La tinción GRAM es uno de los procesos más utilizados a la hora de 

determinar al
microscopio óptico la filogenia de un microorganismo. Siendo una de las primeras
pruebas que se hacen para clasificar a un posible patógeno. Fue desarrollada en 1884 por el
bacteriólogo danés Christian Gram. El proceso tradicional fue mejorado por Hucker en 1921,
hallando la manera de que los reactivos fueran más estables y mejorando la calidad
diferenciadora del proceso. Existe otra modificación diseñada por Kopeloff en 1923 que
permitía teñir de forma más eficiente aquellas bacterias de difícil tinción, sobre todo las
anaerobias. No obstante la explicación de porqué se teñían de forma diferente tuvo que
esperar hasta 1974 cuando Gregersen estableció que las diferencias entre las GRAM+ y las
GRAM- eran debidas a la diferente composición de la pared celular.

Detalle de la pared de las bacterias GRAM+ y GRAM- donde se puede apreciar la diferencia entre los
péptidoglucanos.

Aunque las Archaea también responden a la tinción GRAM, son las especies del Reino
Bacteria las que se dividen tradicionalmente entre las GRAM+ (GRAM positivas) que son
aquellas bacterias que se tiñen con este procedimiento y las GRAM- (GRAM negativas) que
no retienen el tinte.
Pasos para teñir bacterias con la tinción de GRAM:
Fijación: Primero de todo hay que coger bacterias sanas de un cultivo y ponerlas en un
portaobjetos (el el laboratorio muchas veces se abrevia por “porta”) y secar la gota bien con
mechero, sin quemar ni hervir las células, o bien al aire.
Tinción 1: durante 1 minuto se cubre la superficie donde están las bacterias con unas pocas
gotas del colorante cristal violeta. Pasado este tiempo se elimina el exceso y se lava el
portaobjetos con agua corriente, con cuidado para que el chorro de agua no caiga
directamente sobre la muestra ni sea un flujo demasiado rápido como para eliminar las
bacterias del porta.

Tinción 2: Aquí es donde se introdujeron las mejoras de Hucker, agregando lugol durante 30
segundos y decolorando con alcohol: acetona (en proporciones 1:1) 3 segundos y se vuelve a
lavar como antes. La modificación de Kopeloff utiliza como decolorante alcohol-acetona (7:3)
segundos y los tiempos de tinción son diferentes.
Tinción 3: Se añade safranina durante 30 segundos y se vuelve a lavar. Que puede
sustituirse por carbol-fucsina, para bacterias anaerobias.
Se deja secar y ya puede verse al microscopio óptico las bacterias teñidas
Teoría de la tinción:
Las células bacterianas sanas y vivas se tiñen sin problemas con cristal violeta, un colorante
básico y se tiñen poco o nada con colorantes ácidos, como la eosina. El cristal violeta es
introducido activamente por las bacterias, por eso solo las vivas se teñirán, además las
características ácidas de las células procariotas son las que permiten esta coloración básica.
El lugol forma un compuesto insoluble con el cristal violeta. El lavado con alcohol: acetona, un
solvente lipídico, actúa en la pared celular y afecta a la membrana plasmática a la que se
unen los péptidoglucanos de la pared en las bacterias GRAM- de tal manera que dejan salir el
complejo lugol-cristal violeta.
Por otra parte las GRAM+ poseen una gruesa pared de péptidoglucanos con pocos lípidos por
lo que el alcohol: acetona no puede entrar y retienen el colorante. Si la decoloración no se
lleva a cabo correctamente las bacterias GRAM- pueden aparecer como positivas.
Para concluir se añade la safranina que es un tinte de contraste que tiñe en rojo, de esta
manera las células GRAM- quedan teñidas en rojo-rosa de forma diferenciadora de
las GRAM+ que se tiñen en violeta intenso o azul.

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