Preparación, Esterilización y Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton

Méndez, Helena – Palacios, Hasleidy

Universidad de Boyacá – Facultad Ciencias de la Salud – Bacteriología y Laboratorio
Clínico

RESUMEN

En condiciones de laboratorio se realizó la preparación de Agar Mueller Hinton como

medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparación dadas por
la casa comercial. Basados en esta información se realizaron los cálculos
adecuados para la preparación de 20ml de Agar Mueller Hinton, que serian
distribuidos en dos cajas de petri pequeñas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del
agar (en polvo) incluido el peso del papel, necesarios para la preparación del medio
de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de
precipitado que contenía 20 ml de agua destilada, y se calentó a 250ºC hasta que
hirviera; una vez obtenida la preparación, se llevo a esterilizar en autoclave durante
15 minutos a 121ºC. Luego se procedió a distribuir en las dos cajas de petri el
medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cámara de flujo
laminar, para evitar la contaminación de este. Finalmente se realizo la prueba de
esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una
temperatura de 37ºC. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido
para la incubación del medio de cultivo, arrojaron resultados negativos para el
crecimiento de colonias, indicando que el método de esterilización empleado es
efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de
diferentes microorganismos.

PALABRAS CLAVE: Agar Mueller Hinton, esterilización, medios de cultivo, prueba

de esterilidad.

INTRODUCCIÓN

Fue en 1876 cuando Koch fue capaz carne e infusiones, a fin de

de propagar una bacteria patógena
(Bacillus anthracis) en cultivo puro,
fuera del cuerpo que la portaba; en
1881, utilizando un medio liquido, lo
solidifico con gelatina y desarrollo los
métodos de rayado y siembra en placa
para aislamiento de bacterias. El
siguiente paso lo dio Hesse, en 1891,
al utilizar como agente solidificante un
producto denominado agar, extraído
de las algas rojas. El agar era muy
superior a la gelatina, ya que era
resistente a la digestión microbiana y a
la licuefacción. Se enriqueció la
composición de los cultivos
solidificados utilizando extractos de
equipararlos con el tejido infectado
portador (1).
Para el aislamiento, estudio y
clasificación de los microorganismos,
es necesario utilizar un medio de
cultivo en el que se dispongan de las
sustancias orgánicas e inorgánicas
necesarias e indispensables para el
normal desarrollo de su metabolismo.
En estos medios, los microorganismos
además de poder multiplicarse,
pueden manifestar características de
crecimiento y propiedades
bioquímicas, aspectos de gran
importancia para su clasificación. (2).
Estos preparado, poseen
características especificas por menor que en los medios de cultivo
ejemplo: contener sustancias nutritivas sólidos.
como proteínas, azucares, minerales y - líquidos: no contiene ningún agente
vitaminas; tener un pH adecuado; solidificante
estar protegidos de posibles
contaminaciones; y estar esterilizados. Según se Composición:
(2). - empíricos: en su composición
aparecen sustancias orgánicas.
Ventajas al Utilizar los Medios de - sintéticos: en su composición
Cultivo. aparecen sustancias químicas
permite el aislamiento de un definidas.
microorganismo a partir de un sustrato - semisintéticos: en su composición
natural (suelo, agua, plantas, aire, aparecen moléculas naturales
excrementos, pus, etc.). hidrolizadas.
permite la identificación del
microorganismo, según las Según el uso a que se destinen:
características de crecimiento, - medios enriquecidos: suelen ser
morfología celular, propiedades medios con un nutriente simple que
tintoriales y reacciones bioquímicas. presentan enriquecedores, tales como
Conservación durante meses y la sangre de carnero. Son medios
años de las cepas identificadas. destinados a desarrollar
Obtención de células de microorganismos muy exigentes.
microorganismos patógenos o de sus - Medios diferenciales: contienen
toxinas para la elaboración de colorantes, azucares e indicadores,
productos biológicos (vacunas, concebidos para provocar una
antitoxinas, etc.) (2). respuesta bioquímica conocida,
generalmente el color.
El tipo de medio que utiliza un - Medios selectivos: además de
microbiólogo depende del contar en su composición con los
microorganismo que esta cultivando y mismos productos que los medios
el porque de dicho cultivo. Los diferenciales, presentan una serie de
microorganismos presentan una agentes que sirven para inhibir la flora
enorme variedad de requerimientos acompañante de la muestra a
nutricionales. Se utiliza un medio estudiar, y aislar, de esta forma, el
mínimo para determinar los microorganismo que se busca.
requerimientos nutricionales de un - Medios de uso general: son medios
organismo y un medio rico si se desea que soportan el crecimiento de una
obtener masa celular de una forma amplia variedad de microorganismos
rápida (3). fastidiosos, sin exigencias nutritivas
especiales (1).
Clasificación de los Medios de
Cultivo Preparación del Agar Mueller Hinton

Según se Estado Físico:

- Sólidos: presentan en su 1. se disuelven 38g en un litro de agua
composición una agente solidificante, destilada, calentándolo y agitándolo
el agar, en una proporción de 12 a 15 al mismo tiempo, hasta su completa
gramos por litro. disolución. El matraz se cierra con
- semisólidos: presentan agar en su doble capa de papel aluminio.
composición pero en una proporción
2. se esteriliza en autoclave, a 121ºC RESULTADOS
durante 15 minutos.
3. se dosifica en placa de petri a un Cálculos Necesarios para Preparar la
volumen de 20ml (1). Cantidad de Medio de Cultivo
Deseado
Se deben preparar dos cajas de petri
pequeñas con agar Mueller Hinton.
MATERIALES Y MÉTODOS
20ml para cajas grandes
Para la preparación del medio de
cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton 15ml para cajas medianas
y se tomaron en cuenta las 10ml para cajas pequeñas
especificaciones de preparación
dadas por la casa comercial.
Inicialmente se realizo el cálculo de la
cantidad de agar necesario para la
preparación del medio de cultivo, o
sea se tomo 1.86gr de agar (incluido
el peso del papel: 1.1gr), el cual se
adicionó en una vaso de precipitado
que contenía 20ml de agua destilada
que se uso como diluyente del agar.
Seguidamente se calentó a 250ºC
hasta que iniciara a hervir.

Después de obtenida la solución de

agar, se realizo proceso de
esterilización con autoclave durante
15 minutos a una temperatura de
121ºC. Finalizado este proceso se
procedió a dispensar el medio,
realizando inicialmente limpieza con
alcohol alrededor del vaso de
precipitado para evitar contaminación
del medio de cultivo, luego se adiciono
en dos cajas de petri pequeñas
aproximadamente 10ml de la
preparación, esto en condiciones
estériles en cámara de flujo laminar, a
la cual se le realizo limpieza previa
con alcohol al 70% y se puso a
funcionar el aire estéril de la cámara
durante 30 minutos.

Una vez dispensado el medio de Después de realizado el proceso de

cultivo en las cajas de petri, estas se
sellaron con cinta de enmascarar y se
colocaron a incubar a 37ºC durante 24
horas para verificación de prueba de
esterilidad.
esterilización en el autoclave se
observo en el vaso de precipitado la
formación del agar con textura
semilíquida y de color amarillo muy
claro, como se observa en la figura #1.

Figura #1 agar Mueller Hinton después
de proceso de esterilización.
Los resultados obtenidos en las cajas
de petri luego de la prueba de
esterilidad, permitieron observar que el
medio de cultivo con agar Mueller
Hinton continuaba de color amarillo
claro, sin observarse crecimiento
sobre la superficie de ninguna
población bacteriana, indicando ser un
medio de cultivo viable para su uso.
Figura #2.
Figura #2 agar Mueller Hinton después
de prueba de esterilidad.
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE
RESULTADOS
Como se menciono anteriormente, se
utilizo agar Mueller Hinton de la casa
comercial OXOID, (código CM 337)
para la preparación del medio de
cultivo.
El agar Mueller Hinton se utiliza en la
comprobación de la susceptibilidad de
microorganismos a antibióticos.
Es un medio simple, transparente y sin
materiales termolabiles (1) como se
observa en la figura #1.
Dentro de su composición en un litro
encontramos:
- Infusión de carne ……………. …...2g
- Ácidos de casamino……….......17.5g
- Almidón……………………......... 1.5g
- Agar ……………………………... 17g
Estando con pH de 7.3 y una Tº
entre 0.1 a 25ºC.
El almidón contribuye al fomento en el
crecimiento, así como la infusión de
carne y los ácidos de casamino, que
sirven de nutrientes al medio
(seleccionados estos para dar la
mayor transparencia posible al
medio). La técnica de trabajo con este
medio consiste en depositar, en la
superficie, discos de papel
impregnados de antibiótico a probar,
una vez sembrada la placa, para
poder ver el halo que se forma
alrededor del disco, y constatar así la
inhibición de los distintos discos en
sus distintas concentraciones de
antibiótico (1)
El agar es un elemento solidificante
muy empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licua
completamente a la temperatura del
agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados, lo cual se
observo durante la preparación del
medio de cultivo (2).
La cantidad de agar encontrada en la
composición química (17g), indica que
corresponde a un medio de cultivo
solidó, y debido a componentes como
la infusión de carne y los ácidos de
casamino, se observa de color amarillo
claro. Figura #2.
Referente a la esterilización del medio
de cultivo, debe ponerse mucha
atención en el tiempo de esterilización,
porque si el proceso no dura el tiempo
preciso, el medio puede presentar
problemas de esterilidad, y si
excediera el tiempo preciso, el medio
se sobrecalentaría y afectaría a las
cualidades del medio y su pH (1).
Las técnicas de esterilización han de
destruir todos los tipos de vida
microbiana (4). El vapor a presión
(autoclave) es el método más eficaz y
practico para esterilizar con calor. La
exposición al vapor en un autoclave, a
15 libras de presión (121ºC) y durante
20 minutos, matara todas las formas
de vida. El vapor a presión penetra
mucho y es particularmente eficaz ya
que se condensa sobre un objeto frió
para liberar 596 cal por g (calor de
condensación). La condensación
permite que mas vapor entre en
contacto con los objetos que se están
esterilizando (4).
Antes de proceder a realizar un cultivo
se microorganismos se debe
considerar como evitar los
contaminantes. Los microorganismos
se encuentran en todas partes y,
debido a su pequeño tamaño, se
dispersan fácilmente por el aire y las
superficies. Por consiguiente se debe
esterilizar el medio de cultivo
inmediatamente después de su
preparación para eliminar los
microorganismos que lo contaminan,
esto se hace normalmente por calor.
Pero es también importante tomar las
debidas precauciones durante el
manejo posterior de un medio de
cultivo estéril para lograr excluir de el
todos los microorganismos (5).
CONCLUSIONES
 Se aprendió y manejo la técnica
empleada para la preparación de
medios de cultivo.
 Se aplico la técnica de esterilización
de vapor a presión (autoclave), para
medios de cultivo en agar y caldo
nutritivo.
 Se conoció el método de prueba de
esterilidad para verificar viabilidad de
los medios de cultivo.
BIBLIOGRAFÍA
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laboratorio clínico básico
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3. Ingraham, J. Ingraham, C.
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revisada. Madrid. Prentice Hall
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