TRABAJO PRÁCTICO Nº 1

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA

Objetivos: Cuantificación de coliformes totales y coliformes fecales en agua por medio

de la técnica del número más probable (NMP).

Introducción
Las bacterias patógenas más frecuentemente encontradas en el agua y que más a menudo
producen infecciones en el hombre, tienen casi siempre el mismo origen, proceden casi
todas del tubo digestivo del hombre o de los animales. En consecuencia, siempre van
acompañadas de otras bacterias del mismo origen más abundantes y más frecuentes,
llamadas bacterias indicadoras de contaminación fecal. Se distinguen dos tipos de
indicadores:
▪ los indicadores de contaminación, cuya presencia se traduce en la existencia
eventual de bacterias patógenas
▪ los indicadores de tratamiento que permiten evaluar la eficacia de un determinado
tratamiento, frente a un microorganismo dado o frente a un grupo de
microorganismos.

El grupo más importante de indicadores es el de los coliformes, los que son definidos como
bacilos Gram negativos, no esporulados, oxidasa negativa, aerobios o anaerobios
facultativos, capaces de multiplicarse en presencia de sales biliares y capaces de fermentar
la lactosa con producción de ácido y de gas en 48 h a una temperatura de 35°C – 37°C.
Dentro de este grupo se encuentran los llamados coliformes fecales que se caracterizan por
la capacidad de fermentar lactosa con producción de ácido y gas a 44,5°C ± 0,2ºC en 24 h.

Las normas chilenas que especifican los métodos para determinar bacterias indicadoras en
agua clorada (potable) y no clorada (residuales), están basadas en el Standard Methods for
the Examination of Water and Wastewater (St.M), de la American Public Health Association
(APHA).

En Chile, la Superintendencia de Servicios Sanitarios (SISS) establece como requisitos para

agua potable, la determinación de bacterias coliformes totales en base a las normas
chilenas dependiendo del tipo de muestra, por los métodos de tubos múltiples (NMP)
(NCh1620/1. Parte 1) y por el método de filtración por membranas (NCh1620/2 Parte2).
Junto a esto, se debe efectuar la determinación de E. coli mediante EC-MUG de acuerdo al
St.M y que se detalla en el Manual de Métodos de Ensayo para Agua Potable de la SISS (ME-
01-2007 y ME-02-2007).

Las metodologías del NMP consideran series de 5 tubos por dilución para efectuar
primeramente una prueba presuntiva (caldo lactosado o lauril sulfato triptosa) y
posteriormente se confirman los tubos que hayan dado una reacción positiva, en un medio
selectivo (caldo lactosa bilis verde brillante para coliformes totales y caldo EC para
coliformes fecales).

El cálculo del número más probable se efectúa utilizando una tabla diseñada
específicamente para aguas (anexo).

Muestras: agua potable, agua de mesa embotellada, agua mineral embotellada

Toma de muestra
Utilizar frascos estériles de capacidad adecuada para la cantidad de agua. Si se supone la
presencia de cloro o cloraminas en el agua, agregar 100 mg de tiosulfato de sodio por litro
de muestra en los frascos antes de su esterilización. Si pudiera haber metales pesados,
proceder de igual forma agregando 572mg de EDTA por litro de muestra.

Metodología de análisis
1- Determinación de coliformes totales por la técnica de fermentación en tubos múltiples
(NMP)
1.a- Ensayo presuntivo:
Inocular tubos de fermentación (con campana Durham) para NMP con Caldo Lauril Sulfato.
Se inoculan series de 3 tubos de por lo menos 3 diluciones decimales sucesivas
(generalmente 10, 1 y 0,1mL). Si el inóculo es igual o mayor a 10 mL se utiliza el medio de
concentración adecuada (doble concentración) para no diluir los nutrientes.
Inocular la muestra de agua en los tubos de la siguiente forma:
▪ 3 tubos de LST doble concentración: con 10 mL de la muestra en cada tubo
▪ 3 tubos de LST: con 1 mL de la muestra en cada tubo
▪ 3 tubos de LST: con 1 mL de la dilución 10-1 en cada tubo
Recordar que antes de tomar la muestra, ésta y las diluciones deben agitarse para asegurar
la homogeneidad. Al terminar, agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el
medio de cultivo e incubar los tubos a 35ºC por 24 h a 48 h.

1.b- Ensayo de confirmación

Los tubos que producen gas y/o crecimiento abundante se transfieren con asa (esterilizar a
la llama y enfriar) a sendos tubos de fermentación de Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Se
incuban por 24 - 48hs a 35ºC.
Producción de gas (+) Producción de gas (-)

PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES

En base a los tubos positivos y negativos, y utilizando la tabla de NMP para aguas, informar
UFC de coliformes totales /mL.

2- Determinación de coliformes fecales por la técnica de fermentación en tubos múltiples

(NMP)
Cada tubo positivo en 1.a, ensayo presuntivo, se transfiere con asa a tubos de fermentación
de Caldo EC. Incubar en baño de agua con cubierta y agitación a 44,5ºC ± 0,2ºC por 24 hs.
La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes fecales.

Producción de gas (+) Producción de gas (-)

PRESENCIA DE COLIFORMES FECALES AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES

En base a los tubos positivos y negativos, y utilizando la tabla de NMP para aguas, informar
UFC de coliformes totales /mL.

Cálculo y expresión de resultados

La combinación de tubos positivos y/o negativos de las pruebas confirmativas es referida a
la tabla NMP para aguas y se expresa como:
▪ NMP de coliformes totales por 100 mL de muestra
▪ NMP de coliformes fecales por 100 mL de muestra

Cuando se realizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3

series, eligiendo la dilución más alta que da resultados positivos en los 3 tubos ensayados y
las dos diluciones siguientes.
▪ Si para el cálculo del NMP se consideran las 3 primeras series (10 mL, 1 mL y 0,1 mL),
el valor expresado en la tabla corresponde al NMP/100 mL.
▪ Si se utilizan otros volúmenes de muestra, por ejemplo: 1 mL, 0,1 mL y 0,01 mL, se
lee el resultado de la tabla y se multiplica por 10. Si se utilizan alícuotas más
pequeñas, multiplicar por 100 o 1000, según las alícuotas consideradas.