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LIOFILIZACION
INTRODUCCION

La conservación de productos biológicos o de sustancias destinadas a la

alimentación de origen animal o vegetal, fueron y siguen siendo hoy un problema
de de difícil resolución.
La extrema complejidad de estos productos y su grado de hidratación elevados,
los hacen muy sensibles a las condiciones externas.
El conocimiento de las propiedades del frió como preservador, abrió nuevos
horizontes, teniendo en cuenta que la actividad bacteriana era frenada en su
desarrollo, aunque la actividad enzimatica en muchos casos presente y los
fenómenos oxidativos de las fracciones susceptibles, permiten solo una corta
preservación.
Se puede acrecentar la estabilidad transformando el agua en hielo, es decir
congelando, fenómeno que disminuye la actividad enzimática, pero aún los
fenómenos oxidativos continúan modificando las características del producto.
Auque la congelación nos asegura una conservación de larga duración en la
mayoría de los productos alterables, la provisión continua de frió es un problema
técnico de muy difícil resolución.
Buena parte de las reacciones químicas relacionadas con la vida y con la
degradación de sustratos, transcurren en solución acuosa, el reducir la actividad
del agua las retarda hasta detenerlas.
La mejor solución es la eliminación total del agua contenida en el espécimen, la
desecación directa es impracticable por lo tanto se recurre a la criodesecación al
vació ó liofilización, que no es más que la extracción de agua de un producto
previamente congelado, en forma de vapor; es decir se produce el fenómeno
denominado sublimación donde el hielo en estado sólido en condiciones de baja
presión pasa a vapor sin pasar por el estado liquido intermedio.
Al producto obtenido se lo llamó “liófilo” ( derivado de lio: Solvente philo: amante
ó muy afín) Nombre que expresa su propiedad de muy fácil hidratación y
reintegración a su estado original.
Por derivación del término liofilo se pasa a liofilización como método para
obtenerlo y liofilizar, liofilizador, liofilizado etc.
El proceso comienza con la fase de congelación continua con la fase de secado
primario y finaliza con el secado secundario.

LOS FENOMENOS FISICOS DE LA CONGELACION

Todos los cuerpos naturales poseen agua ligada en diversos grados alas
estructuras moleculares de dichos cuerpos.
Existe un agua libre que forma parte del espacio intercelular es decir en donde
están suspendidos los microorganismos ó las células que pueden ser extraída
fácilmente sin desnaturalización.
Hay otra agua denominada de imbibición más o menos ligada a los complejos
intermoleculares, cuya extracción puede ocasionar fenómenos de alteración
irreversibles.
Finalmente el agua de constitución formando parte de la estructura coloidal y que
es indispensable para mantener la estructura, esta es muy difícil de extraer, no se
congela jamás y permanece al estado líquido finamente dividida.
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CRISTALIZACION DEL AGUA

A 0º C y a una presión de 760 mm de Hg el agua pura esta en estado líquido.

Debajo de esta temperatura y en presencia a de gérmenes ó núcleos cristalinos el
agua se congela con liberación de calor para cederlo al hielo, que cristaliza en
forma hexagonal birrefringente.
El agua puede estar debajo de 0º C sin solidificarse, fenómeno denominado
subfusión y se produce principalmente en los sistemas capilares y en cualquier
otro sistema donde las moléculas esten sin libertad de movimientos.
En este estado el sistema es sumamente inestable y un choque mecánico ó la
introducción de una molécula extraña puede provocar la cristalización inmediata.
El grado de cristalización y la talla de los cristales depende de la rapidez de la
congelación.
Si la congelación es rápida se forman numerosos cristales de pequeño tamaño si
se congela a muy baja temperatura y muy rápido no hay cristalización y el agua
se congela en un solo bloque transparente, fenómeno denominado vitrificación.
Si la congelación es lenta, se forman pocos centros cristalinos y los cristales son
gruesos e irregulares.
La presencia de sales provocan dos cambios fundamentales: La forma de la
cristalización y la rapidez en la formación de los mismos, que es
considerablemente disminuida.

FORMA DE CRISTALIZACION
Supongamos una solución de Cl Na al 1%, al enfriar esta solución por debajo de
0º C comienza la cristalización que avanza y el agua tiende a cristalizarse en
estado puro.
A medida que los cristales crecen, el agua intersticial disminuye mientras la
concentración salina aumenta.
A -6º C el 90% del agua es hielo y el 10% de agua restante contiene 10% de
Cl Na es decir diez veces la concentración inicial.
A -21º C esta agua residual se congela en forma brusca y se forma una mezcla
íntima de cristales de hielo y de Cl Na.
Este momento se denomina punto eutéctico y la temperatura se llama
temperatura de eutexia que varia con la composición de las distintas soluciones
en función de la concentración salina de estas, por lo tanto no puede ser fijada
arbitrariamente.

RAPIDEZ DE CRISTALIZACION
La concentración de sales afecta la rapidez de congelación.
Algunos grupos orgánicos como el glicerol pueden bajar cincuenta veces la
velocidad de congelación y paralelamente a esta disminución la talla de los
cristales disminuye también.
Como vimos hasta ahora, a medida que la temperatura disminuye comienza la
formación de cristales de hielo que dependiendo de la velocidad de disminución
podia ser de mayor ó menor tamaño y podían producir daño mecánico ó
traumático a las células.
Paralelamente el aumento de dichos cristales es acompañado con una
disminución de la cantidad de agua en estado líquido que acrecienta su tonicidad.
Como consecuencia de esto el material biológico además de daño traumático por
la cristalización , sufre un choque osmótico de importancia como consecuencia de
la formación de soluciones hipertónicas que ocasionan fenómenos de exosmosis
que llegan a desnaturalizar el material antes de llegar al punto de eutexia, es decir
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el momento en que en el sistema no existe agua en estado líquido, para evitar la

formación de soluciones hipertónicas debemos tratar de llegar lo más rápido
posible a la temperatura de eutexia del sistema a liofilizar.
Existen varios métodos para medir la temperatura de eutexia, uno de los mejores
es el estudio de la conductividad eléctrica de Greaves.
El material congelado se presenta como una esponja de hielo, donde en los
espacios interiores de dicho tramado esponjoso circula agua en estado líquido
con alta concentración de sales, estas venas líquidas hipertónicas conducen
mucho mejor la electricidad que el hielo formado.
Cuando la resistencia se eleva bruscamente es posible admitir que todo el
material se ha solidificado.
Esto determina el punto de eutexia que varia con cada sistema y que en el caso
de la solucion de Cl Na al 1% es de -21º C.

CONCLUSION
1) Debe realizarse la derminación del punto de eutexia.
2) Debe enfriarse la sustancia a temperatura bastante por debajo de este para
asegurar la cristalización total de la solución, evitando fenómenos de fusión –
recristalizacion que producirían daño mecánico al sistema, la velocidad de
enfriamiento debe ser lo suficientemente rápida para evitar las soluciones
hipertónicas responsables del daño osmótico.
3) En muchos casos el punto de eutexia no esta bien definido para un
determinado sistema o bien no es técnicamente posible determinarlo en la
rutina diaria del laboratorio, para estos casos se considera que existe una
zona de eutexia situada entre los -35º C y -40º C donde nos aseguramos que
no existirá agua libre sin congelar independientemente del sistema con que
trabajemos.
La congelación se puede llevar a cabo dentro de la cámara del equipo liofilizador
ó bien realizar el pre-congelamiento fuera de este, utilizando por ejemplo equipos
de frío con alcohol etílico a -50º C, recipientes con alcohol y hielo seco ó alcohol
isopropílico enfriado a -70º C.
Con el objeto de obtener un producto congelado que presente mayor superficie
de sublimación, se emplean las técnicas de congelamiento por rotación en un eje
horizontal es decir que si se desea tener una sublimación rápida es conveniente
que el producto presente una superficie grande y poco espesor.
Cuando se trata de liofilizar productos muy diluidos por ejemplo vacunas, es
necesario agregar algunas sustancias que además de actuar como
crioprotectores, dan al mismo una determinada estructura evitando que la
pastilla se derrumbe durante el proceso de liofilización.
Las más frecuentemente utilizadas son la leche descremada al 10% ( Salvo para
el caso de liofilización de cepas que van a ser utilizadas en un medios de cultivo
químicamente definidos) Sacarosa, manitol, glutamato de sodio, etc.
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SECADO PRIMARIO

El material congelado se somete a la acción del vació produciéndose la

sublimación.
En esta etapa del proceso son dos los puntos críticos que deben considerarse
con especial atención.
En primer lugar hay que tener en cuenta un fenómeno de transferencia térmica,
ya que la sublimación es un fenómeno endotérmico es necesario durante el
proceso proporcionar calor a la masa congelada.
Si este calentamiento no se efectúa, se producirá un sobre enfriamiento de
esta, dificultándose la sublimación. Este calor aportado es necesario para
compensar el enfriamiento producido por el vapor de hielo y la temperatura de
equilibrio recibe el nombre de temperatura de desecación.
La desecación se producirá desde la superficie del producto expuesta al vacío
hacia abajo.
El otro punto crítico a tener en cuenta lo constituye la transferencia de masa y se
refiere a la eliminación del vapor de agua que se produce en la sublimación.
Si se considera que a la presión de 0.1 Torr un gramo de agua ocupa un volumen
de 9.500 litros, se comprenderá la magnitud del problema que significa remover
del sistema esta enorme cantidad de vapor de agua.
Ambos problemas inciden en la velocidad del proceso.
Para que la sublimación se produzca en buenas condiciones todo el material
debe estar congelado, por lo tanto al aportar calor durante el proceso es
importante evitar que se funda la masa, lo que podría producir alteraciones
debidas a la formación de soluciones hipertónicas y a la presencia de liquido
intersticial que por acción del vació, ebulle bruscamente con producción de
abundante espuma la cual deforma la pastilla estructuralmente, fenómeno
denominado “puffing” que puede llevar al deterioro del producto.
Se comprenderá entonces la importancia de conocer la temperatura hasta la
cual se puede calentar el material sin que se funda, es decir la temperatura del
producto no debe pasar el punto de eutexia en todo el proceso de secado
primario.
El peligro se presenta no a nivel de del producto desecado, enfriado
constantemente por el vapor de hielo que lo atraviesa a través de la interfase
producto del secado-hielo, si no a nivel de la zona de contacto del hielo con la
placa del equipo liofilizador donde hay un intercambio constante de temperatura
entre el frasco con el producto congelado y el entorno. ( Dijimos que para que el
fenómeno de sublimación exista debe haber un equilibrio entre el frío que sede
el vapor de hielo al producto que se esta desecando y el calor que el hielo debe
entregar al vapor para que este se forme, este calor proviene de la placa del
equipo de liofilización si esta no sede calor no hay sublimación, por lo tanto no
es posible la desecación)
El registro de la temperatura de la masa de efectúa introduciendo una zonda
termométrica en el interior de uno de los recipientes con el producto a liofilizar.
La sublimación se llevara a cabo en mejores condiciones si la masa sublima
desde una superficie amplia y de poco espesor. De allí que la técnica de
congelamiento del producto adquiera gran relevancia.
La remoción del agua sublimada puede efectuarse por diversos procedimientos.
Algunos autores han empleado bombas rotativas y de difusión para este objeto.
Sin embargo los métodos mas usados son el empleo de agentes desecantes
químicos y el uso de condensadores. Los desecantes químicos tienen la
capacidad de combinarse con el agua o de adsorberla.
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El más utilizado es el pentóxido de fósforo que forma con el agua ácido meta
fosfórico.
Se emplea en equipos de laboratorio para liofilizar pequeñas cantidades. Resulta
poco económico para equipos industriales, en estos el método más
frecuentemente usado para captar el vapor de agua consiste en el empleo de
condensadores, sobre los cuales el vapor de agua se deposita al estado sólido.
En equipos pequeños las bajas temperaturas se pueden obtener con nitrógeno
líquido ó con mezclas frigoríficas de hielo seco y alcohol.
En los liofilizadores de uso industrial se emplean equipos frigoríficos de
compresión mecánica.
Estos funcionan expandiendo gases frigorígenos en serpentines, produciendo de
esta manera el descenso de la temperatura.
Las temperaturas que se alcanzan con estos equipos son de entre -60 y 70º C.
Como agentes frigorícenos se emplean hidrocarburos fluorados y clorados del
tipo de los freones.
Para que el vapor de agua se transfiera desde la masa que se liofiliza hasta el
condensador, es necesario que la tensión de vapor de hielo del condensador sea
menor que la de la masa del producto que se liofiliza. Por esta razón se debe
mantener el condensador a una temperatura de alrededor de 20º C inferior al del
producto.

SECADO SECUNDARIO

La terminación del secado primario corresponde al momento en que se ha

sublimado la última porción de hielo.
El final de la sublimación se puede apreciar por una elevación de la temperatura
del producto.
Como durante el proceso, generalmente se aplica calor, la mayoría de los
equipos tienen un sistema que permite fijar la temperatura y mantenerla
automáticamente.
Esta temperatura se establece para cada producto, dependiendo de su
resistencia al calor, generalmente varia entre 30 y 50º C.
Finalizado el secado primario el producto contiene generalmente una cantidad
apreciable de agua, esta permanece adsorbida en la superficie del mismo, la que
es muy grande debido a su estructura porosa.
Esta agua residual puede ser perjudicial para muchos productos que podrían
deteriorarse al ser almacenados.
Es por esta razón que se efectúa el denominado secado secundario que
corresponde a la desorcion o liberación de gran parte del agua adsorbida.
Esta operación se realiza a temperatura constante y a alto vacío; junto con el
agua se extrae el oxigeno adsorbido.
La desorcion es un proceso continuo e indefinido, es decir no se llega a
contenidos de humedad igual a cero y no termina abruptamente como la
sublimación.
El secado secundario en la práctica finaliza cuando se estima que la humedad
residual no afectara al producto final, asegurándole una buena conservación.
Esta humedad residual se determina para cada producto.
El punto final del proceso, puede determinarse siguiendo una curva de peso del
producto (método de Kart Fischer u otro confiable)
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EQUIPOS DE LIOFILIZACION

Un equipo de liofilización se compone, en esencia, de una cámara de

desecación, un equipo de vació, un dispositivo para retener el agua sublimada y
algunos sistemas de control. (Ver esquemas adjuntos)
Los equipos industriales son mucho mas perfeccionados, pero constan de las
mismas partes esenciales.
Generalmente la cámara de desecación esta constituida por un recipiente
hermético del cual se puede evacuar el aire y obtener el grado de vació
necesario para el proceso, suele ser metálica con puertas amplias para la carga y
descarga del material y con visores que permiten observar el proceso.
La cámara esta conectada al sistema de vació, que en los equipos grandes, esta
constituido por 2 o mas bombas asociadas, por lo general, una rotativa para
efectuar el pre-vació, y una de difusión para producir vacíos mas elevados.
El sistema de condensación de agua funciona como ya se explicara
anteriormente, con equipos refrigerados con gases frigogenicos.
Este sistema de condensación o cualquiera que se utilice, siempre de estar
interpuesto entre la cámara de desecación y la bomba de vació, para evitar que
el vapor de agua extraído se introduzca en la misma.

CONTROLES DE PROCESO

Durante la liofilización, resulta indispensable controlar y regular las variables que

influyen en el desarrollo del proceso, generalmente se controlan el vació, la
temperatura del material que se liofiliza, la del condensador y la del sistema de
calefacción (temperatura del estante o placa donde se ubican los frascos con el
material a liofilizar).
Para medir el vació se puede emplear un vacuometro de Mc Leod , que mide la
compresión de un volumen conocido producida por una columna de mercurio, en
un capilar ó bien un vacuometro eléctrico de Piraní, que consiste en una espiral
de platino que se calienta con una corriente eléctrica.
El vació se aprecia midiendo la variaciones de resistencia eléctrica que
experimenta dicha espiral, esta pierde calor por convección a través del gas que
la circunda , al aumentar el grado de vació en el ambiente, diminuye la perdida
de calor por lo tanto el filamento aumenta su temperatura y también su
resistencia eléctrica que es lo que se mide.
La temperatura se controla con termómetros de diferentes tipos bimetalitos, de
termocupla, de variación de resistencia eléctrica etc.
La característica más sobresaliente de los productos liofilizados es su rápida
solubilidad, esto se debe fundamentalmente a la estructura extraordinariamente
porosa que presentan, con una gran superficie ya que el producto sólido ocupa
sustancialmente el mismo volumen de la solución ó masa inicial.
Debido a que el proceso se desarrolla a muy bajas temperaturas, las sustancia
lábiles al calor no experimentan alteraciones, por ala misma razón no se
producen reacciones enzimáticos ni proliferación de microorganismos, de esta
manera el proceso puede efectuarse en ambiente estéril.
El alto vacío a que se desarrolla permite especialmente en el secado secundario
eliminar el oxigeno en forma sustantiva, lo que garantiza la conservación de
productos oxidables, si se guardan en envases herméticos.
El tenor de humedad de los productos que se obtienen es muy bajo, pudiendo
alcanzar valores inferiores al 0,5%
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