UNIVERSIDAD DE NARIÑO

FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

Laboratorio de Biotecnología
G: 12

Canchala Alejandra, Ana Paucar, Perdomo Santiago, Rosas Amanda,

Timarán Santiago

Aislamiento Purificación e Identificación de Especies del Género Ruminococcus para la

Generación de Ácidos grasos volátiles (AGV)

4. Fuente de aislamiento: Residuos de Tomate.

5. Justificación

Los desechos de tomate ofrecen componentes nutricionales como carbohidratos, proteína, grasas
entre otras las cuales pueden ser aprovechadas por especies de los géneros Ruminococcus,
Lactobacilos, Leuconostoc, estos microorganismos logran descomponerlos mediante una
fermentación, produciendo ácidos grasos volátiles, con esta muestra se va a aislar, cuantificar,
purificar, conservar e identificar la presencia de bacterias del género Ruminococcus con potencial
biotecnológico.

6. Materiales y métodos

6.1 Materiales

Materiales Cantidad Descripción

1 Es un instrumento de
Asa bacteriológica laboratorio que consta de
una base que puede estar
hecha de platino y un
filamento de nicromo,se
emplea para transportar,
trasvasar inóculos que
contiene M.O en suspensión
desde la solución “solución
madre” al medio de cultivo
(sólido o líquido) o de un
medio a otro.(Gil, 2015)

Cajas Petric 8
Consta de una base circular
y sus paredes son de una
altura baja,
aproximadamente de 1 cm.
Posee una cubierta de la
misma forma pero algo más
 grande de diámetro, para
que se pueda colocar
encima y cerrar el recipiente,
aunque no de forma
hermética, para proteger el
cultivo de agentes externos
que lo podrían contaminar.
(salinas, 2016)

Tubos de ensayo 9 Consiste en un pequeño

tubo cilíndrico de vidrio con
un extremo abierto y el otro
cerrado y redondeado, que
se utiliza en los laboratorios
para contener pequeñas
muestras líquidas o sólidas,
aunque pueden tener otras
fases, como realizar
reacciones químicas en
pequeña escala.
(Rodríguez.2005 )

Solución salina La solución salina se utiliza

de manera sistemática como
diluyente para ajustar la
turbidez de las
suspensiones de células
bacterianas y así mantener
la integridad y viabilidad de
las células.(Adams.2007)

Perlas de Vidrio
Las perlas de vidrio son un
producto que se elabora con
vidrio óptico de alto grado,
están diseñadas para ser
utilizadas bajo presión de
aire. Su composición está
creada para resistir
temperaturas y fracturas de
impacto. Las perlas de vidrio
pueden encontrarse en 9
tamaños diferentes de
partícula. (Quios.s.f)
Agar base Sangre Es adecuado para el
aislamiento y cultivo de una
amplia variedad de
microorganismos con
difíciles características de
crecimiento.(Quintana,2016)

6.2 Metodología

Cultivo de microorganismos por método de dilución seriada y siembra en placa

Se tomó una muestra ambiental, la cual consistió en residuos de tomate, estos se trataron de
manera aséptica y se aplastaron por medio de un mortero hasta obtener una pasta uniforme.
Posteriormente se pesó 1 gramo de macerado y se agregó a un tubo de ensayo el cual contiene 9
ml de solución salina (tubo 1), y se homogeneizó con el fin de mantener vivos los
microorganismos. Se tomó 1 ml de solución del tubo 1 y se disolvió en 9 mL de solución salina
( tubo 2), realizando continuamente este proceso por el método de dilución seriada hasta 10 -8 (8
diluciones) con solución salina estéril. De cada dilución se obtuvo una alícuota de 0,1 ml, con la
cual se procedió a aislar los microorganismos por medio de la técnica de siembra por estrías en la
superficie de cajas Petri. Finalmente con ayuda de perlas de vidrio se dispersó el contenido se
usó con movimientos en sentido de las agujas del reloj y se incubó durante 48 horas a 37 °C.
(Guerrero Calle A, 2011)

Figura 1. Método de dilución seriada y siembra en placa para bioprospección de

microorganismos en residuos de tomate

Cuantificación de microorganismos
Una vez terminado el proceso de incubación, se analizó la presencia de colonias separadas, por
lo que se procedió a realizar el recuento de células viables por medio del conteo de colonias en
las placas de agar que ayuda a estimar la cantidad de microorganismos capaces de desarrollarse
en un medio ambiente presentes en cada dilución, los resultados se reportaron como unidades
formadoras de colonia por gramo (UFC/g) en la tabla 1.

Aislamiento y purificación de microorganismos del género Ruminococcus y recuento de

células viables

Al presentarse el crecimiento de bacterias separadas y de un solo tipo, se seleccionaron 5

colonias diferentes y se procedió a inocular de forma triplicada (5 muestras), en tubos inclinados
de agar base sangre para su posterior análisis, cada tubo se rótulo desde M322 hasta M325.
(Guerrero Calle A, 2011)

Para determinar la pureza de las cepas aisladas se realizó de forma microscópica, ya que de
acuerdo con el manual de Bergey`s Bacteriología sistemática, menciona que un cultivo puro es
aquel que posee un alto grado de morfología similar en una extensión realizada.

Identificación bacteriana

Mediante pruebas macro y microscópicas de las cepas aisladas, se procedió a caracterizar las
bacterias en base a su morfología tal como lo indica la tabla 2.

Para la identificación microscópica se realizó a través de extendidos y tinción de gram,

empleando el equipo de tinción de gram de Merck, que incluye la solución decolorante, el violeta
cristal, safranina y solución de lugol y para la identificación microscopica se describió según su
forma, color, diámetro, borde, elevación y textura.(Guerrero Calle A, 2011)

Conservación de microorganismos seleccionados

Para realizar la conservación de los microorganismos se utilizó métodos de conservación a largo

plazo, dado que a través de estos se paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero
estas no han muerto, así se garantiza al máximo la estabilidad genética.

Dentro de estos métodos utilizamos la liofilización, ya que este es un método para la

conservación de bacterias y hongos, levaduras y virus, y consiste en la eliminación de agua de
una sustancia congelada por sublimación del hielo bajo vacío, consta de tres etapas, la pre
congelación del producto para asegurar una estructura completamente congelada; el secado
primario con el que se elimina la mayor parte del agua por sublimación; y el secado
secundario con el que se remueve el agua que queda ligada.

7. Resultado de recuento en placa y UFC

Tabla 1 Resultado de recuento en placa y UFC*

 Dilución No. Colonias UFC/mL ó UFC/g

10-1 400 >108

10-2 350 >108

10-3 280 2,8x104

10-4 200 2,0x105

10-5 105 1,05x106

10-6 50 5,0x106

10-7 20 <10-8

10-8 8 <10-8

*Género Ruminococcus, la temperatura de incubación es 37 °C, tiempo de incubación es 48

horas y pH entre 5.8 - 7. (Guerrero Calle A, 2011)

Tabla 2. Características Macroscópicas y Microscópicas de Colonias microbianas encontradas

en Género Ruminococcus.*

Aislamiento Descripción del aislamiento purificado

microbiano

Macroscópica Microscópica

121 Color: Morado Forma Celular:

Diámetro: 0.6 um Redondeada
Borde: liso
 Elevación: Plana
Textura: Mucosa

Color: rosa
Diámetro: 2-3 mm
Borde: liso
Elevación: Semiesférica
122 Textura: viscosa
Forma celular: Ovoide

Forma: Ovoide
Color: Marrón
Diámetro: 1 um
Borde: liso
123 Elevación: Semiesférica Forma celular: Ovoide
Textura:Butirosa

Color: Rosado
Diámetro: 4 um
Borde: liso
Elevación: pleomórficos
124 Textura: Seca Forma celular:
Bastoncillos

Color: Rosado Forma celular:

Diámetro: 0.4 mm Redondeada
Borde: liso
125 Elevación: Semiesférica
Textura: Cremosa

*Condiciones de cultivo ( Agar base sangre, temperatura de incubación 37 °C, tiempo de

incubación 48 horas y ph entre 5.8 - 7. (Guerrero Calle A, 2011)

Tabla 3: Método de conservación para los microorganismos seleccionados*

Aislamiento Fecha de Método de

microbiano conservación conservación
No. De
conservados

122 2/06/2020 Liofilización 3

124 2/06/2020 Liofilización 3

126 2/06/2020 Liofilización 3

* La conservación de cada uno de los M.O seleccionados se realizó por medio del método de
liofilización, conservando 3 de cada uno de ellos el día 02/06/2020

El cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso
de conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las
células y que estas células permanezcan genéticamente estables. Hasta la fecha se han descrito
diversos métodos de conservación, con los cuales se trata de mantener el cultivo viable y con un
mínimo de cambios genéticos, lo más cercano posible al aislamiento original.

Para la conservación de los microorganismos se utilizó métodos para la conservación a largo

plazo, son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección,
fundamentalmente por carecer de los equipos necesarios, porque la cepa microbiana no resiste
los tratamientos de la conservación por estos métodos o porque las cepas contengan
construcciones genéticas trayendo consigo que estas pierdan elementos, determinadas
características especiales que se utilicen para medir el efecto del medicamento o fármaco
en la misma, desde el punto de vista tóxico. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un
único método alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando
varios de estos métodos.(Menéndez.2008)

La liofilización es un método para la preservación de microorganismos a largo plazo, aspecto

esencial en muchas industrias. La pureza, identidad y la estabilidad son características
fundamentales a considerar en el material biológico almacenado. Es un método sencillo en el cual
se mantienen las propiedades originales del material biológico y se reduce el riesgo de
contaminación, siendo útil especialmente en aquellos casos en los que no se puede utilizar el
método de liofilización es un método eficaz utilizado durante décadas para la preservación,
transporte y almacenamiento de microorganismos. Una vez que el producto está preparado para
ser liofilizado, el procedimiento consiste principalmente en tres pasos: congelado, secado primario
(sublimación), y secado secundario (desorción), obteniendo así el producto seco final con el
contenido de humedad deseado.

8. Identificación de un aislamiento microbiano

Medio de cultivo se utiliza una solución salina, ya que se va a identificar especies del género
Ruminococcus, esta especie bacterianas que se logra aislar del rumen de los bovinos, las cepas
más características son; Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens, son consideradas las
principales especies celulolíticas del rumen de bovinos, como también las encargadas de producir
ácidos grasos volátiles (AGV) que se obtienen a partir de la fermentación (Infante et al. 2012).

Cepa identificada: Ruminococcus albus

9. Formulación y clasificación del medio de cultivo empleado

Tabla 4. Formulación y clasificación del medio de cultivo empleado.

Solución salina Cantidad

KH2PO4 3g
(NH4)2SO4 6g

NaCl 6g

MgSO4.7H2O 1,23g

CaCl2.H2O 0,79g

Todo lo anterior en volumen final de 1L

Extracto de tomate 40mL

Extracto de levadura 0,250g

Celobiosa 0,1g

Bicarbonato de sodio 0,6g

Resazurin 0,1 mg

HCL-cisteína 0,1g

Agua destilada (completar 100 ml)

Película de agar 1,33g

Fuente: (Rodríguez V. et al. 1996).

Clasificación del medio de cultivo

· Según la composición química: El medio es complejo

· Según su uso: Medio de enriquecimiento

 · Según su estado físico: Semisólido

10. Por qué empleó el medio de cultivo citado en el punto 8?

Se emplea el medio de cultivo solución salina, se le agrega los sustratos necesarios para aportar
los elementos nutricionales necesarios para el desarrollo especies del género Ruminococcus, es
reconocido que la mayoría de cepas del género Ruminococcus aisladas, utiliza principalmente
celulosa, xilano, pectina y celobiosa, estos sustratos están presentes en el medio de cultivo,
logrando procrear colonias que posteriormente van a ser aisladas, identificadas.

11. Empleó alguna técnica adicional para facilitar el cultivo de los microorganismos de
interés? ¿Cuál? ¿Por qué?

Si, se empleó una técnica adicional la cual facilitó el cultivo de los microorganismos, que fue
agregar fluido ruminal al agar base sangre el cual se lo utilizó como medio para el cultivo de los
microorganismos del género Ruminococcus, ya que en él la literatura este género está presente
en los intestinos de los rumiantes, en el que el aislamiento nos va a facilitar la obtención de este.

12. Con qué fin biotecnológico conservó sus microorganismos?

El fin de la conservación de estos microorganismos es la recuperación para hacer nuevos lotes y

posteriormente trabajar con ellas, para la obtención de ácidos grasos volátiles como: Los ácidos
acético, fórmico y propiónico que se podrían utilizar a favor de la humanidad para conservar
alimentos preparados

13. CONCLUSIONES

A Partir de medios ambientales como residuos de tomate es posible el crecimiento de bacterias

del género Ruminococcus , ya que estan crecen a expensas de polisacáridos, principalmente la
celulosa, los cuales se encuentran presentes en esta muestra ambiental.

Se logró el cultivo y cuantificación de colonias del género Ruminococcus mediante la técnica de

dilución seriada y siembra en placa, la cual mediante un recuento de células viables reportadas
como unidades formadoras de colonia por gramo (UFC/g, )nos permitió determinar la cantidad de
microorganismos capaces de desarrollarse en presencia de la muestra ambiental presente en
cada dilución.

Se logró aislar y purificar colonias del género Ruminococcus mediante el medio de cultivo Agar
base sangre , las cuales fueron caracterizadas mediante pruebas macro y microscópicas y
posteriormente conservados los microorganismos seleccionados mediante el método de
liofilización para ser utilizados en estudios posteriores

Mediante el uso de medios de enriquecimiento es posible aislar este tipo de microorganismos que
son escasamente conocidos por su capacidad de degradar celulosa para la obtención de ácidos
grasos volátiles.

14. Referencias

Adams.G(2017). Solución salina. Citado el 1 de junio del 2020. Disponible en:

https://legacy.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/8806181JAA(0707)_ES.pdf
Guerrero Calle A. (2011). Aislamiento de bacterias ruminales degradadoras de celulosa. pp.45-50

Gil, M. (2015). Asa bacteriológica: características, tipos, usos. Citado el 2 junio del 2020.
Disponible en: https://www.lifeder.com/asa-bacteriologica/

Infante, Verónica Vanesa et al. (2012). «Solución salina como medio de cultivo desde el punto de
vista de las bacteriemias nosocomiales». Revista de Investigación Clínica 64(2): 120-25.

Menéndez.R(.2008).Métodos generales de conservación de los microorganismos.centro de

quimica farmacéutica.

Rodríguez V., Fernando et al. (1996). «Aislamiento, Patrón de Fermentación de Carbohidratos y

Caracterización Morfológica de Bacterias Celulolíticas del Rumen de Bovinos Alimentados con
Heno de Raigrás en Colombia». Corpoica Ciencia y Tecnología Agropecuaria 1(1): 23.

Quios.(s.f) Perlas de vidrio características.citado el 1 de junio de 2020

https://www.quios.com.co/producto/perlas-de-vidrio/

Quintana, C.(2016). Medios de cultivos. Citado el 2 de junio del 2020. Disponible en:
https://www.medioscultivo.com/agar-sangre-de-cordero/

Rodríguez.C(2005).Tubos de ensayos Características.Citado el 1 de junio del 2 2020.Disponible

en:https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-quimico/materiales-e-instrumentos-de-un-
laboratorio-químico/tubo-de-ensayo.html

Salinas, M.(2016) Cajas de Petri características.Citado el 1 junio del 2020.Disponible

en:http://kitlab.exa.unicen.edu.ar/caja_de_petri.html