Rev. salud pública.

11 (1): 3-13, 2009

Torres - Patrones transmisión Lepra 3
Artículos Originales/Original Articles

Genotipificación de Mycobacterium leprae

Colombiano para la Determinación de
Patrones de Transmisión de la
Enfermedad
Genotyping Colombian Mycobacterium leprae for determining
disease transmission patterns
José F. Torres-Ávila, Claudia L. Colorado, Luís A. Gamboa, María J. Araujo,
Clara I. León-Franco y Martha I. Guerrero-Guerrero
Centro Dermatologico Federico Lleras Acosta. Bogotá, Colombia. fernandot85@gmail.com
claucolor@yahoo.com,gamboaluisart@yahoo.com,mariaaraujo@yahoo.com, clarainesleon@yahoo.com,
marthainiridag@yahoo.com,

Recibido 4 Agosto 2008/Enviado para Modificación 5 Enero 2009/Aceptado 15 Enero 2009

RESUMEN

Objetivo Evaluar la variabilidad de VNTR (variable-number tandem repeat) de

Mycobacterium leprae de pacientes colombianos con y sin tratamiento previo
para identificar posibles fuentes de infección y entender los patrones de transmi-
sión de la enfermedad.
Metodología Estudio transversal descriptivo, en donde mediante un muestreo
electivo a conveniencia se tomaron 161 biopsias de pacientes multibacilares de
lepra, que habían sido solicitadas para diagnóstico y seguimiento de la enferme-
dad, de las cuales se realizó extracción de ADN de M. leprae y usando la técnica
de PCR para VNTRs de M. leprae estandarizada, se establecieron los genotipos
y los diferentes clusters mediante el agrupamiento apareado UPGMA.
Resultados En las 161 muestras totales se hallaron 22 genotipos VNTRs diferen-
tes, de las cuales 100 muestras (62,1 %) pertenecían al genotipo único VNTRU, y
de los genotipos restantes, los mayoritarios, es decir los que dieron lugar a for-
mación de grupos o clusters fueron VNTR17 (5,6 %), VNTR20 (4,3 %), VNTR18
(4,3 %), VNTR14 (4,3 %) y VNTR13 (3,7 %).
Conclusión En este estudio se evidencia por análisis de agrupamiento que se
pueden detectar clones con diferente grado de virulencia/agresividad, lo cual im-
plica la necesidad de incrementar varias de las actividades del programa de
control que darán como resultado la verdadera disminución de la transmisión del
microorganismo.

Palabras Clave: Mycobacterium leprae, lepra, epidemiología molecular,

dermatoglifia del ADN, secuencias repetidas en tandem, Colombia (fuente: DeCS,
BIREME).

3
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ABSTRACT

Objective Assessing VNTR (variable-number tandem repeat) variability of

Mycobacterium leprae from Colombian patients with and without prior treatment to
identify potential sources of infection and to understand the patterns of disease
transmission.
Methodology This was a descriptive cross-sectional study where a convenience
sample of biopsies was taken from 161 multibacillary leprosy patients; diagnosis
and monitoring of the disease had been requested for these patients. DNA was
extracted from M. leprae and standardised using the PCR technique for M. leprae
VNTR, ge-notypes were established and different clusters grouped by unweighted
pair group method with arithmetic mean (UPGMA).
Results 22 different VNTR genotypes were found from 161 samples, of which 100
samples (62.1%) had a single u-VNTR genotype and the remaining genotypes
were VNTR 17 (5.6%), VNTR 20 (4.3%), VNTR 18 (4.3%), VNTR 14 (4.3%) and
VNTR 13 (3.7%), namely those forming groups or clusters.
Conclusion This study showed that clones can be detected with varying degrees of
virulence / aggressiveness by cluster analysis, implying the need for more
monitoring programme activities which will result in a real decline in microorganism
transmission.

Key Words: Mycobacterium leprae, leprosy, epidemiology, molecular, DNA

finger-printing, tandem repeat sequence, Colombia (source: MeSH, NLM).

R
ecientemente la OMS ha reportado que la carga de lepra se ha reduci-
do, pero que en el futuro van a seguir apareciendo nuevos casos (1).
En el caso de Colombia actualmente se reporta una lenta tendencia a
la disminución de la incidencia de lepra debido a la baja en los reportes de un
año a otro (2005 a 2006). Esta disminución de casos, probablemente no sea
real sino que la búsqueda de casos actualmente puede ser menor (1).

Estudios realizados acerca de la transmisión y la identificación de las fuen-

tes de infección de lepra, han sido difíciles de realizar debido al largo período
de incubación de la enfermedad y aparición de las manifestaciones clínicas, y
a que el M. leprae sigue siendo un microorganismo no cultivable en medios
artificiales (2). Todos estos factores, han influido en retardar el entendimiento
de las rutas de transmisión de M. leprae y se siguen haciendo esfuerzos en el
diseño de estrategias efectivas en el enfoque quimioterapéutico para la elimi-
nación de la enfermedad.

Por tanto, los métodos de tipificación de cepas de M. leprae pueden ser de

gran ayuda para el conocimiento epidemiológico de este microorganismo y
ayudar a identificar las fuentes de infección para entender sus patrones de
transmisión y poder diferenciar entre los eventos de recaída y reinfección (3).
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Hoy en día la transmisión de este microorganismo se ha abordado con el

enfoque de la epidemiología molecular, y esta, podría darnos claras explicacio-
nes, debido a que con estas metodologías se usan marcadores genéticos del
microorganismo como son las secuencias repetitivas y los polimorfismos VNTR
(Variable-Number Tandem Repeat) y más recientemente la genotipificación
de Mycobacterium leprae mediante el uso de micro satélites que son unida-
des repetitivas de 6 a 100pb que son excelentes fuentes de polimorfismo, que
nos sirven para investigar la diversidad genética en una población bacterial y
además resulta ser un instrumento útil para rastrear cadenas de transmisión
cortas (4).

Varios estudios aplicando técnicas moleculares como son el análisis de RFLP

de diferentes secuencias blanco incluyendo las repeticiones MLEP,
polimorfismos conformacionales de cadena simple y los polimorfismos en la
secuencia del ADN de la región interna de la trascripción (ITS entre 16S y 23S
de rRNA), han sido llevados a cabo, pero no han evidenciado asociación con
variabilidad de los aislamientos (4). Además, ha sido descrita una es-tructura
única polimórfica del gen polA y de 3 a 4 copias repetidas de GA-CATC en el
gen rpoT pero su valor para identificar genotipos de M. leprae ha sido limitada
(3). Recientes desarrollos en tipificación molecular y de análisis de genomas in
silico han revelado que el análisis del número de secuencias VNTRs podría
ser una herramienta promisoria para la tipificación de cepas. En un reporte
reciente se observó variación en 10 de 37 copias de un único locus de repeti-
ción TTC en M. leprae sugiriendo aplicabilidad de esta genotipificación para
estudios de epidemiología molecular (5).

Usando MIRUs (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit) así como un

blanco VNTR para tipificación, en M. tuberculosis, se ha comprobado que es
necesario realizar análisis simultáneos de repeticiones en diferentes loci para
obtener suficiente poder de diferenciación entre cepas, lo cual se ha extrapolado
al estudio de M. leprae (6).

Análisis in silico del genoma de M. leprae identificaron algunas de las

secuencias VNTRs en el genoma y desarrollando 4 sistemas individuales de
PCR, demostraron por electroforesis en gel de agarosa y por secuenciación, la
asociación entre el tamaño de las secuencias y la variabilidad de la cepa de M.
leprae de los pacientes de Rió de Janeiro (7). La variabilidad del tamaño de los
VNTRs observada en dichos pacientes fue confirmada en pacientes de dife-
rentes partes del mundo, luego ellos mismos demostraron la especificidad de
estos sistemas de PCR para M. leprae aplicando este sistema a varias espe-
cies de micobacterias y a ADN humano (7).
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Adicionalmente se obtuvo exitosamente productos de amplificación de los

4 sistemas desarrollados, a partir de muestras de biopsias congeladas de pa-
cientes multibacilares y paucibacilares, de muestras de linfa tanto de pacientes
multibacilares y paucibacilares y de algunas biopsias de nervio de pacientes
con lepra neural pura. Posteriormente se dieron cuenta que todos los sistemas
permitieron obtener productos de PCR a partir de muestras de biopsia embe-
bidas en parafina permitiendo así realizar estudios retrospectivos y evaluar
modificación o migración de cepas de M. leprae a través de periodos largos
de tiempo (3).

En este estudio se propuso por lo tanto, evaluar la variabilidad de VNTR de

Mycobacterium leprae de pacientes colombianos con y sin tratamiento previo
para identificar posibles fuentes de infección y entender los patrones de transmi-
sión de la enfermedad.

MÉTODOS
Se realizó un estudio de corte transversal descriptivo, incluyendo biopsias de piel
de pacientes colombianos que asistieron al Centro Dermatológico Federico Lleras
Acosta E.S.E. (CDFLLA) durante el periodo 2000 a 2004, en busca de diagnós-
tico o seguimiento del tratamiento de lepra, usando un muestreo electivo a conve-
niencia, en el cual se encontraron en el banco de biopsias institucional 435 biopsias
correspondientes a pacientes atendidos durante este periodo, de las cuales se
tomaron 161 biopsias que cumplían con los requerimientos para su estudio y
análisis; correspondiendo 85 biopsias a las que se tomaron para hacer seguimien-
to o control de la enfermedad de Hansen y 79 biopsias para realizar diagnóstico.

Obtención de las muestras de ADN

Se realizaron 6 cortes de 4μm a cada muestra de biopsia incluida en parafina,
con un micrótomo Leyca®, se almacenaron a temperatura ambiente hasta su
procesamiento y a partir de estas muestras se realizó extracción de ADN total
con el método de Triton- X100 al 1 %. La calidad del ADN extraído se evaluó
mediante una corrida electroforética de 5 ìl en gel de agarosa al 0,8 %.

Selección de los iniciadores para amplificación

Después de revisar la literatura disponible, así como las bases de datos Le-proma
(8), Lgmb (9) y Sanger (10), se escogieron entre las secuencias más usadas en
la tipificación de cepas de M. leprae, las que encontramos más relevantes que
fueron las siguientes: GAA, AT17, TA18, GTA9 (3,4), amablemente donados
por Patrick Brennan, de la Universidad de Colorado, USA.
 Torres - Patrones transmisión Lepra 7

Estandarización
Para realizar la genotipificación de M. leprae con los marcadores selecciona-
dos (GAA, AT17, TA18, GTA9) se estandarizó y optimizó previamente cada
parámetro como fue las concentraciones de MgCl2, dNTP’s, iniciadores para
los 4 blancos, y del ADN plantilla; igualmente la temperatura de anillamiento y
el número de ciclos. Como controles se usaron tres muestras de ADN de M.
leprae de referencia donado por la Universidad de Colorado (USA), que fue-
ron T-53, TM-4923 y 4316.

Amplificación
Una vez optimizados los parámetros para cada uno de los cuatro blancos
moleculares se realizó amplificación de todas las muestras usando las
condi-ciones óptimas en cada caso, para un volumen final de 25 μl.

Obtención de patrones genotípicos

Los productos de PCR de cada uno de los cuatro VNTRs, fueron usados para
realizar corridos electroforéticos, empleando 10 μl del producto de PCR de
cada blanco molecular en un gel de agarosa del 2,5 % (Invitrogen). Como
marcador de peso molecular se uso un ADN leader 100 pb (Sigma), entre 100
y 1000 pb en los dos extremos del gel. Los geles fueron fotografiados y poste-
riormente se obtuvo archivos digitales de ellos.

Análisis
Se realizó un análisis de agrupamientos, a partir de una matriz de similaridad
construyendo los respectivos dendogramas, previa inclusión y homogenización
de los archivos digitalizados, en el programa de análisis GelComparII
(www.appliedMath’s.com) cuyo acceso fue gentilmente proporcionado por el
fabricante.

El análisis o comparación de los patrones de bandas (Fingerprint) se hizo

basado en la posición combinada de las cuatro bandas, utilizando el coefi-ciente
Dice que dio lugar a la matriz de similaridad. A partir de la matriz se realizó un
análisis de agrupamientos basado en UPGMA y el dendograma se obtuvo
optimizando al 1 % y con una tolerancia del 1 % en la posición de las bandas y
se le dio igual peso a cada uno de los cuatro sistemas VNTRs usado. Teniendo
como base los grupos o clusters obtenidos, se determino las proporciones de
cada una de las variables demográficas, clínicas y epidemiológicas que ellos
contenían y se compararon entre sí con el fin de identificar los agrupamientos
o clones con características específicas.
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RESULTADOS

En la población estudiada se encontraron 22 genotipos diferentes y la mayor

proporción de estos genotipos correspondió al 62,1 % de las muestras con
genotipo único (VNTRs U).

Tabla 1. Descripción de las variables demográficas

en relación con los genotipos

Entre los genotipos restantes, los mayoritarios, es decir los que dieron lugar
a formación de grupos o clusters fueron VNTR17 9(5,6 %), VNTR20 7(4,3
%), VNTR18 7(4,3 %), VNTR14 7(4,3 %), y VNTR13 6(3,7 %).

Interesante resaltar que se encontraron miniclusters, es decir agrupamientos

de 3 ó 4 cepas que fueron los genotipos VNTR 11, VNTR 12, VNTR15 y
VNTR9. Los principales hallazgos obtenidos del análisis de las variables de-
mográficas, clínicas y epidemiológicas en relación con los genotipos encontra-
dos, se presentan en las Tablas 1, 2 y 3 respectivamente.
 Torres - Patrones transmisión Lepra 9

Tabla 2. Descripción de las variables clínicas en relación con los

genotipos VNTRs mayoritarios encontrados

DISCUSIÓN

La genotipificación del M. leprae en este estudio se abordó pensando que

podría ser de gran valor para el conocimiento epidemiológico de este microor-
ganismo y ayudarnos a identificar las fuentes de infección, permitiendo enten-
der sus patrones de transmisión, y distinguir entre los eventos de recaída y
reinfección.

Recientes desarrollos en tipificación molecular y de análisis de genomas in

silico revelaron que el análisis del número de secuencias VNTRs son una
herramienta promisoria para la tipificación de cepas.

Aunque muy recientemente el grupo de Cole S, publica un estudio en el que

aseguran que estos 4 VNTRs no son lo suficientemente estables en el tiempo
como para ser usados como marcadores moleculares robustos, sin embargo,
existen varios estudios como los arriba mencionados, que evidencian lo contrario
(11).
10 REVISTA DE SALUD PÚBLICA · Volumen 11(1), Febrero 2009

Tabla 3. Descripción de las variables epidemiológicas en relación con los

genotipos VNTRs mayoritarios encontrados

Entre los 22 genotipos encontrados, con el sistema estandarizado y

optimizado para este estudio, tres de los genotipos mayoritarios agruparon 100%
de individuos de genero masculino, lo cual podría indicar predilección por este
tipo de hospederos, sugiriendo que es un marcador de cepas poco virulentas
que prefieren el hospedero menos resistente que les permita multiplicarse mas
fácilmente, característica que se refuerza cuando observamos que estos
genotipos también son mas comunes entre los individuos pertenecientes a gru-
pos de edad mayores que los promedios encontrados en este estudio (21-41
años) y que los reportados como los de mayores incidencias en Colombia (15-
44 años) como en el caso especifico del genotipo VNTR20. Igualmente, este
sería un hallazgo que nos explicaría el hecho de que se encuentren tiempos de
incubación de la enfermedad tan amplios como los reportados en la epidemiologia
clásica de la lepra de 2 a 20 años (12), implicando la existencia de diferentes
clones de M. leprae con diferentes grados de virulencia, como se ha reportado
en otras bacterias (13). En consecuencia, se evidencia que si aun circulan
genotipos poco virulentos en la comunidad, es porque las medidas de control no
han sido lo suficientemente efectivas como para eliminarlos y que la enferme-
dad se está perpetuando a costa de estos casos que se demoran hasta 20 años
en evidenciarse clínicamente, dando la impresión de que tal comunidad se
encuentra en etapa de pos eliminación de la enfermedad como actualmente se
cree en Colombia.

En el ámbito mundial mucho se ha discutido sobre la existencia de suscep-

tibilidad genética para desarrollar lepra, por el hecho de existir familias de
leprosos como existe de tuberculosos, en los cuales el gen NRAMP está impli-
cado (2), y esto es ahora un paradigma ampliamente aceptado para la mayoría
 Torres - Patrones transmisión Lepra 11

de las enfermedades infecciosas (14); específicamente en lepra, se han iden-

tificado genes en la región HLA como factores de susceptibilidad del hospede-
ro para la lepra, también se han identificado locus de susceptibilidad en la
región cromosomal 10p13 en familias de la India (15) y en Brasil el papel que
tendría la región 6p21 y 17q22 en esta susceptibilidad (16); por lo tanto, nues-
tro hallazgo sobre la mayor frecuencia de los genotipos VNTRU, VNTR20,
VNTR17 y VNTR14 en los enfermos oriundos de Santander, y de los genotipos
VNTR18 y VNTR13 en los nacidos en Boyacá, es totalmente concordante
con tales aseveraciones, teniendo en cuenta que la presencia de factores
genéticos del hospedero incrementa el riesgo de sufrir la enfermedad después
de la exposición al agente infeccioso. Este hallazgo implica que desde la pers-
pectiva de la salud pública, se deben incrementar medidas de control tan sim-
ples como son el seguimiento periódico de los convivientes para la detección
precoz de la enfermedad y la rápida implementación de la quimioterapia que
corte la cadena de transmisión.

En este mismo sentido encontramos que la mayor frecuencia de posible

caso índice, correspondió al primero y segundo grado de parentesco, pero cree-
mos que este evento se encuentra mas relacionado con la convivencia mas
estrecha que se tiene con padres y hermanos similar a lo que se ha encontrado
en tuberculosis, donde se observa que se llegan a compartir no solo la casa sino
también la habitación e incluso el lecho (Comunicación personal: Arbeláez MP. Uni-
versidad Antioquia; 2007).

Por ende, el encontrar genotipos con una distribución geográfica específica

sería lógico desde la perspectiva del agrupamiento familiar que han reportado
estudios de la epidemiología clásica de la lepra (9)

El haber encontrado varios genotipos VNTR17, VNTR18, VNTR13 y

VNTR14, que agrupan exclusivamente casos de la forma LL polar, y que
posee mas del 70 % de muestras ZN (+), nos indicaría que nuestro sistema
podría ser marcador de clones que se multiplican mas rápidamente que otros,
indicando también que en Mycobacterium leprae existen clones más exitosos
que otros como ya se ha documentado en otras bacterias (17); sin embargo,
este hallazgo podría estar más relacionado con las características genéticas de
susceptibilidad del hospedero, ya mencionadas, para la presentación de especí-
ficas formas clínicas de la enfermedad.

Uno de los genotipos mayoritarios mostró que es el más frecuente entre los
casos ya tratados: sospechosos de resistencia/persistencia y recaídas y que el
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50 % de las cepas que agrupa, estaban causando recaídas de la enfermedad,

hallazgo que podría sugerirnos la existencia de clones que pueden permanecer
metabólicamente inactivos durante mayores periodos de tiempo y por lo tanto
ser los responsables de las recaídas de la enfermedad porque permanezcan
latentes aún durante el tratamiento (18) desde el punto de vista del Programa
de Control, sería muy importante poder ratificar este hallazgo puesto que ser-
viría para predecir cuales son los pacientes que se encuentran con mayor
riesgo de presentar recaídas de la enfermedad por portar clones específicos,
para lo cual, se hace necesario tener como rutina la genotipificación de las
cepas de los pacientes desde que se diagnostica la enfermedad y así saber a
cuales pacientes se les debe reforzar la vigilancia después del tratamiento.

Sin desconocer que el presente es un estudio de tipo descriptivo, subraya-

mos que este es el primer estudio que se realiza en Colombia caracterizando
genotípicamente las cepas de Mycobacterium leprae que circulan o han cir-
culado en nuestro medio. Si se compara con los reportes mundiales, el número
de muestras incluido es grande. Igualmente, el número de variables analizadas
en estas muestras también fue amplio y cubrió los tres aspectos clásicamente
considerados importantes en la transmisión de la enfermedad. Por lo anterior y
teniendo en cuenta que fueron escasas las agrupaciones exclusivas de varia-
bles en un genotipo, se evidencia que el poder conjunto de estos cuatro marca-
dores no es muy robusto y que para mejorarlo sería conveniente ampliar el
panel a los 16 marcadores que actualmente han sido desarrollados.

A pesar de lo reportado por el grupo de Stewart Cole (11), respecto a la

poca estabilidad de estos marcadores a través del tiempo, en nuestro estudio si
se pudo observar que varios genotipos se presentaron durante el periodo de
cinco años, en pacientes con tiempos de evolución de la enfermedad amplia-
mente diferentes en casos epidemiológicamente relacionados.

En este estudio se corrobora que como Colombia representa un país donde

la lepra es endémica, los estudios de este tipo podrían ser útiles para el estable-
cimiento y evaluación de las estrategias de control de la enfermedad,
específicamente en lo que se refiere a la necesidad de implementar
rutinariamente la genotipificación de las cepas, para identificar localizadamente
la necesidad de incrementar la actividad de seguimiento de convivientes y la
actividad de vigilancia de pacientes pos tratamiento que conjuntamente ayuda-
rán a lograr la eliminación de la lepra, como problema de salud pública en
nuestro medio ♦
 Torres - Patrones transmisión Lepra 13

Agradecimientos. Esta investigación fue totalmente financiada por el Centro

Dermatológico Federico Lleras Acosta E.S.E., bajo el proyecto código 4000-16.2H. Los
autores agradecen al doctor Patrick Brennan de la Universidad de Colorado (USA) por
la donación de los ADN de referencia y de los oligonucleótidos iniciadores utilizados
para la amplificación de los VNTRs. Igualmente agradecemos a AppliedMath’s org, por
el amable suministro (open access) del programa Gel Comprar II utilizado para análisis
genotípico.

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