Tráfico vesicular

Biología celular – 2005-06

El transporte a lo largo de la ruta de secreción

es vesicular, con diferentes tipos de vesículas que
se forman en los diferentes compartimentos y que
son direccionadas de manera eficiente hacia el
compartimento de destino.

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-50, p. 734

1
 Lodish 2003, table 17-1

Tráfico vesicular

Las etapas en un paso de transporte mediado por vesículas (tráfico vesicular) :

1. ‘Sorting’ o clasificación del material a ser transportado

2. Vesiculación (‘budding’), mediante el reclutamiento de proteínas citosólicas

que recubrirán la vesícula formada

3. Desprendimiento de las proteínas de la cubierta

4. Direccionamiento / transporte de la vesícula, a un destino especificado por

las proteínas de direccionamiento.

5. Reconocimiento de la membrana diana.

6. Fusión de las membranas y liberación del contenido del orgánulo

2
 Componentes de las vesículas
vesiculación

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, fig 17-51

Caveolina transcitosis ?, señalización?

Tráfico vesicular en la
ruta de secreción

Caveolin
CCV : ‘Clathrin coated
vesicles
vesiculación

COPI

COPII

Farquhar and Palade (1998) The Golgi apparatus : 100 years of progress and controversy. TCB 8 : 2-10 (tcb8-01-02)

3
 Cubiertas de clatrina, COP I y COPII
vesiculación

Figure 17-35
Lodish (2000) Molecular Cell Biology, fig. 17-52 Robinson (1997) Coats and vesicle budding. TCB 7: 99-102, bar 230 nm

Distribución de las diferentes cubiertas en la via de secreción

CCV
vesiculación

COPI

COPII

4
 Vesículas recubiertas de clatrina Polimerizacion clatrina (web)

Descubierta a partir de aislamiento de vesículas recubiertas (‘coated pits’) en

oocitos de Aedes aegypti. Con un diámetro entre 50 y 100 nm

El elemento básico es la clatrina, proteína heterodimérica formada por 3

cadenas pesadas (1675 AA, 180 Kda, codificada por HC17) y tres ligeras
(35-40 Kda), en una estructura denominada triskelion. Existen dos tipos de
vesiculación

cadenas ligeras, alfa y beta, con una similaridad de un 60%.

La polimerización de clatrina es dependiente de concentración (conc crítica)

Fotin, Cheng, Grigorieff, Harrison, Kirchausen, Walz (2004) ‘Molecular model for a complete clathrin lattice from electron
cryomicroscopy. Nature (elec publis Oct 2004)

5
vesiculación

Steer y Hanover (1991) Intracellular transport

of proteins, Cambridge Univ Press, p. 61

¿cómo se encuentra la clatrina en la célula?

En la célula la autopolimerización de la
clatrina está limitada pues el pool de
triskelions soluble está secuestrado por
hsp70 (chaperona citosólica), en un
mecanismo análogo al de respuesta a
vesiculación

las proteínas mal plegadas del RER.

Steer y Hanover (1991) Intracellular transport

of proteins, Cambridge Univ Press, p. 72

Uncoating 70 Kda
ATPase

6
 La clatrina se une a las membranas mediante unas proteínas : adaptadores
Entre la red de clatrina y la membrana de la vesícula hay un espacio de
20 nm en el que se encuentran las partículas de proteínas adaptadoras,
de 350 Kda. ‘Mickey mouse’ structures

Se han descrito 4 complejos

de adaptadores diferentes
vesiculación

Los adaptadores reconocen las

regiones de membrana que
contienen receptores con la señal
de transporte . Por ejemplo, la
subunidad micra2 de AP2 se une TGN
a : TyrXXhidrof / LL
Los adaptadores :
- reconocen el cargo
- reclutan clatrina
- reclutan proteínas auxiliares
Rolbinson y Bonifacino (2001) Adaptor
related proteins COCB 13:444-453 (cocb13-04-13)

GGA : Golgi-localized γ ear containing, ARF binding protein

vesiculación

Rolbinson y Bonifacino (2001) Adaptor related proteins COCB 13:444-453 (cocb13-04-13)

7
 Miembros de la familia de proteínas Stoned B
vesiculación

Rolbinson y Bonifacino (2001) Adaptor related proteins COCB 13:444-453 (cocb13-04-13)

8
vesiculación

Purified clathrin triskelion reacted with HA-II

Steer y Hanover (1991) Intracellular transport

of proteins, Cambridge Univ Press, p. 66

Dinamina

Proteína GTPasa asociada a los ‘coated pits’. Identificada en Drosophila como

shibire, incapaz de endocitar via ‘coated pits’. Se aisló a partir de shibirets.

Citosólica, de 900 AA, se une al coated pit y polimeriza. La hidrólisis de GTP

regula la contracción de la dinamina. Los mutantes dinamina GTP- forman
largos ‘cuellos’ que no se separan de la membrana.
vesiculación

Terminales nerviosos
incubados con GTP-
gammaS. Anti-dinamina.

Lodish (2000) Molecular Cell

Biology, f. 17-55, p. 737
Takel et al (1995) Nature
374 : 186

9
vesiculación

Modelo de formación de ‘coated pits’

1. Reconocimiento de la membrana (y de
los receptores) por los adaptadores
2. Unión de triskelions, polimerización

3. Crecimiento de la malla de triskelions

vesiculación

4. Unión de dinamina, contracción

5. Separación de la vesícula, recubierta

6. Pérdida de la cubierta proteica

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17.54, p. 737

10
 Vesículas COPI
Aisladas por Rothman et al en ensayos ‘in vitro’ de transporte intraGolgi ( Golgi,
ATP, soluciones tampon, etc…).

Recubiertas por unos complejos citosólicos que denominó coatómero (alfa, beta,
gamma, delta, épsilon, p20, ARF1) y que polimerizan sobre la vesícula con unas
funciones similares a las de los adaptadores y la clatrina, reconociendo la región
citosólica de receptores y deformando la membrana para formar la vesícula.
vesiculación

Implicadas en el transporte retrógrado

dentro del complejo de Golgi y entre éste
y el RER.

Vesículas COPI, purificadas de Golgi de

hepatocitos de rata incubado con citosol y ATP

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-56, p. 738

Sistema de transporte intra-Golgi libre de células

vesiculación

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-57, p. 739

11
 Componentes citosólicos de las vesículas COPI
vesiculación

Wieland y Harter (1999) COCB 11:440-446 (cocb11-4-05.pdf)

Arf1p 20kDa smGTP-BP, N-term myristoilated

Coatomer 70 kDa complex comprised of seven units (α, β, β’, χ, δ, ε y ξ)

RET1, SEC26, SEC27, SEC21, RET2 Y RET3 codifican las
subunidades (α, β, β’, χ, δ y ξ respectivamente, en Saccharomyces cerevisiae
El subcomplejo α, β’ y ε reconoce la secuencia KKXX in vivo

ARF

ADP-ribosilation factor. Se han descrito tres en levaduras, y seis en células de

mamífero.

smGTP-BP : ARF-GDP (citosólica)

ARF-GTP (unida a membrana)

La unión de ARF a la membrana se produce por el ácido miristílico de N-ter en una

región de 17 residuos amfipáticos.
vesiculación

- En levaduras ARF1 y ARF2 son identicos en un 96%, son intercambiables, y el

doble mutante arf1- arf2- es letal
- ARF1-yeast vs ARF1-hum es 77% identico, ARF2-yeast vs ARF5-hum es 69%
identico
- Se han diferenciado tres clases de ARF en mamíferos :
1- clase I. ARF1, 2 y 3. Ensamblaje de vesículas en Golgi-ER-endosomas,
por ej clatrina-AP1 en TGN, clatrina-AP3 en endosomas y COPI en Golgi
2- clase II. ARF4 y 5. Se conoce muy poco
3- clase III. ARF6, en membrana plasmática / endosomas

Jackson y Casanova (2000) Turning on ARF: the Sec7 family of guanine-nucleotide

exchange factors. TCB 10 : 60-67, (tcb10-2-11.pdf)

12
 Papel de ARF-GTP en el ensamblaje de COPI y en la selección del cargo
vesiculación

Wieland y Harter (1999) COCB 11:440-446 (cocb11-4-05.pdf)

Modelo de la acción de ARF en el

ensamblaje de las cubiertas COPI

ARF precisa de GEF específicas.

Todas ellas (sec7 family of GEF)
contienen un dominio Sec7 (200 AA).
vesiculación

Jackson y Casanova (2000) TCB 10 : 60-67

(tcb10-2-11.pdf)

Chavrier y Gould (1999) COCB 11 : 466-475(cocb11-4-09.pdf)

13
 Modelo de formación de las vesículas COPI

1. ARF-GTP se activa (une GTP)

vesiculación

2. ARF-GTP se une a su receptor en

la membrana del Golgi
3. Reclutamiento de coatómero
4. ‘Budding’
5. Separación de la vesícula (requiere
Fatty-Acil-CoA) (?)

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-58, p. 740

6. ARF hidroliza GTP, liberando

el coatómero.

La vesícula queda descubierta

vesiculación

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-58, p. 740

14
 Positive and negative feedback
mechanisms control the guanine
nucleotide bound by ADP-
ribosylation factor (ARF)
vesiculación

Roth (1999) Lipid regulators of membrane traffic through the Golgi complex
TCB 9 : 174-179

Evidencias de la implicación de las vesículas COPI en el transporte retrógrado

en el Complejo de Golgi y entre éste y el RER

1. Células de levadura que expresan mutantes ts de componentes de COPI

presentan fenotipo sec clase B (retención ER) ¿está COPI implicada en la
salida de ER a Golgi?

2. Receptor KDEL, recuperación de proteínas del RER, tiene señal KKXX en

dominio citoplasmático, reconocida por COP alfa / beta. Mutantes ts de COP alfa/
vesiculación

beta no reciclan las proteínas del RER escapadas… con el tiempo el RER se
queda sin proteínas propias, lo que impide la salida de las de nueva síntesis,
produciendo un fenotipo sec clase B
Lodish, 2003

15
 Vesículas COPII

Aisladas a partir de un extracto del RER incubado con citosol, ATP, GTP, …

Mutantes de COPII son sec de clase B

Sec12 cataliza la activación de Sar1 (homóloga a ARF) intercambiando GDP

por GTP. La unión de Sar1-GTP a la membrana recluta el complejo formado
vesiculación

por Sec23 / Sec24, seguido de la unión de Sec13 / Sec31. Posteriormente se

une Sec16, una proteína fibrosa que interacciona con los dos complejos previos
(Sec23/24 y Sec13/31) actuando a modo de ‘scaffold’ de la vesícula.

Las proteínas del RER reclutadas en las vesículas COPII contienen una señal
diacídica (Asp-X-Glu).

Experimentos con proteínas quiméricas VSV-G-GFP muestran que las vesículas

COPII migran hasta 1 micra para fusionarse con el Golgi. En otros casos, en los
que la distancia ER - Golgi era mayor, se ha observado la fusión de varias vesículas
COPII formando el ‘compartimento intermedio ER-Golgi’. Estas vesículas (CI)
son transportadas por MT hasta el Golgi.

Componentes citosólicos de las vesículas COPII

Sar1p 24 kDa smGTP-BP, similar a ARF-type GTP-BP

Sec23 complex Formado por Sec23p y Sec24p. Sec23p es la proteína activadora

vesiculación

GTPasa de Sar1p. Sec24p es necesaria para la unión del

complejo Sec13 a la membrana.

Sec13 complex Formado por Sec13p y Sec31p.

16
 Secuencia de reclutamiento de los componentes citosólicos de COPII en una
membrana del RER
vesiculación

GEF

Kuehn y Scheckman (1997) COPII and secretory cargo capture into transport vesicles COCB 9 :477-483

Todas las vesículas formadas (CCV, COPI Y COPII) pierden las cubiertas
poco después de formarse, pero en ellas permanecen un conjunto de proteínas
Desprendimiento / direccionamiento / reconocimiento

implicadas en el direccionamiento y reconocimiento de la membrana diana :

hipótesis SNARE. Estas proteínas son comunes a todos los tipos de vesículas.

17
 Elementos de direccionamiento de vesículas y reconocimiento de membranas

1. SNARE-v. Receptor de la membranan de la vesícula, queda descubierto

cuando la vesícula pierde la cubierta. Es el receptor vesicular, característico
direccionamiento / reconocimiento

de cada membrana donadora.

2. SNARE-t. Receptor de la membrana diana, reconoce a la SNARE-v comple-

mentaria y asegura el reconocimiento de la membrana aceptora.

3. Rab. smGTPase. Proteína smGTP-BP, 200 AA, familia ras (Rab = ‘ras from
brain’. Más de 30 conocidas en mamíferos. Implicada en la activación de los
mecanismos que aseguran el transporte de la vesícula y el reconocimiento de
la membrana diana.

4. SNAP-25. Proteína de fusión, ubícua.

5. NSF. N-etilamide sensitive factor, proteína soluble, ATPasa

6. γ-SNAP, ‘Soluble NSF Attached Protein’

direccionamiento / reconocimiento

18
 Modelo de ciclo funcional de las proteínas Rab
direccionamiento / reconocimiento

Chavrier y Goud (1999) The role of ARF and GTPases in membrane transport COCB 11 : 466
direccionamiento / reconocimiento

19
direccionamiento / reconocimiento

Chavrier y Goud (1999) The role of ARF and GTPases in membrane transport COCB 11 : 466

La fusión de membranas

El proceso de fusión de membranas es muy común en multitud de procesos

celulares. En general se diferencian dos tipos :

1. Fusión endoplásmica, en la que las caras citosólicas de las membranas se

fusionan.

2. Fusión ectoplásmica, en la que son las caras de las membranas que se

fusión

encuentran en contacto con el medio extracelular las que se fusionan

(fertilización, formación de sincitios, entrada de virus a las células, etc…)

Todos los procesos de fusión de membranas son similares

1. Gran parecido entre las estructuras de las proteínas fusogénicas celulares

y las que permiten la entrada de virus (p ej hemaglutinina)

2. Lípidos que inhiben la fusión viral también inhiben la fusión de membranas

en general.

20
 Dos hipotéticas estructuras del
sitio inicial de fusión de membranas

Stalk : ‘is the minimal lipidic structure

that merges the contacting leaflets of
the fusing bilayers. It has a specific
geometry that differentially packs
lipids’
fusión

Connexon like structure : ‘this proteinaceous

fusion pore is initially closed, then opens to
first form a pore than then radially expands to
mix lipids between protein subunits’

Zimmerberg (2001) How can proteolipids be central players

in membrane fusion? TCB 11 : 233 (tcb11-06-11.pdf)

Un modelo de fusión mediante proteínas : subunidad VO de la ATPasa vacuolar

fusión

Modelo de rotación de la subunidad VO. Las subunidades de una membrana

intercambian con las de la otra membrana y como consecuencia las membranas
se fusionan.

Zimmerberg (2001) How can proteolipids be central players in membrane fusion? TCB 11 : 233
(tcb11-06-11.pdf)

21
 Pero al final… el intermediario es siempre
un lípido, pues las dos láminas de las
membranas se tienen que mezclar…
fusión

Zimmerberg (2001) How can proteolipids be central players

in membrane fusion? TCB 11 : 233 (tcb11-06-11.pdf)

Proteína G
Membrana
Nucleocápside
Genoma
fusión

Ciclo vital de un virus recubierto (VSV) en una célula eucariota

De Alberts, Molecular Biology of the Cell, 3rd. edit.

22
 Tinción negativa de Hemaglutinina de Influenza-v
virus influenza

En el Golgi furina corta

formando dos subunidades
HA1 y HA2 (péptido de
fusión, N-ter)
fusión

Lodish (2000) Molecular Cell Biology

f. 6-13 y f. 17-27, p.
fusión

Cambios conformacionales inducidos por un cambio de pH de 7.0

a 5.5 en la hemaglutinina de influenza-v
Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-60, p. 744

23
fusión

Para la fusión de membranas inducida por HA-influenza es necesaria

la participación de entre 9 y 12 moléculas.
Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-61, p. 745

Entrada del virus HIV a CD4+

fusión

HIV entry
Inhibidores unión
Inhibidores co-receptor
Inhibidores de fusion

24
 …¿y como se explica la fusión vesícula - membrana?
fusión

Mayer (1999) Intracellular membrane fusion,

SNARES only? COCB 11 : 447-452
(tcb11-4-06.pdf)

Dos modelos alternativos para las fases finales de la fusión de vesículas

A) SNARE driven fusion / B) SNARE function as an intermediate stage

fusión

Calmodulin
Protein phosp1

Mayer (1999) Intracellular membrane fusion, SNARES only? COCB 11 : 447-452 (tcb11-4-06.pdf)

25
 Modelos de acción de NSF - SNAP en la interacción SNARE
direccionamiento / reconocimiento

Hay y Scheller (1997) SNARE and NSF in targeted membrane fusion COCB 9 : 505-512
direccionamiento / reconocimiento

26
direccionamiento / reconocimiento
reciclaje

…¿y el reciclaje de todos los componentes a las mebranas de destino?

… esta será otra historia

27