen en múltiples
proteínas El A relacionadas (7). Las proteínas E1A se importan al núcleo donde regulan la transcripción de genes celulares y virales (8). La proteína El A más grande estimula la transcripción de los
genes virales tempranos por la ARN polimerasa II celular (9a). La transcripción de los genes VA por la ARN polimerasa III de la célula huésped también comienza durante la fase temprana de la infección
(9b). Las primeras especies de pre-ARNm se procesan, se exportan al citoplasma (10) y se traducen (11). Estas proteínas tempranas incluyen las proteínas de replicación viral, que se importan al núcleo
(12) y cooperan con un número limitado de proteínas celulares en la síntesis de ADN viral (13). Las moléculas de ADN viral replicadas pueden servir como plantillas para más rondas de replicación (14) o
para la transcripción de genes tardíos (15). El principal promotor tardío se activa mediante la replicación del ADN viral, pero la transcripción de máxima eficacia requiere las proteínas IVa2 y L4 tardías.
Los ARNm tardíos procesados se exportan selectivamente desde el núcleo como resultado de la acción de las proteínas E1B 55-kDa y E4 Orf6 (16). La traducción eficaz de las transcripciones tardías
requiere el virus VA RNA-1 expresado y la proteína L4 tardía de 100 kDa (17). La última proteína también sirve como acompañante para el ensamblaje de hexones triméricos, ya que ellos y las otras
proteínas estructurales se importan al núcleo (18). Dentro del núcleo, las cápsides se ensamblan a partir de estas proteínas y los genomas virales de la progenie para formar viriones inmaduros no
infecciosos (19). El ensamblaje requiere una señal de empaquetamiento ubicada cerca del final del genoma, así como las proteínas IVa2 y L4 de 22/33 kDa. Los viriones inmaduros contienen los
precursores de las formas maduras de varias proteínas. Los viriones infecciosos maduros se forman (20) cuando estas proteínas precursoras son escindidas por la proteasa viral L3, que ingresa al
núcleo del virión. Los viriones de la progenie se liberan (21), generalmente tras la destrucción de la célula huésped a través de mecanismos que no se comprenden bien. Tomado de Flint, SJ, Enquist,
LW, Racaniello, VR, Skalka, AM, 2008. Principles of Virology, tercera edición, vol. 1, pág. 504. Derechos de autor r Wiley (2008), con autorización.
38 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
en conjuntos llamados unidades de transcripción. Cada unidad de transcripción está controlada por
un único promotor que es utilizado por la maquinaria transcripcional de la célula huésped y señales
de poliadenilación que definen los extremos 3 'de las transcripciones virales. Cada unidad de
transcripción dirige la síntesis de un único ARN primario; sin embargo, el corte y empalme
alternativo produce una población de ARNm que codifican múltiples proteínas diferentes. La
primera unidad de transcripción que se vuelve transcripcionalmente activa es E1A, que codifica las
proteínas tempranas inmediatas. Las transcripciones primarias de E1A se empalman
alternativamente para formar transcripciones que codifican una familia de proteínas E1A. Las
principales proteínas E1A (289R y 243R) realizan varias funciones críticas que se requieren
durante las etapas iniciales de la infección. Primero, las proteínas E1A interfieren con la respuesta
del interferón tipo I, como se discutirá a continuación. En segundo lugar, inducen a la célula
huésped a entrar en la fase S del ciclo celular interactuando directamente con la proteína
supresora de tumores del retinoblastoma (Rb). Los adenovirus infectan típicamente células
diferenciadas terminalmente que no se dividen activamente. Al inducir a la célula huésped a entrar
en la fase S, el virus crea un entorno celular que es más propicio para la replicación del ADN viral.
Las principales proteínas E1A también activan las unidades de transcripción de los genes
tempranos, además de activar algunos promotores celulares. En conjunto, las proteínas
expresadas a partir de los genes tempranos realizan tres funciones principales; incluida la
inhibición de la apoptosis, la replicación del ADN viral y la inhibición de las defensas inmunitarias
del huésped. inducen a la célula huésped a entrar en la fase S del ciclo celular interactuando
directamente con la proteína supresora de tumores del retinoblastoma (Rb). Los adenovirus
infectan típicamente células diferenciadas terminalmente que no se dividen activamente. Al inducir
a la célula huésped a entrar en la fase S, el virus crea un entorno celular que es más propicio para
la replicación del ADN viral. Las principales proteínas E1A también activan las unidades de
transcripción de los genes tempranos, además de activar algunos promotores celulares. En
conjunto, las proteínas expresadas a partir de los genes tempranos realizan tres funciones
principales; incluida la inhibición de la apoptosis, la replicación del ADN viral y la inhibición de las
defensas inmunitarias del huésped. inducen a la célula huésped a entrar en la fase S del ciclo celular interactuando
Dos proteínas expresadas a partir de la unidad de transcripción E1B
(E1B-19K y E1B-55K) inhiben la apoptosis, que es una respuesta celular
normal a la entrada no programada en la fase S (inducida por E1A) y al
estrés celular inducido por la infección por virus. La proteína E1B-19K es
un homólogo de la proteína celular antiapoptótica Bcl-2. Al igual que Bcl-2,
E1B-19K se une a la proteína proapoptótica Bax e inhibe su capacidad
para mediar en la liberación mitocondrial del citocromo C, que es un
potente inductor de la vía intrínseca de la apoptosis (ver Capítulo 3:
Patogenia de infecciones y enfermedades virales) . La proteína E1B-55K
induce la rápida renovación de la proteína supresora de tumores llamada
p53 que se estabiliza en la célula infectada como consecuencia de la
inactivación de Rb mediada por E1A. Bajo condiciones normales,
Tres proteínas expresadas a partir de la unidad de transcripción E2
cooperan para replicar el ADN viral. Los detalles precisos del proceso de
replicación del genoma no se abordarán aquí, pero se describirán las
funciones generales de estas tres proteínas. Una de estas proteínas es la
ADN polimerasa que cataliza la replicación del ADN. La segunda proteína
es la proteína preterminal (Pre-TP) que sirve como cebador para la
replicación del ADN de la misma manera que VPg.
sirvió como cebador de proteína para la replicación del genoma de ARN de
picornavirus, excepto que no se requiere ningún elemento similar a la replicación
que actúe en cis. Al final del proceso de replicación del ADN, un Pre-TP
permanece unido covalentemente a cada extremo 5 'del ADN. Más adelante en
el proceso de replicación, a medida que los genomas de ADN se incorporan a
los viriones recién ensamblados, una proteasa codificada por virus escinde
Pre-TP en una forma más pequeña llamada proteína terminal (TP). La tercera
proteína E2 es la proteína de unión al ADN (DBP) que se une al ADN
monocatenario que se desplaza del molde de ADN bicatenario durante el
proceso de replicación. Después de ser desplazado y unido en toda su longitud
por DBP, el ssDNA sirve como plantilla para la síntesis de un dsDNA de longitud
del genoma.
La unidad de transcripción final que se activa es la que controla la expresión
de los genes tardíos. Los genes tardíos codifican las principales proteínas
estructurales del virus y las proteínas no estructurales que funcionan en el proceso
de ensamblaje del virus. La expresión génica tardía no comienza hasta después del
inicio de la replicación del ADN y se ve reforzada por una proteína codificada por el
virus llamada IVa2. La transcripción de los genes tardíos está controlada por el
promotor tardío principal que define el extremo 5 'de todos los ARNm tardíos. El
extremo 3 'de las transcripciones tardías está determinado por cualquiera de las 5
señales de poliadenilación diferentes que están presentes dentro de la transcripción
primaria. El uso de señales de poliadenilación alternativas conduce a la producción
de un conjunto anidado de cinco transcripciones diferentes, algunas de las cuales
retienen uno o más sitios de poliadenilación internos. A continuación, las
transcripciones poliadeniladas se empalman alternativamente en múltiples
transcripciones
únicas,
directamente concada una de
la proteína las cuales
supresora se traduce
de tumores luego en una
del retinoblastoma proteína
(Rb). Los adenovirus infectan típicamente c
tardía diferente. Las proteínas tardías se transportan luego al núcleo donde
participan en el proceso de ensamblaje del virión. A diferencia de los picornavirus
que poseen una estructura icosaédrica simple, el virión de adenovirus es una
estructura grande y compleja. Los modelos simples de autoensamblaje no pueden
dar cuenta de este grado de complejidad. En consecuencia, se han identificado
proteínas virales que actúan como acompañantes para mover proteínas
estructurales a sitios de maduración y otras que actúan como andamios para
ensamblar las subunidades del virión. Una proteasa codificada por virus que
requiere ADN como cofactor para prevenir la proteólisis prematura participa en el
proceso de maduración al degradar las proteínas de andamiaje y escindir las
proteínas precursoras. Al final de la infección, aparecen en el núcleo de la célula
huésped cuerpos de inclusión compuestos por grandes conjuntos cristalinos de
viriones recién ensamblados. La liberación de viriones de la progenie se produce
después de la lisis de la célula huésped.
Al igual que con otros virus, las infecciones por adenovirus se detectan
mediante receptores de reconocimiento de patrones microbianos (PRR) de la
célula huésped y la infección inicia una respuesta de interferón tipo I (ver
Capítulo 4: Inmunidad antiviral y vacunas contra virus). Sin embargo, los
adenovirus limitan activamente la eficacia de la respuesta de varias formas.
Primero, las proteínas E1A inhiben la actividad de una célula.

complejo proteico (hBRe1) que activa preferentemente la transcripción de
genes estimulados por interferón (ISG). En consecuencia, esta actividad de
E1A reduce en gran medida los niveles intracelulares de las proteínas
efectoras que normalmente contribuyen al estado antivírico inducido por
interferón. Los adenovirus también expresan altos niveles de ARN asociados
a virus no codificantes que inhiben la actividad de PKR, un producto ISG que
inhibe la replicación del virus al suprimir globalmente la síntesis de proteínas
dentro de la célula. La mayoría del ARN asociado a virus existe en forma de
ARNdc debido a la amplia complementariedad de la secuencia
intramolecular. Estos ARN asociados a virus se unen al sitio de unión de
dsRNA de PKR inactivo, pero esta interacción no activa la enzima, y la PKR
que se ha unido por ARN asociado a virus no puede unirse a otros dsRNA y,
por lo tanto, permanece en forma inactiva. Al final de la infección, los
adenovirus inhiben selectivamente la síntesis de proteínas de la célula
huésped al evitar la exportación de ARNm celulares desde el núcleo y al
bloquear la traducción de los ARNm de la célula huésped mediante
modificaciones de factores clave de inicio de la traducción. Los ARNm
tardíos codificados por el virus están exentos de estos efectos debido a una
secuencia única llamada líder tripartito que está presente en el extremo 5 'de
todos los ARNm tardíos de adenovirus.
Montaje y liberación
Cerca del final del ciclo de replicación, las proteínas estructurales y las
moléculas genómicas recién sintetizadas se ensamblan de manera
escalonada en nuevas partículas de virus. Dependiendo del virus, la
liberación de partículas de virus recién ensambladas de la célula huésped
ocurre como un paso separado después del proceso de ensamblaje, o
ocurre al mismo tiempo que el proceso de ensamblaje. Al igual que en otros
aspectos del ciclo de replicación, los detalles del proceso de ensamblaje y
liberación de virus difieren significativamente entre virus. Con base en las
diferencias estructurales obvias entre los virus que poseen una envoltura y
los que carecen de envoltura, y en el profundo efecto que la adquisición de la
envoltura tiene sobre los procesos de ensamblaje y liberación, esta sección
del capítulo discutirá el ensamblaje y liberación de virus no envueltos y virus
envueltos por separado.
La estructura de la cápside externa de prácticamente todos los virus
animales no envueltos consiste en un icosaedro, y estos existen en niveles
variables de complejidad. Para los virus icosasédricos estructuralmente simples
como los que pertenecen a la
Parvoviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae, y
Picornaviridae familias, las proteínas estructurales se asocian
espontáneamente en la subunidad estructural repetida de la cápside
llamada protómero. A continuación, se utiliza un número definido de
protómeros para ensamblar la cápside icosaédrica madura. Los
protómeros de algunos virus sin envoltura pueden ensamblarse en
cápsides en ausencia de la molécula genómica (p. Ej., Parvovirus canino y
humanos
Replicación de virus Capítulo | 2 39
virus del papiloma); para otros virus, el genoma parece servir como sitio de nucleación para el
ensamblaje de protómeros y las cápsides solo se forman en presencia de una molécula genómica
(p. ej., SV40, Polyomaviridae). La estructura de algunos virus icosaédricos es más compleja y no
consta de un solo tipo de subunidad repetida. Por ejemplo, la estructura externa de la partícula de
adenovirus se ensambla a partir de subunidades de hexámeros individuales, subunidades de
pentámeros y fibras triméricas. El ensamblaje de la partícula de adenovirus requiere proteínas
chaperonas que faciliten el ensamblaje y plegado adecuados de otros componentes estructurales
de la partícula de virus, y proteínas de andamiaje que sirven como componentes temporales de
estructuras intermedias que se generan durante el proceso de ensamblaje. Las proteínas que
sirven como chaperonas y / o andamios pueden desplazarse durante el proceso de ensamblaje y
pueden no permanecer como un componente estructural del virión maduro. Además, Se requiere
la escisión de algunas proteínas asociadas al virión para convertir las estructuras intermedias en la
forma infecciosa madura de la partícula del virus. Los virus sin envoltura que contienen un genoma
de ARN se replican y completan su proceso de ensamblaje en el citoplasma de la célula huésped.
Los virus sin envoltura que contienen un genoma de ADN generalmente se replican y completan su
proceso de ensamblaje en el núcleo. La mayoría de los virus no envueltos se liberan solo cuando
la célula se lisia, por lo que para estos virus los procesos de ensamblaje y liberación de virus son
eventos separados y secuenciales. Los virus sin envoltura que contienen un genoma de ADN
generalmente se replican y completan su proceso de ensamblaje en el núcleo. La mayoría de los
virus no envueltos se liberan solo cuando la célula se lisia, por lo que para estos virus los procesos
de ensamblaje y liberación de virus son eventos separados y secuenciales. Los virus sin envoltura
que contienen un genoma de ADN generalmente se replican y completan su proceso de
ensamblaje en el núcleo. La mayoría de los virus no envueltos se liberan solo cuando la célula se
lisia, por lo que para estos virus los procesos de ensamblaje y liberación de virus son eventos
separados y secuenciales.
Los virus envueltos adquieren su envoltura cuando las estructuras internas
del virus (p. Ej., Nucleocápside (s) y componentes de la matriz) brotan a través
de una membrana celular. Dependiendo del virus, la gemación puede ocurrir en
la membrana plasmática, a través de las membranas del retículo endoplásmico o
del aparato de Golgi, o a través de la membrana interna del núcleo. Para la
mayoría de los virus envueltos, la gemación ocurre en regiones de la membrana
en las que las glicoproteínas celulares han sido desplazadas en su mayor parte
por las glicoproteínas del virus ( Figura 2.12 ). Esto asegura que las glicoproteínas
virales se incorporen al virión durante el proceso de gemación. Sin embargo, el
desplazamiento de las glicoproteínas de la célula huésped no es un requisito
absoluto y algunos virus (p. Ej., Virus de la inmunodeficiencia humana y de la
estomatitis vesicular) incorporan fácilmente glicoproteínas de la célula huésped
en las partículas del virus durante la gemación. Las glicoproteínas virales se
asocian típicamente en oligómeros (generalmente homotrímeros u
homotetrámeros) para formar las estructuras de picos (peplómeros). Las
glicoproteínas virales consisten típicamente en un dominio hidrófilo que se
proyecta hacia afuera de la membrana, un dominio transmembrana hidrófobo y
un dominio hidrófilo corto que se proyecta hacia el citoplasma (o interior del
virión).
En general, las nucleocápsidas icosaédricas (p. Ej., Togvirus y
flavivirus) y nucleocápsidas helicoidales (p. Ej., Ortomixovirus y
rabdovirus) de un virus envuelto se ensamblan antes de la gemación.
Estas nucleocápsidas preformadas luego se localizan en la membrana
celular apropiada.
40 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
FIGURA 2.12 Maduración de virus envueltos. (A) Los virus que poseen una matriz (y algunos virus que carecen de matriz) brotan a través de un parche de la membrana plasmática en el que se han
acumulado picos de glicoproteínas (peplómeros) sobre las proteínas de la matriz. (B) La mayoría de los virus envueltos que carecen de una matriz se convierten en vesículas citoplasmáticas (retículo
endoplásmico rugoso o Golgi), atraviesan el citoplasma en vesículas lisas y se liberan de la célula por exocitosis.
y participar en el proceso de gemación. En el caso relativamente raro de
un virus envuelto con simetría icosaédrica (p. Ej., Togavirus), cada
proteína de la nucleocápside (proteína C) interactúa directamente con el
dominio citoplasmático de una glucoproteína de membrana única (E2), y
estas interacciones ayudan a impulsar el proceso de gemación. Para los
virus que poseen nucleocápsidas helicoidales, el proceso de gemación
tiende a ser impulsado por interacciones entre las proteínas de la matriz y
la membrana celular y / o las glicoproteínas de superficie, y entre las
proteínas de la matriz y las proteínas de la nucleocápside. Para algunos
virus, la energía y las fuerzas necesarias para inducir la curvatura de la
membrana y la eventual escisión de la membrana son proporcionadas por
interacciones proteína: proteína y proteína: lípido mediadas únicamente
por componentes del virus. Sin embargo, muchos virus envueltos utilizan
proteínas de los complejos de clasificación endosómica celular requeridos
para el sistema de transporte (ESCRT) para ayudar en el proceso de
gemación. Una de las funciones normales de las proteínas ESCRT es
catalizar la gemación de vesículas unidas a la membrana en el endosoma
para formar cuerpos multivesiculares. Este proceso es fisiológicamente
similar a la gemación de un virus con respecto al proceso que se inicia en
el lado citoplásmico de una membrana y el producto de la escisión de la
membrana (una vesícula o un virión) que se forma en el lado
extracitoplasmático de la membrana. Dependiendo de qué proteínas del
sistema ESCRT estén involucradas, estas proteínas ayudan en el proceso
de gemación del virus en sí mismo y / o en el paso final de la escisión de
la membrana que se requiere para liberar y envolver completamente el
virus.
vesículas a la superficie celular donde se liberan tras la fusión de la
vesícula con la membrana plasmática (exocitosis) ( Figura 2.12 ). Para
estos virus, los procesos de ensamblaje y liberación de virus son
separables y ocurren en secuencia. Los virus que brotan a través de la
membrana plasmática se liberan directamente en el ambiente extracelular,
por lo tanto, para estos virus, los procesos de ensamblaje y liberación del
virus ocurren simultáneamente y son esencialmente inseparables.
Muchas glicoproteínas codificadas por virus envueltos se sintetizan como
proteínas precursoras que se procesan posteriormente mediante proteólisis
específica de sitio antes o después de incorporarse al virión maduro. Esto es
particularmente común para las glicoproteínas que median el proceso de fusión
de la membrana durante la entrada de la célula. La escisión del precursor se
realiza con mayor frecuencia mediante la enzima celular denominada furina (o
una proteasa similar a la furina), que es una endoproteasa expresada de forma
ubicua que reside en el compartimento trans-Golgi y en la superficie celular. La
furina escinde sus sustratos en el lado carboxilo de un motivo de secuencia
BXBB (B representa Arg o Lys y X representa un residuo no especificado). El
precursor de la glicoproteína hemaglutinina del virus de la influenza A (HA0) no
es escindido por furina, pero, en cambio, se escinde en las subunidades
funcionales del pico de HA (HA1 y HA2) después de que el virión recién brotado
se haya liberado de la célula huésped. La HA0 es escindida por enzimas
similares a la tripsina presentes en las secreciones del tracto respiratorio de los
seres humanos y el tracto gastrointestinal del huésped aviar. Este hallazgo fue
un descubrimiento importante a principios de la década de 1970 que permitió la
propagación rutinaria de los virus del virus de la influenza en cultivos celulares
(en
 Replicación de virus Capítulo | 2 41

qué tripsina se agrega al medio de crecimiento). En general, la escisión del

precursor convierte una proteína que no es funcional para la fusión de membranas
en su forma competente para la fusión. La escisión del precursor prepara al virus
para que lleve a cabo los procesos de entrada y desvanecimiento en respuesta a
los estímulos adecuados (como se discutió anteriormente), y generalmente se
requiere para producir una partícula de virus infeccioso.

El virus de la influenza también depende de una segunda actividad

enzimática para ser liberado de manera eficiente de la célula huésped y
prevenir la agregación de partículas de virus. El pico de HA del virus de la
influenza A se une al ácido siálico y usa este resto de carbohidrato como
receptor para unirse a las células huésped. Sin embargo, las proteínas que
comprenden los picos de HA y neuraminidasa (NA) también poseen ácido
siálico, por lo que los viriones recién liberados tienden a unirse a la célula
huésped de la que brotaron y a los viriones vecinos. La actividad enzimática
del pico de NA inhibe estos eventos de unión no productivos al escindir el
ácido siálico de la superficie celular y del virión mismo. El fármaco llamado
oseltamivir (Tamiflu) inhibe la actividad enzimática de NA, que provoca la
agregación del virión y restringe la propagación de célula a célula.

Cabe señalar que para la mayoría de los virus (p. Ej., Togavirus,
herpesvirus y retrovirus) la incorporación de moléculas genómicas en la
estructura de la cápside o nucleocápside es altamente selectiva y depende
de la presencia de una secuencia altamente conservada llamada señal de
empaquetamiento que solo está presente. en las moléculas de ADN o ARN FIGURA 2.13 Sitios de gemación de varios virus envueltos. Los virus que brotan de las superficies
genómico apropiadas. Por el contrario, otros virus (p. Ej., Rabdovirus y apicales pueden ser eliminados en las secreciones respiratorias o genitales o en el contenido intestinal.

parvovirus) no son muy selectivos con respecto al ácido nucleico
empaquetado y los ácidos nucleicos virales de ambas polaridades
(genómico y antigenómico) se empaquetan en viriones.
Los virus que brotan de las superficies basales están en posición de diseminación sistémica a través del
torrente sanguíneo (es decir, viremia) o los linfáticos. Algunos virus, como los flavivirus, bunyavirus y
coronavirus, toman una ruta más tortuosa para salir de la célula (véanse los capítulos específicos en la
Parte II). Los virus que no brotan generalmente se liberan solo a través de la lisis celular.

A diferencia de la mayoría de los otros tipos de células del cuerpo, las

células epiteliales muestran polaridad, lo que significa que poseen una superficie
apical que interactúa con el entorno externo (p. Ej., La luz del tracto respiratorio o
el tracto gastrointestinal) y una superficie basolateral que interactúa con las
células subyacentes. Estas superficies son química y fisiológicamente distintas.
Los virus que se propagan al exterior (p. Ej., El virus de la influenza A) tienden a
brotar de la membrana plasmática apical, mientras que otros virus (p. Ej.,
Retrovirus de tipo C) brotan a través de la membrana basolateral, lo que puede
permitir que el virus ingrese al torrente sanguíneo o sistema linfático como
preludio al establecimiento de una infección sistémica ( Figura 2.13 ).
ENSAYOS CUANTITATIVOS DE VIRUS
El estudio de los procesos virales básicos y las enfermedades basadas en
virus a menudo requiere que el investigador o el médico sepa cuánto virus
existe en una muestra determinada. La reproducibilidad de ambos in vitro y en
vivo Los experimentos dependen del uso de una cantidad constante de virus
para iniciar una infección. Al evaluar los casos clínicos, puede ser importante
determinar la cantidad de virus en varios tejidos o
fluidos como parte de la determinación de patogenicidad y para
seleccionar las muestras correctas para las pruebas de diagnóstico. Una
métrica común utilizada para evaluar la efectividad de los medicamentos
antivirales es comparar la la carga viral ( o "carga") en muestras clínicas
antes y después del tratamiento farmacológico. La respuesta a la pregunta
de cuánto virus está presente en una muestra o espécimen individual
puede no ser simple y depende de la prueba. Hay dos tipos generales de
pruebas de cuantificación viral; específicamente, ensayos biológicos y
ensayos físicos. La cuantificación del virus en una sola muestra utilizando
diferentes ensayos a menudo arrojará diferentes respuestas, y es esencial
comprender las razones de estas diferencias. Los ensayos físicos que no
dependen de ninguna actividad biológica de la partícula del virus incluyen
recuentos de partículas por microscopio electrónico, hemaglutinación,
ensayos inmunológicos como el ensayo de inmunoabsorción ligado a
enzimas (ELISA) de captura de antígeno y, más recientemente, ensayos
cuantitativos de PCR.
42 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica

y técnicos altamente capacitados. En este ensayo, la muestra de virus se

TABLA 2.2 Comparación de la eficacia del ensayo cuantitativo mezcla primero con una muestra de partículas estándar (por ejemplo,
perlas de látex) de concentración conocida. A continuación, se observa la
mezcla de virus / partículas estándar utilizando un microscopio electrónico
Método Cantidad (por mL)
y se cuentan por separado el número de partículas de virus y partículas
Recuento directo de microscopio electrónico (EM) Ensayo de 10 10 Partículas EM estándar. El número de partículas de virus contadas se convierte
infectividad cuántica en huevos 10 9 ID de huevo 50 fácilmente en una concentración (p. Ej., Partículas de virus / ml)
multiplicando la relación del recuento de partículas de virus / recuento de
Ensayo de infectividad cuántica por formación de 10 8 pfu
placa partículas estándar por la concentración conocida de las partículas
estándar. Este procedimiento es más preciso para virus sin envoltura que
Ensayo de hemaglutinación 10 3 Unidades HA
producen partículas de virus altamente estables con formas geométricas
IDENTIFICACIÓN 50, dosis infecciosa 50; ufp, unidades formadoras de placa; HA, únicas como picornavirus, reovirus y adenovirus. Este proceso no puede
hemaglutinación.
evaluar la actividad biológica de la preparación,

La diferencia entre la cantidad de virus detectada usando un ensayo

físico, como el recuento de partículas por microscopía electrónica, y un ensayo
biológico, como un ensayo de placa, se denomina a menudo relación de
partículas a ufp. En prácticamente todos los casos, el número de partículas
Hemaglutinación
físicas supera el número determinado en un ensayo biológico. Para algunos
virus, esta proporción puede llegar a ser de 10,000: 1, siendo común una Como se mencionó anteriormente en este capítulo, algunas células infectadas por virus adquieren

proporción de 100: 1 ( Cuadro 2.2 ). Las razones del mayor número de la capacidad de unirse a los glóbulos rojos en su superficie (hemadsorción) debido a las

partículas físicas en comparación con las partículas infecciosas dependen del interacciones entre las proteínas virales expresadas en la superficie y los ligandos en los glóbulos

virus e incluyen: (1) el proceso de ensamblaje es ineficaz y propenso a errores, rojos. Las partículas de virus libres de algunos virus también pueden unirse a los glóbulos rojos y,

y se pueden formar partículas morfológicamente completas sin el componente cuando se mezclan, las células se agregan en una red de células reticuladas. Esta propiedad se

de ácido nucleico correcto; (2) no todos los viriones que se unen a un receptor denomina hemaglutinación y puede usarse como base para cuantificar los virus que poseen esta

o inician los procesos de entrada y desrevestimiento logran establecer una actividad (p. Ej., El virus de la influenza A). El ensayo de hemaglutinación no puede determinar con

infección productiva; (3) el proceso de replicación es muy propenso a errores precisión el número de partículas de virus presentes en una muestra (es decir, partículas de virus /

(virus de ARN) y las reservas de virus pueden contener partículas con ml); pero es útil para comparar las concentraciones relativas de un virus entre muestras, como las

mutaciones letales; (4) las reservas de virus se producen o se mantienen en obtenidas de múltiples huéspedes infectados, o las recopiladas secuencialmente de un anfitrión

condiciones subóptimas de modo que las partículas infecciosas se inactiven; individual en diferentes días u horas. Para realizar este ensayo, la muestra que contiene el virus se

(5) las pruebas de infectividad se realizan en animales o células que no son procesa primero en una serie de diluciones dobles en serie (normalmente en una placa de

óptimas para detectar partículas infecciosas; (6) las defensas de la célula microtitulación de 96 pocillos). Luego se agrega una solución que contiene glóbulos rojos a cada

huésped evitan que algunas partículas infecciosas completen con éxito el pocillo de muestra. Después de un período de tiempo definido, los pocillos se observan

proceso de replicación. La elección del huésped o de la célula huésped para visualmente para detectar la presencia de glóbulos rojos hemaglutinados que aparecen como una

los ensayos biológicos es un determinante crítico para definir la cantidad de fina capa continua de células que cubren la superficie inferior del pocillo. Los glóbulos rojos no

virus infeccioso en una muestra. No es inusual que los ensayos en el animal aglutinados se depositan en un pequeño “botón” de células en el centro del pocillo. El "título de

huésped natural proporcionen las estimaciones más altas de unidades HA" de la muestra de virus stock se informa como la inversa de la dilución más alta que aglutina

infecciosas, ya que los cultivos celulares disponibles pueden ser un mal completamente los glóbulos rojos ( Para realizar este ensayo, la muestra que contiene el virus se

sustituto de las células diana en el animal. procesa primero en una serie de diluciones dobles en serie (normalmente en una placa de

microtitulación de 96 pocillos). Luego se agrega una solución que contiene glóbulos rojos a cada

pocillo de muestra. Después de un período de tiempo definido, los pocillos se observan

visualmente para detectar la presencia de glóbulos rojos hemaglutinados que aparecen como una

fina capa continua de células que cubren la superficie inferior del pocillo. Los glóbulos rojos no

aglutinados se depositan en un pequeño “botón” de células en el centro del pocillo. El "título de

HA" de la muestra de virus stock se informa como la inversa de la dilución más alta que aglutina

completamente los glóbulos rojos ( Para realizar este ensayo, la muestra que contiene el virus se

procesa primero en una serie de diluciones dobles en serie (normalmente en una placa de microtitulación de 96 pocillos). Lue
Ensayos físicos

Recuento directo de partículas por microscopía electrónica Ensayos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa

El método más directo para determinar la concentración de partículas de

virus en una muestra es contar visualmente las partículas usando un Con el desarrollo de ensayos de PCR en tiempo real (cuantitativos)
microscopio electrónico. Este proceso no se realiza de forma rutinaria porque (consulte el Capítulo 5: Diagnóstico de laboratorio de infecciones virales),
requiere equipos costosos ahora es posible determinar la

FIGURA 2.14 Prueba de HA para determinar la cantidad de virus de la influenza en los fluidos alantoideos
de huevos embrionados. El material de prueba se diluye en serie (diluciones dobles) en una solución
salina tamponada comenzando en la fila 1 de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Después de la
operación de dilución, se agrega a cada pocillo un volumen igual de glóbulos rojos de pollo o pavo al
0,5%. Los valores de punto final se determinan cuando los pocillos de control celular muestran un
asentamiento completo de los glóbulos rojos (formación de “botones”). Los títulos de punto final se
registran como el recíproco de la última dilución que muestra una aglutinación completa. Título de la fila A 5
1024; Fila B, 2; Fila C 5 dieciséis; Fila
D, 2; Fila E 5 64; Fila F, 2; Fila G, 2; Fila H 5 control de glóbulos rojos.
concentración de un ácido nucleico específico del virus en una muestra de prueba.
La PCR puede detectar secuencias de ácidos nucleicos en prácticamente
cualquier contexto, no solo en una partícula de virus. La mayor sensibilidad de la
PCR sobre el aislamiento del virus en muchos casos se logra detectando ácido
nucleico que no es virión en muestras de tejido. Para utilizar la PCR
correctamente para cuantificar el virus, primero es necesario tratar la suspensión
con nucleasas para degradar todo el ácido nucleico que no sea virión. El ácido
nucleico asociado al virión estará protegido por la partícula de virus intacta. Con
controles del número de copias incluidos en el ensayo como base para la
comparación, se puede determinar la concentración del ácido nucleico diana en la
muestra tratada. Este tipo de ensayo no detecta cápsides vacías (aquellas que no
contienen ácido nucleico viral) y no está influenciado por la infectividad de la
preparación.
Ensayos biológicos
Ensayos de placa
Quizás ningún otro procedimiento en virología ha contribuido tanto al
desarrollo del campo como el ensayo de placa. El ensayo de placa fue
desarrollado originalmente por d'Herelle en 1915 1917, en sus estudios
iniciales sobre bacteriófagos. El ensayo es elegantemente simple y es el más
preciso de los ensayos biológicos cuantitativos. Para realizar un ensayo de
placa con bacteriófago, la muestra se procesa primero en una serie de
diluciones de 10 veces en un medio de cultivo bacteriano. Una suspensión de
bacterias hospedadoras en un cultivo derretido.
Replicación de virus Capítulo | 2 43
Luego se agrega medio (agar superior) a cada muestra diluida. Esta mezcla
se vierte luego en una placa de cultivo de agar nutritivo para distribuir la
suspensión de bacteriófagos / bacterias de manera uniforme a través de la
superficie de la placa, donde se enfriará y solidificará rápidamente. Los platos
se colocan en una incubadora y, con el tiempo, las bacterias huésped se
dividen y producen un "césped" visible de bacterias sobre la superficie de la
placa de agar. Las bacterias que están infectadas con bacteriófagos mueren
y liberan viriones descendientes que a su vez infectan y matan a las bacterias
vecinas. Finalmente, se destruyen suficientes células bacterianas para que se
observe un área clara de agar libre de células. Estas áreas claras se
denominan placas. Es importante tener en cuenta que, aunque habrá un
número extremadamente alto de bacteriófagos en cada placa, la placa se
originó por la infección de una célula bacteriana por un solo bacteriófago; y
por lo tanto, cada placa representa un bacteriófago presente en la muestra
que se colocó en placa. No deben aparecer placas en las placas de control
no infectadas. Si la muestra original tiene una alta concentración de bacterias,
entonces las placas que contienen las muestras de baja dilución se limpiarán
completa o casi completamente debido a que la mayoría o todas las bacterias
se infectarán y matarán. Las placas utilizadas para analizar las muestras de
dilución más alta pueden tener solo unas pocas placas o ninguna. En algún
lugar entre estos extremos, se identificarán las placas que contienen una
serie de placas que se pueden contar con precisión, y estas placas se
utilizarán para determinar la concentración (título) del bacteriófago en la
muestra original. Esto se logrará teniendo en cuenta la dilución de la muestra,
el volumen analizado y el recuento de placa. En 1953, el ensayo de placa de
bacteriófagos se modificó para su uso con los sistemas de cultivo de tejidos y
virus animales recientemente desarrollados. Este ensayo funciona mejor con
virus citopáticos que inducen la lisis de su célula huésped. Aunque existen
variaciones del ensayo, en general, se realiza de la siguiente manera. La
muestra de virus stock se procesa en una serie de diluciones en serie como
se describe anteriormente. El medio de crecimiento líquido se retira de las
placas que contienen monocapas de células cultivadas, y luego cada muestra
de virus diluida se superpone sobre una monocapa de células a un volumen
estándar que cubre mínimamente las células. Luego, las placas se incuban
durante un período corto para permitir que el virus se una y entre en las
células, y luego las células se cubren con agar nutritivo. La superposición de
agar nutritivo evita que los viriones de la progenie recién producidos se
propaguen libremente a las regiones distales de la placa, pero no restringe el
movimiento de estos viriones a las células inmediatamente adyacentes. Con
el tiempo, el virus se propagará desde la célula huésped original para infectar
suficientes células vecinas para formar un foco de células infectadas que se
puede visualizar cuando se tiñe con un tinte vital ( Figura 2.15 ). Se han
desarrollado procedimientos de tinción inmunofluorescente e
inmunohistoquímica para realizar ensayos de placa con virus no citopáticos ( Figura
2.3 ).
44 PARTE | I Los principios de la virología veterinaria y zoonótica
FIGURA 2.15 Ensayo de placa como medio para determinar la concentración de virus infeccioso. Se
inocularon cultivos en monocapa de células Vero con diluciones seriadas de 10 veces del virus de la
estomatitis vesicular (Nueva Jersey). Después de un período de 1 hora para la adsorción, los cultivos se
recubrieron con agarosa al 0,75% en medio de cultivo celular que contenía suero bovino fetal al 5%.
Culturas
se incubaron durante 3 días a 37 C en un 5% de CO 2- Atmósfera humidificada. La capa de
agarosa se eliminó y los cultivos se fijaron y tiñeron.
con 0,75% de violeta cristal en formalina tamponada al 10%. (A) Cultura de control; (BF)
diluciones seriadas de 10 veces del virus: B, 10 2 3; C, 10 2 4; D, 10 2 5;
E, 10 2 6; F, 10 2 7.
Además de su uso para cuantificar la cantidad de virus en una
muestra, el ensayo de placa estableció un principio fundamental aplicable
a la gran mayoría de virus animales; a saber, que una sola partícula de
virus era suficiente para establecer una infección productiva. Esto se
demostró determinando que el número de placas en un ensayo
aumentaba de forma lineal cuando se representaba frente al factor de
dilución, es decir, el número de placas seguía una curva cinética de un
golpe. Este no es el caso de muchos virus de plantas, en los que los
genomas segmentados se incorporan en partículas de virus separadas y
una infección productiva requiere la coinfección de una célula por
múltiples virus. Los ensayos de placa también fueron fundamentales en
los primeros estudios de genética viral,
Ensayos de valoración de punto final
Antes del desarrollo del ensayo de placa para virus animales y para virus
no citopáticos que no producen placas, la cuantificación de las reservas de
virus se logró inoculando virus en animales de prueba o huevos
embrionados. Al igual que con el ensayo de placa, estos ensayos
comienzan con la dilución en serie de la muestra o espécimen. Luego,
cada muestra diluida se inocula en uno o más animales de prueba o
huevos. Una infección exitosa podría puntuarse directamente, inferiéndose
de la muerte del animal o del huevo, o indirectamente al confirmar una
respuesta inmune al virus en el huésped infectado. A bajas diluciones,
todos los animales
infectarse, mientras que, a altas diluciones, ninguno de los animales se
infectaría. Con alguna dilución intermedia, solo algunos de los animales o
huevos mostrarían evidencia de infección. Se idearon dos métodos (Reed
Muench y Spearman Karber) para usar los resultados (es decir, número
de infectados frente al número de no infectados en cada dilución
analizada) para calcular la dilución del virus que infectaría al 50% de los
animales de prueba. En este caso, el título del virus stock se expresaría
como un virus infeccioso.
dosis 50 (ID 50) ( Cuadro 2.3 ). Si el virus causa la muerte del animal o del huevo,
entonces este ensayo puede usarse para determinar
mía su dosis letal 50 (LD 50) o huevo dosis infecciosa 50
(EID 50), respectivamente. Los ensayos de titulación de punto final también se pueden
realizar en células cultivadas y en esta versión del
ensayo, el título del virus se informa como el cultivo de tejidos
dosis infecciosa 50 (TCID 50). Aunque no es tan preciso como los ensayos de
placa y no es tan susceptible de análisis estadístico,
el TCID 50 El ensayo de punto final es más fácil de configurar y automatizar que el
ensayo de placa.
CASO ESPECIAL DE DEFECTUOSO
PARTÍCULAS INTERFERENTES (DI)
Este capítulo concluirá con una breve descripción de una clase especial de
partícula de virus replicante denominada partícula de interferencia defectuosa
(DI). Se han identificado partículas DI en la mayoría de las familias de virus.
Estas partículas "DI" se consideran defectuosas porque no pueden replicarse
de forma autónoma, sino que requieren la presencia de un virus auxiliar para
proporcionar la función o funciones de las que carece la partícula defectuosa. El
virus auxiliar suele ser el virus homólogo del que se deriva la partícula
defectuosa. Como su nombre lo indica, las partículas DI interfieren con la
replicación del virus auxiliar y generalmente disminuyen el rendimiento del virus
auxiliar en infecciones mixtas. Las partículas defectuosas se ensamblan a partir
de las mismas proteínas estructurales que su virus original no defectuoso; sin
embargo, los genomas de las partículas DI son defectuosos y carecen de
cantidades variables de la secuencia genómica normal. Aunque los genomas
de las partículas defectuosas están incompletos, retienen la cis- las secuencias
que actúan requeridas para su replicación y las secuencias requeridas para su
encapsidación. Las partículas DI derivadas de virus con genomas
segmentados, como los virus de la influenza y los reovirus, tienden a tener
genomas en los que uno o más segmentos de genes tienen deleciones
significativas. De manera similar, las partículas DI derivadas de virus con un
genoma no segmentado contienen genomas con varios grados de secuencia
eliminada. Por ejemplo, las partículas DI del virus de la estomatitis vesicular
pueden carecer de hasta dos tercios del genoma normal. Morfológicamente, las
partículas DI suelen parecerse a los viriones parentales; sin embargo, con el
virus de la estomatitis vesicular, sus viriones normalmente en forma de bala son
más cortos que los viriones de tipo salvaje. En la jerga usada para
 Replicación de virus Capítulo | 2 45

TABLA 2.3 Datos para calcular el TCID 50 Puntos finales

Virus Mortalidad Positivo Negativo Acumulativo Acumulativo Mortalidad Por ciento

Dilución Proporción Positivo Negativo Proporción Mortalidad

10 2 3 8: 8 8 0 23 0 23:23 100

10 2 4 8: 8 8 0 15 0 15:15 100

10 2 5 6: 8 6 2 7 2 7: 9 78

10 2 6 1: 8 1 7 1 9 1:10 10

10 2 7 0: 8 0 8 0 17 0:17 0

Para TCID 50 En los ensayos que utilizan placas de microvaloración, se realizan diluciones en serie de 10 veces de la muestra de virus en un medio de cultivo celular. Un volumen de muestra (frecuentemente 50 μ L / pocillo) de cada dilución se agrega a
varios pocillos (el ejemplo anterior es 8 pocillos / dilución) de la placa de microtitulación. Luego se agrega una suspensión de células indicadoras
a todos los pocillos de la placa de cultivo. A continuación, las placas se incuban durante un período de tiempo que permite un claro desarrollo de la citopatología de los virus citopáticos o hasta el momento en que se pueda
detectar el crecimiento viral mediante inmunocitoquímica. Cada pocillo se puntúa como positivo (muerto) o negativo (sobrevive) para el crecimiento viral. Para el cálculo de Reed Muench, se tabula una “mortalidad” acumulada y
se calcula el porcentaje de mortalidad. Para calcular el punto final del 50%, se sigue la siguiente fórmula:

D% Mortalidad a la dilución siguiente por encima del 50% Þ 2 50%

D% Mortalidad a la dilución siguiente por encima del 50% Þ 2 D% Mortalidad a la dilución siguiente a continuación Þ

Esto da la distancia proporcional entre las diluciones que abarcan el punto final del 50%. Para los datos de esta tabla, esto da:

78 2 50 28
5 5 0:41
78 2 10 68

Sumando este factor proporcional a la dilución siguiente por encima del 50% (10 2 5) rinde una dilución de 10 2 5.4 para dar un TCID 50 / 50 μ L (volumen de prueba). El recíproco de este valor, ajustando el volumen de la
muestra, da el título del stock de virus como: 5 3 10 6 TCID 50 / mL.

describen estas partículas, los viriones del virus de la estomatitis vesicular normal virus superando al virus auxiliar en componentes virales críticos que
se denominan partículas B y las partículas DI se denominan partículas truncadas o limitan la velocidad, como la enzima replicasa y / o proteínas
T. estructurales.
Los genomas truncados de las partículas DI se generan a través de Nuestro conocimiento de las partículas DI se deriva principalmente de estudios de

eventos de replicación y / o recombinación aberrantes que conducen de infecciones virales de células cultivadas. Sin embargo, algunas partículas de DI también

manera variable a la mutación de secuencias de genes, deleciones de son generadas por algunos virus durante

secuencias, transposiciones, duplicaciones e incluso la inserción de en vivo infecciones (p. ej., virus dengue, sarampión, hepatitis C, hepatitis
secuencias de genes derivadas del ADN o ARN del huésped. Una vez A e influenza A), y la evidencia sugiere que pueden interferir con la
generadas, el número de partículas defectuosas aumenta enormemente con replicación del virus auxiliar
el paso en serie, particularmente cuando las infecciones se realizan con una en vivo y alterar la patogenia de la infección. Este fenómeno se ha
alta multiplicidad de infecciones. Se cree que el rápido aumento en la demostrado repetidamente en sistemas de modelos animales
formación de partículas defectuosas en estas condiciones es el resultado de experimentales, pero demostrar el papel de las partículas DI en la
uno o más de los siguientes mecanismos: (1) sus genomas acortados alteración del curso de las infecciones naturales ha sido más difícil. Las
requieren menos tiempo para replicarse, por lo que con el tiempo la partículas defectuosas pueden alterar la patogenia de la infección por el
polimerasa viral replicaría más genomas defectuosos que completos. longitud virus auxiliar. en vivo by directly interfering with their replication (as
de los genomas del virus auxiliar; (2) los genomas defectuosos son a menudo described above), and/or by stimulating antiviral innate immune
transcripcionalmente inactivos, por lo tanto, se desviarían con menos responses, such as the induction of type I interferon and pro-inflammatory
frecuencia para servir como plantillas para la transcripción de ARNm; (3) cytokines. Because of their ability to interfere with virus replication and to
pueden tener una mayor afinidad por la replicasa viral, lo que les da una alter the pathogenesis of infections with their parental virus, and in some
ventaja competitiva sobre sus homólogos de longitud completa. En esencia, cases that of closely related heterologous viruses, DI particles have been
las partículas DI parecen interferir con la replicación de su ayudante. studied for their potential use as antiviral agents.