UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

Facultad de ingeniería Pesquera y de Alimentos

Escuela profesional de Ingeniería Pesquera

Evaluación de tratamientos para inducir la

triploidía en la cabrilla arenera Paralabrax
maculatofasciatus (Percoidae: Serranidae)
mediante shock frío.

֎ Docente: Mariluz Fernández Arnulfo Antonio

֎ Apellidos y Nombres: Mimbela Gonzales Maria Mercedes
֎ Asignatura: Tópicos selectos de la Acuicultura
֎ Código: 1614215179
 TABLA DE CONTENIDOS

01 02 03
Introducción Objetivos Resumen

04 05 06
Metodología Resultados Conclusiones
 01
Introducción
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Estas técnicas han sido aplicadas
principalmente en especies dulceacuícolas a
nivel experimental y comercial. Pueden ser
utilizadas en la planificación de nuevos
esquemas de mejoramiento genético para la
producción animal. Establecer el método
efectivo de inducción a la triploidía. El trabajo
se oriento en primera instancia a encontrar
un método adecuado para obtener altos
porcentajes de eclosión por replica, además
de establecer una metodología adecuada
para el manejo y procesamiento de larvas de
peces que permitieran obtener gráficas de
buena calidad en el citómetro de flujo. Al
mismo tiempo se identifico el tiempo después
de la fertilización óptimo para la aplicación
del shock. Posteriormente se estableció la
temperatura, así como la duración del
tratamiento adecuados para alcanzar un
porcentaje de triploidía del 100% en la
cabrilla arenera P. maculatofasciatus.
De los diferentes métodos, La temperatura inhibe
Mencionan que los Las variables que
el más fácil, barato y la formación de
organismos deben ser controladas
efectivo parece ser el microfilamentos y
triploides se para una inducción
shock de temperatura o micro túbulos, lo cual
desenvuelven exitosa a la triploidía
térmico, ya que no ocasiona que la
pobremente son, el tiempo después
requiere el uso de división celular se
cuando se de la fertilización al
químicos, tampoco de detenga, debido a que
encuentran cual se inicia el
aparatos costosos y puede los cromosomas no
sometidos a altas tratamiento, la
ser utilizado para tratar pueden desplazarse.
temperaturas por duración y magnitud
una gran cantidad de Shock caliente(26-
largos periodos. del tratamiento.
huevos a la vez. 36°C) y en Shock frío(-
1-12°C)

(Lemoine y Smith, (Ojolick et al., (Downing y Allen,

1987). Benfey (2001),
1980; Arai y Wilkins, 1995).
1987; Benfey y
Donaldson, 1988).
 02
Objetivos
Objetivo General:
■ Desarrollar una tecnología de producción de triploides en la cabrilla
arenera (Paralabrax maculatofasciatus) mediante shock en frío.

Objetivos Especificos:
■ Identificar el momento de aplicación que permite obtener el mayor
porcentaje de huevos triploides y comparar con la salida del cuerpo polar.
■ Identificar la temperatura con la cual se obtiene el mayor porcentaje de
huevos triploides, así como la mayor sobrevivencia.
■ Identificar la duración del shock térmico con la cual se obtiene el mayor
porcentaje de huevos triploides, así como la mayor sobrevivencia.
 03
Resumen
● Debido a los problemas con el crecimiento gonádico, la tasa de crecimiento deterioro de la calidad de carne y
enfermedades. Se toma como solución la manipulación cromosómica para producir individuos triploides (3N) . En
los diferentes métodos que existe el mas efectivo es el shock térmico ya que no se utiliza drogas, materiales
costosos y se pueden tratar una gran cantidad de huevos a la vez. El objetivo de este trabajo es determinar el
tratamiento óptimo utilizando un shock en frío para inducir la triploidía en la cabrilla arenera Paralabrax
maculatofasciatus. Los reproductores se obtuvieron de la Bahía de La Paz y se colocaron en tanques (600 L)
conectados a un sistema de recirculación de agua en la Unidad Piloto de Maricultivo perteneciente al CICIMAR-IPN.
Las hembras y machos fueron inyectados intramuscularmente con LHRH-a (12.5 y 25 µg kg/pez, respectivamente).
Los huevos fueron obtenidos manualmente y la fertilización se realizó en seco. Los huevos fertilizados se colocaron
en recipientes con fondo de malla. Se realizaron 3 replicas por cada combinación de tratamiento además de dos
controles. Se probaron 3 temperaturas (4, 8 y 12 °C), 3 tiempos de aplicación del tratamiento (TDF) 5, 10 y 15 minutos
y el tratamiento duró 5, 10, 15 y 20 minutos. Se determino el porcentaje de eclosión y el porcentaje de triploides se
analizo mediante citometría de flujo. Se obtuvieron triploides solo con el TDF de 5 min. Sin embargo, el análisis no
parametrico no pudo detectar diferencias en el porcentaje de triploidía entre las tres temperaturas. Se observaron
también diferencias significativas (p < 0.05) entre las diferentes duraciones de tratamiento. En lo que respecta a la
sobrevivencia absoluta, se presentaron diferencias significativas (p < 0.05) entre las temperaturas, siendo
significativamente más bajas en la temperatura de 12°C (11.22 ± 1.11) y 4°C (14.01 ± 2.10), comparado con la
temperatura de 8°C (Exp. 2 = 52.69 ± 1.75, Exp. 3 = 44.83 ± 0.90). Se presentaron también diferencias significativas
entre las diferentes duraciones del tratamiento (p < 0.05), así como una interacción significativa entre temperatura X
duración.
 04
Metodología
 METODO A
■ Colecta de reproductores
■ Inducción al desove
mediante LHRH-a
■ Inducción a la triploidía
■ Análisis del nivel de
ploidía.
METODO B
■ Colecta de reproductores
■ Inducción al desove
mediante LHRH-a
■ Inducción a la triploidía
■ Análisis del nivel de
ploidía.

SOBREVIVENCIA
ANALISIS DE PORCENTAJES DIPLOIDÍA-TRIPLODÍA
ANALISIS ESTADISTICO
 METODO A (colecta de reproductores)
Lugar: Bahía y Ensenada de la Paz Tiempo: Febrero – Mayo 2003
INICIO Llegada: UPIMA

Alimentación

Recambios de H2O (SRC) 22 tanques de

(70%) fibra de vidrio
Vivero (1ooL) 600L (capacidad)
2 semanas
T:23°C
Salinidad: 35 UPS
Fotoperiodo (!3:11)
 METODO A (inducción al desove LHRH-a)
Previo canulación Solución 2- Fenoxietanol (400ppm) Mayor cantidad de
ovocitos

Fertilización

■ Catéter de plástico 1.2mm(cánula) ■ Machos (25ug/Kg) – 1 inye.

■ introducir por el poro genital hacia el ■ Hembras (12.5 ug/Kg) – 2 ■ Tamiz de
oviducto y realizar succión para extraer inyec (24h) 500micras
los ovocitos (400um)- madurez ■ Lavados de
agua de mar
avanzada Inicio 11:00a.m (10s)
 METODO A (Inducción a la triploidía)

Tamices de PVC con fondo Hielera con ■ El shock en frío se aplicó

de malla recipientes de inducción transfiriendo los tamices con
los huevos fertilizados a un
baño con agua enfriada a la
temperatura deseada,
empleando bolsas de hielo. En
cada experimento se aplicó
solamente una temperatura y
monitoreada de forma
continua.
Temperatura
controlada ±0.2ºC
Incubados 34h.
 Incubación
1er método 2do método
■ Los huevos fueron trasferidos a recipientes ■ Método empleado en el camarón
Litopenaeus vannamei (Puente-Carreón
en el 2003). Se registró la temperatura ya
Inc. de PVC con Inc. Dividido que esta influye en la velocidad del
fondo de malla por una pared
de 80 μm acrílico pegada
desarrollo ontogénico.
sujetos a un con silicón.
tanque circular
de 600 L.

Inc. hechos
de malla de
100 μm de
forma
circular con
divisiones
triangulares.
 Método A (Análisis del nivel de ploidía)

15 larvas de Tubos eppendorf

cada de 1.5 ml de
incubador con capacidad
ayuda de una
pipeta Pasteur

Las muestras fueron marcadas y transportadas en hielo molido para su análisis. Este se realizo
por medio de citometría de flujo en el laboratorio. Las muestras se les agregaron unas gotas de
4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en frío, el cual penetra las células y tiñe el ADN. Filtradas en
una malla de 30 μm. Por último, se agrego aproximadamente 1.5 ml de DAPI a la muestra filtrada
para obtener el volumen necesario dejándose por 5min para ser analizadas por el citómetro de
flujo.
 Metodo B (colecta de reproductores)
Lugar: Bahía y Ensenada de la Paz Tiempo:
• Los ovocitos obtenidos se guardaron en tubos
• 2 experimentos x semana
Revisión del sexo por
canulación
• 12 a 20 especies
anestesiados al momento de su
captura utilizando 2-
fenoxietanol a una
concentración de 400 ppm.
Invierno – primavera 2004
Eppendorf (1.5 ml) con agua de mar
Los machos fueron marcados
mediante un ligero corte
angular en la parte superior de la
aleta caudal
• Los peces fueron distribuidos en un
sistema de circulación cerrada a una
proporción de 2:1 (Hembras: Machos).
Ovocitos con un diámetro
de 400 μm o superior
Método B (Inducción al desove con LHRH-a)
 Se revisaron 31h.antes de la
primera inyección (7:00p.m)
 La fertilización se llevo a cabo La repartición empleando una caja
en seco (T=0) al petri de 3cm de diámetro, para
(T=3min)lavados con agua de asegurarnos de colocar en cada
mar x10s. recipiente solo los huevos que se
 Se colocaron en un vaso encontraban flotando, característica
precipitado x 30s. Agregándose que solo poseen los huevos vivos.
una solución hipersalina aprox
de 1:3 (agua marina: sol
hipersalina) para separar los
huevos viables de los no
viables.
 Método B (Inducción a la triploidía)

Temperatura: 4°C 8°C 12°C

Duración del tratamiento 5min 10min 15min 20min

Una vez aplicado el shock, los tamices fueron
3 replicas para c/u con transferidos a la hielera inicial y llevados a otra
2 controles área del laboratorio con aireación continua y
temperatura controlada (≈ 25 ºC).

Incubar X 35h. Con recambios del

70% del volumen total con agua
petrada( clorada y triosulfatada)
Registrándose la T° antes, durante y
después de los recambios
 Método B ( análisis del nivel de ploidía)
Se tomaron 10 larvas de cada incubador con ayuda de una pipeta Pasteur conectada a una bomba
de plástico (BEL-ART, Products, USA).

Se procede a tomar una por una las 10 larvas con ayuda de unas
pequeñas pinzas de punta lisa y cuadrada (Victorinox), y almacenarlas
en tubos Eppendorf (1.5 ml), los cuales contenían aproximadamente 0.5
ml de agua pretratada. Fueron almacenadas en hielo molido.

Fueron procesadas en el CIBNOR del cual se hicieron dos modificaciones; las

muestras fueron solo ligeramente machacadas y procesadas de tres en tres, antes de
ser leídas por el citómetro de flujo, para reducir al máximo el tiempo de exposición a la
temperatura ambiental, la cual reduce la efectividad del DAPI para teñir el ADN.
 Sobrevivencia

se realizó contando el número de larvas eclosionadas y huevos con ayuda de una lupa
estereoscópica y de una caja de Petri cuadriculada. El número de larvas colectadas previamente
para el análisis de citometría de flujo eran agregadas al número observado. Los porcentajes de
sobrevivencia absoluta* obtenidos se expresaron también en base a los porcentajes de eclosión
obtenidos en los controles, los cuales fueron considerados como el 100% (Sobrevivencia relativa).
Análisis de porcentajes diploidía-triploidía
Se evaluó utilizando un análisis de picos en las gráficas obtenidas previamente con el citómetro de
flujo.
 05
Resultados
 Método A Método B

Nos permitieron obtener un mayor número

de larvas por réplica. Nos permitieron
No se logró un porcentaje de eclosión consistente y obtener picos mejor definidos, tanto en los
en cantidad suficiente en cada una de las replicas diferentes tratamientos como en las larvas
de los diferentes tratamientos. no tratadas.
Expulsión del 2º Cuerpo Polar

Expulsión del segundo

cuerpo polar del ovocito.
Triploidía

se presentan los resultados de triploidía

solamente cuando el tratamiento se
aplicó 5 minutos DF. La duración mostró
diferencias significativas (p < 0.05). el
Análisis a posteriori no pudo detectar las
diferencias entre las cuatro duraciones.
Varias combinaciones de tratamientos
permitieron arrojar 100% de triploidía de
manera constante en las tres replicas
Sobrevivencia
 06
Conclusiones
De los tres TDF, el de 5min el efectivo para inducir la
triploidía en la cabrilla.
Las temperaturas de 8°C y 4°C son bajas para alcanzar
100%triploidía.
Si la T° decrece se obtienen triploides con corta duración
Un diferencial de 15°C entre la T° de los tanques de
reproductores y la T° del shock fue efectivo para inducir
altos porcentajes de triploidía.
 La duración del tratamiento provoca un efecto negativo en
la sobrevivencia al mismo tiempo que provoca un
incremento en los porcentajes de triploidía.
 07
Recomendaciones
Mejorar el sistema de repartición de huevos dentro de los diferentes
tratamientos, para evitar la variabilidad en el número de huevos colocados.

Realizar un estudio sobre el desarrollo de larvas triploides, su crecimiento hasta

juveniles y su maduración gonádica.

Refinar la calidad de las gráficas obtenidas con el citómetro de flujo, a través de

estudios posteriores con organismos triploides.

Estudiar el tratamiento exitoso en desoves individuales, para confirmar los

resultados obtenidos
¡¡GRACIAS !!
Otros trabajos:

http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/668/1/T-ESPE-020342.pdf
https://genesperu.minam.gob.pe/wp-content/uploads/2016/09/05-Variabilidad-
genetica.pdf poliploidia
http://www.scielo.org.co/pdf/rudca/v15n2/v15n2a19.pdf del bagre
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/114851/Mer%c3%ad%20-
%20EFECTO%20DE%20LA%20TRIPLOIDIA%20Y%20EL%20PIENSO%20EN%20%20L
A%20ACTIVIDAD%20ENZIM%c3%81TICA%20DIGESTIVA%20DEL%20SALM%c3%93N
%20ATL%c3%81N....pdf?sequence=1&isAllowed=y mexico y actividad enzimática
file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/1473-Texto%20del%20art%C3%ADculo-
5842-2-10-20140306.pdf ginogenesis truchas