Método de explante
Material y método
Se obtuvieron muestras de piel normal,
queloides y tejido circundante de queloides
de pacientes (18-30 años). Los pacientes no
presentaban lesiones orgánicas y la piel de
los lugares de muestreo no presentaba
infecciones ni ulceraciones.
se recolectaron los tejidos mediante escisión
quirúrgica y son cortados mediante
tijeras.después son cortados en cuadros o
tiras con un bisturí, son desinfectados con
gasa y alcohol, consiguiente se transfirieron a
un frasco de cultivo celular estéril que es
sellada y se almacena a 4 °C
Método de digestión
enzimática
El tejido dérmico se transfire a una placa
de seis pocillos y se corta en trozos finos
antes de agregar 1 mg / ml de
colagenasa I. La digestión es realizada a
37 ºC durante 1-3 h con agitación suave
para la digestión y cinco veces el
volumen de selenio añadió solución de
parada.
de tejido
Cultivo de fibroblastos derivados de queloides. El
tejido de la piel se transfiere del frasco a una placa de
Petri estéril y es lavado dos veces con la solución
D'Hanks. La capa de epidermis queloide se corta
utilizando un bisturí quirúrgico, y la parte central del
tejido queloide se mantiene para su posterior
procesamiento.
(1).Los tejidos son cortados en fragmentos de 1-3 mm (2).
Son transferidos a frascos de cultivo estériles.(3) Son
colocados lo más plano posible para aumentar el área
adherente. (4) Se seca y se adhiriere a la botella los tejidos
(5)Las botellas de cultivo se invierten.(6).Las botellas de
cultivo se incubaron con la adición de medio de cultivo
sumergiendo los fragmentos de tejido durante dos días.
(7).Después de dos o tres semanas, las células formaron
una monocapa
Identificación del
modelo celular
Cultivo de fibroblastos de piel normal. es similar al
método de cultivo de fibroblastos derivados de
queloides. pero por su delgadez hubo diferencias en
el proceso.
(a)se extraen los tejidos subcutáneos lo más
profundo posible hasta observar una capa granular
de glándulas sebáceas expuesta
(b) Se usa dispasa II para la separación de
epidermis y dermis, después se lava con PBS dos
veces para asegurar que no quedara epidermis.
Tinción por inmunofluorescencia, keloid-
fibroblastos circundantes derivadas de tejido
(KSF), y NF se inocularon en una placa de seis
pocillos a una concentración de 1x10 5 células /
pocillo. Cuando las células alcanzaron una
confluencia de ~ 60%, las células se fijaron y se
tiñeron con anticuerpo primario, anticuerpo
anti-vimentina de conejo . O anticuerpo
anti-a-SMA de conejo. Esto fue seguido por tinción
secundaria de anticuerpos con IgG anti-conejo de
cabra Alexa Fluor. Se utilizó DAPI para teñir el
núcleo celular. Las muestras se mantuvieron en la
oscuridad. La morfología celular se examinó con
microscopía de fluorescencia. Se contaron las
células positivas a vimentina.
 Morfología y contaminación de
Resultado bacterias, lípidos o células epiteliales.
Después de que se cultiven los fragmentos de tejido
queloide durante tres a cinco días, algunas células
comenzaron a crecer a partir del fragmento. Se llega
a observar algunas células fusiformes en los bordes
del tejido después de cinco días. Después de 12 días
se pudieron observar más células y comenzaron a
diseminarse.
La brecha entre los tejidos se vuelve más estrecha
mientras que aumentaba la densidad celular. Las
células KF crecieron rápidamente y se disocian del
tejido en un momento anterior en comparación con
NF. Las células KF podrían llegar a ocupar todos los
espacios libres entre los tejidos alrededor de los días
12-15.
Fig. 1 Crecimiento celular de NF y KF
en el método de explante de tejido.
explante de tejido
Los cultivos tendrán éxito si los tejidos se procesaron
dentro de las 4 h posteriores a la escisión quirúrgica,
ya que Las posibilidades de contaminación
bacteriana aumentaron cuando el tiempo de
almacenamiento exceda las 4 h.
Fig. 2. Un tiempo de almacenamiento prolongado puede
resultar en contaminación bacteriana o lipídica en el cultivo
celular, lo que además da como resultado un cultivo de
fibroblastos primario infructuoso.
Fig. 3 Crecimiento celular de NF y KF, se cultivaron fragmentos de
piel normal y tejido queloide mediante el método de digestión con
colagenasa después de la escisión quirúrgica.
Método de Método de digestión
con colagenasa I
Se forman pequeños grupos y se adhieren al fondo
de las placas de Petri. La forma de las células
comienzan a alargarse a las 48 h después de que los
queloides fueran digeridos y cultivados. A las 72 h,
se observó que las células se transforman de forma
redonda a fusiforme. Al quinto día, las células
adquirieron claramente una forma de huso. Se
observó la replicación celular desde el día cinco, y los
KF fueron confluentes y alineados en grupos
paralelos el día 10. La adherencia de las células
cultivadas a partir de tejido cutáneo normal tomó
más tiempo en comparación con las células de
queloides.Además se observó adherencia celular a las
72 h, y hubo replicación celular al quinto día. Las
células NF se habían extendido completamente al
décimo día, pero no eran tan confluentes como KF