UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

ESCUELA DE QUÍMICA
QUÍMICA BIOLÓGICA
FISICO QUÍMICA

OTTO ROBERTO CASTILLO LINARES – QB- 201512418

Revisión de artículo: Investigando el impacto del diseño del

sistema de administración sobre la eficacia de las vacunas de
ARN autoamplificadoras

El objetivo principal de éste artículo es investigar el impacto de los diseños de los

sistemas de administración sobre la eficacia de las vacunas ARN
autoamplificadoras. Identificando las funciones y diferencias entre las vacunas de
ARNm y ADNp.
Metodología
En la metodología del presente artículo se realizaron varios pasos para lograr el
objetivo de éste:
 Se sintetizó el ARNm autoamplificador que se abrevia como SAM por sus
siglas en inglés. Se sintetizaron los plásmidos utilizando técnicas de
trabajos previos. Utilizando un ARN autoamplificado que codifica al virus de
la rabia se utilizó en el estudio.
 Para la preparación de formulaciones SAM se realizó formulando
nanopartículas de liposomas, lípidos sólidos y nanopartículas, emulsiones y
formulaciones cargadas con SAM.
 Se cuantificó la carga de SAM y la eficiencia de adsorción utilizando un
ensayo de Kit de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante y mediante
la fluorescencia se determinó la concentración de SAM no cargada y la
carga real se obtuvo restando la SAM no cargada a la concentración inicial
de ARN.
 Para la caracterización fisicoquímica de las formulaciones se utilizaron
términos de tamaño hidrodinámico.
 En el ensayo de protección de la ARNasa se evalué la capacidad de las
formulaciones para proteger al ARN autoamplificado del virus de la Rabia
(SAM-RVG) se realizó por medio de la degradación de una RNasa y se
expuso durante 30 minutos a temperatura ambiente, Luego la ARNasa se
inactivó mediante una proteinasa K. Para extraer el SAM de las
 formulaciones lipídicas se agregó etanol a cada muestra y se centrifugaron
durante 25 minutos. Se analizaron mediante electroforesis en gel.
 Se realizó un ensayo para evaluar la toxicidad celular en células renales de
bebés hámster; cultivando las células de riñón (BHK) durante 2 a 3 días a
37 °C y 5% CO 2. Después de 16 horas las células se tripsinizaron, se
transfirieron a placas y se tiñeron. Luego de dos lavados las células
resuspendieron y el porcentaje de células vivas y muertas con respecto al
control de células sin tratar se midieron mediante citometría de flujos.
 Para medir la eficiencia de asociación celular de células BHK se sembraron
células y se incubaron durante 6 horas para permitir la adhesión celular.
Para rastrear la absorción celular, las partículas SAM-RVG se formularon
con un colorante añadido a la mezcla de lípidos antes de la emulsificación
de los microfluidos. Se añadió lípidos catónicos y se infubaron durante 16
horas a 37 °C y 5% CO 2. Las células se recolectaron de las placas, se
lavaron y se resuspendieron. y el porcentaje de células con respecto al
control sin tratar se midió mediante citometría de flujo.
 Para medir la potencia in vitro de las formulaciones SAM-RVG se
sembraron en placas como se describió previamente. Después de 6 a 8
horas, las células se incubaron durante 16 horas con liposomas las células
fueron tripsinizadas y transferidas a placas, lavado dos veces, fijado y
permeabilizado. Luego, después del lavado, las células se incubaron con
anticuerpo secundario. Finalmente, las células se lavaron y resuspendieron
en PBS para citometría de flujo. Y se calculó el porcentaje de formulaciones
RVG con respecto al control de células sin tratar.
 En la evaluación de las respuestas inmunitarias in vivo de diferentes
adyuvantes seleccionados y su antígeno asociado se determinaron de
títulos de anticuerpos séricos específicos de antígeno mediante el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y la tinción de citocinas
intracelulares (ICS) en esplenocitos.
 Para los análisis estadísticos los resultados se calcularon como media y
desviación estándar. También se utilizó ANOVA o un análisis de varianza y
para la comparación se reconoció la significancia para valores de p. El
análisis y la interpretación se realizaron utilizando un software estadístico.
Evaluando los resultados con respecto al objetivo principal del presente artículo se
puede apreciar que en la evaluación de los atributos físicos de los liposomas,
partículas lipídicas sólidas, partículas poliméricas y emulsione producido con SAM-
RVG que se basaron en estudios ya planteados anteriormente. Y lograron una
carga alta que fue mayor al 95% usando cualquiera de los lípidos catiónicos y así
lograr una mejor eficacia en las vacunas ARNm.
Resultados
Tabla 1. Propiedades físico-químicas de los sistemas de liberación catiónicos
basados en lípidos.
DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano), NP de DDA
(dimetildioctadecilamonio) (polimérico nanopartículas), SLN (nanopartículas de
lípidos sólidos), tamaño (diámetro medio Z), ZP (potencial zeta), PDI (índice de
polidispersidad), EE (eficiencia de encapsulación), AE (eficiencia de adsorción).

Para la evaluación de los atributos físicos de los liposomas, Se prepararon SAM

adsorbentes que codifican la glicoproteína G (RVG) de la rabia. Se midió la
potencial zeta para evaluar el impacto de carga SAM en estos sistemas. Los
liposomas, SLN, NP y emulsiones exhibieron diferentes composiciones, pero todas
contenían la misma concentración de lípidos catiónicos ya sea DOTAP o DDA.
Sus características físico-químicas se muestra en la Tabla 1. Cuando se mezcló
SAM con estos liposomas preformados, los tamaños de partícula aumentaron
significativamente (p <0.05) (100-145 nm para formulaciones DOTAP y 170-200
nm DDA) y el potencial zeta reducido debido a la alta adsorción (95% -99%) como
puede apreciarse en la Tabla 1.
Cuando el SAM-RVG quedó atrapado dentro de los liposomas, el impacto del
tamaño de partícula fue menos notable para los liposomas DOTAP (80-90 nm),
que eran de naturaleza catiónica. El atrapamiento de SAM-RVG dentro de los
liposomas de DDA produjeron partículas de tamaño similar a aquellas en las que
se adsorbió SAM-RVG. En general, se logró una carga alta mayor al 95%,
independientemente del lípido catiónico empleado y el método de fabricación.
En los SLN, cuando se formularon en ausencia de SAM-RVG, las partículas tenían
entre 65 y 75 nm, con un PDI bajo menor a 0,3, y de naturaleza catiónica,
independientemente del lípido catiónico utilizado. Cuando estos SLN catiónicos se
mezclaron con SAM-RVG, se produjo un aumento significativo en el tamaño de
partícula nuevamente visto en combinación con una reducción en el potencial zeta
y una alta carga SAM-RVG mayor al 95%. En cuanto a los liposomas, los SLN
basados en DDA eran más grandes que sus contrapartes DOTAP.
Nanopartículas poliméricas formulados con DOTAP o DDA tenían un tamaño de
40 a 60 nm, con un PDI bajo y un potencial zeta alto. Cuando estas nanopartículas
se mezclaron con SAM-RVG, las nanopartículas basadas en DOTAP precipitaron
y las nanopartículas basadas en DDA aumentaron significativamente su diámetro,
hasta 260–270 nm. Por el contrario, cuando las nanopartículas poliméricas se
formularon para atrapar SAM-RVG, solo los que contienen DOTAP podrían
prepararse con tamaños de partículas de aproximadamente 200 nm, potencial
zeta catiónico entre 20-30 mV y alta incorporación mayor al 95% de SAM-RVG.
Finalmente, antes de la adición de SAM-RVG a las emulsiones, los tamaños de los
glóbulos fueron de 140 a 160 nm para las emulsiones basadas en DOTAP y 170 a
210 nm para emulsiones basadas en DDA, se observó una alta adsorción mayor al
95% combinada con un aumento en el glóbulo tamaño y una caída en el potencial
zeta.
En general, antes de la adición de SAM-RVG, la elección del lípido catiónico
utilizado ya sea DOTAP o DDA no tuvo un impacto notable en el tamaño de las
partículas y todos los sistemas fueron altamente catiónicos.
Figura 1. Viabilidad celular y asociación celular de plataformas de parto con
células de riñón de hámster bebé (BHK).
En la asociación celular de liposomas, SLN, NP y emulsiones cargados con SAM-
RVG en la línea celular BHK la citotoxicidad de todas las formulaciones en células
BHK se cuantificó después de 16 horas. En la figura 1A, B se puede observar
que Las formulaciones DOTAP fueron menos tóxicas en comparación con las
formulaciones DDA, y las células permanecieron viables en concentraciones de
hasta 33 µg/mL para los sistemas de administración basados en DOTAP en
comparación con 11 µg/mL para sistemas de entrega basados en DDA.
Según estos resultados, las concentraciones del sistema de administración de 11
µg/ml o menos fueron utilizados dentro de los estudios celulares. Para investigar el
impacto de la elección de lípidos catiónicos en la asociación celular, se prepararon
formulaciones basadas en DOTAP (Figura 1C) y DDA (Figura 1D) marcadas con
fluorescencia. Todos los sistemas de administración se incubaron durante 16
horas

Figura 2. Asociación celular de formulaciones en la línea celular BHK expresada

como intensidad media de fluorescencia (IMF). Intensidad de fluorescencia media
de las células BHK después de 16 h de incubación con DOTAP (A, C) y
Liposomas, SLN, NP y emulsiones basados en DDA (B, D).
En la Figura 2 pueden observarse las diferencias en la eficiencia de asociación
entre las formulaciones fueron evidentes cuando analizando los valores medios de
intensidad de fluorescencia. En La Figura 2A muestra que la intensidad media de
fluorescencia de DOTAP SLN y NP fue significativamente mayor en comparación
con las formulaciones basadas en liposomas y emulsión: SLN y NP MFI, mientras
que los sistemas de emulsión y liposomas basados en DOTAP tenían una
intensidad media de fluorescencia menor. En la Figura 2B solo los NP mostraron
niveles significativamente más altos en comparación con los otros. En la Figura
2C, D, los valores absolutos fueron más bajos en comparación con los medidos en
medio completo, una tendencia similar se observó en los sistemas de
administración y se compararon los dos lípidos catiónicos diferentes.

Figura 3. Potencia in vitro (IVP) en la línea celular BHK. IVP en BHK en FCS al
5% (A, B) o sin FCS (C, D) medio de formulaciones basadas en DOTAP (A, C) y
basadas en DDA (B, D).

La Figura 3 representa el porcentaje de células positivas para RVG después de

16 horas de incubación de SAM-RVG cargado con partículas de DOTAP (Figura
3A, C) o DDA (Figura 3B, D) a diferentes concentraciones de antígeno en total
medio. En general, la eficiencia de transfección fue independiente de la dosis de
SAM: dentro de la concentración rango probado, el aumento del contenido de
SAM-RVG no dio como resultado una mayor expresión de antígeno. En la Figura
3A Los valores de las células RVG + no fueron significativamente diferentes entre
los liposomas, los SLN y los NP en concentraciones. En la Figura 3B se observó
un patrón similar con las formulaciones basadas en DDA. Debido a un posible
efecto inhibidor de las proteínas séricas sobre la entrega de genes, también se
realizó la prueba de potencia in vitro (PIV) realizado en ausencia de suero en
cultivo, como puede observarse en la Figura 3C, D.
Tabla 2. Representación esquemática de los criterios aplicados a los liposomas
basados en DOTAP o DDA, lípidos sólidos nanopartículas y emulsiones para
seleccionar formulaciones para avanzar a estudios in vivo.

La inmunogenicidad de las vacunas SAM-RVG se realizó en ratones. Se

seleccionaron candidatos basado en una estrategia de selección descendente con
aquellos que muestran atributos físicos apropiados, y luego en base a la potencia
in vitro (IVP), tres sistemas de administración progresaron a la in vivo estudio:
liposomas DOTAP, liposomas DDA y NP DOTAP, como se resume en la Tabla 2.
Figura 4. Inmunogenicidad de la vacuna SAM-RVG administrada por diferentes
portadores catiónicos.
Se realizó en grupos de 10 ratones y se inmunizaron en los días 0 y 28 con 1,5 o
0,15 µg de ARN autoamplificado que codifica la proteína G del virus de la rabia
formulada en nanopartículas poliméricas (NP) DOTAP, DOTAP, Liposomas o
Liposomas DDA. Los títulos de IgG específicos se midieron mediante ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para cada grupo, hubo 5 muestras,
cada una representando los datos de grupos de dos ratones (representados como
círculos) y los títulos de media geométrica (GMT) son líneas continuas.
Los sueros se recolectaron y analizaron (A) 4 semanas después de la primera
inmunización y (B) 2 semanas después de la segunda inmunización. Los títulos
menor a 0,125 EU / mL (línea azul punteada) estaban por debajo del límite de
detección, mientras que los títulos mayor a 0,5 UE / ml (línea roja punteada) eran
una indicación de protección. La comparación intergrupal fueron analizados
mediante la prueba de análisis de varianza unidireccional. (Figura 4)

Figura 5. Porcentajes de células T CD4 + o CD8 + específicas de antígeno.

Células T esplénicas (A) CD4 + y (B) CD8 +.
Después de dos inmunizaciones, todos los animales tenían células T CD4 + y CD8
+ específicas de RVG (Figura 5). Aunque no es estadísticamente significativo, los
NP a 1,5 µg de SAM indujeron la mayor frecuencia de células T CD4 + específicas
de RVG, en comparación con todas las demás formulaciones.

Figura 6. Porcentajes de linfocitos T citotóxicos CD4 + o CD8 +.

El fenotipo efector de las células T CD4 + y CD8 + se evaluó adicionalmente
mediante la cuantificación de la expresión superficial de CD107a, un marcador de
desgranulación cuya expresión se correlaciona con la citotoxicidad in vivo de las
células T (Ver Figura 6).
Teoría que se utilizó para explicar el artículo
Las vacunas basadas en ARN mensajero (ARNm) han surgido como un enfoque
transformador, debido a su capacidad para provocar inmunidad humoral y celular.
Recientemente, ha aumentado el interés en la aplicación de esta tecnología por
numerosas empresas. En contraste con el ADN plásmido (pDNA) vacunas, el
ARNm no necesita ser transportado a través de la membrana nuclear y puede
inducir directamente expresión del antígeno en el citosol, de modo que se evita
cualquier integración genómica potencial. Además, las vacunas de ARNm inducen
la expresión transitoria de antígenos, mientras que las vacunas de ADN
proporcionan una expresión, imitando así una infección viral aguda.
Una estrategia para aumentar el rendimiento del ARNm es incluyen elementos
genéticos que permiten la autoamplificación.
Las vacunas SAM se autoamplifiquen con el tiempo y, en consecuencia, induzcan
más potentes respuestas inmunes en comparación con las vacunas
convencionales de ARNm no amplificador.

Anexos
  Antígeno: Un antígeno es una sustancia que desencadena la formación de
anticuerpos y puede causar una respuesta inmunitaria. [ CITATION Bec12 \l
4106 ]
 ADN Plasmídico: Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular
que a menudo se encuentran en bacterias y otras células. Los plásmidos
son separados del cromosoma bacteriano y se replican
independientemente de ella. [ CITATION Sal13 \l 4106 ]

 Polineuropatía hereditaria: son un grupo de trastornos heredados que

afectan el sistema nervioso periférico.Las neuropatías hereditarias se
dividen en cuatro subcategorías principales:neuropatía hereditaria motriz y
sensitiva, neuropatía hereditaria sensitiva, neuropatía hereditaria motriz, y
neuropatía hereditaria sensitiva y autonómica. [ CITATION Meg14 \l 4106 ]

 Liposomas: es una nanovesícula esférica formada, principalmente, por

fosfolípidos, los cuales adoptan una estructura de bicapa lipídica cuando
están en dispersiones acuosas. [ CITATION Tim13 \l 4106 ]

 Emulsiones: una mezcla de dos líquidos inmiscibles de manera

homogénea. [ CITATION Tim13 \l 4106 ]

Bibliografía
Becker, W., Kleinsmith, L., & Hardin, J. (2,012). Biología Celular y Molecular. México: Pearson
Educación.

Megías, M., Molist, P., & Pombal, M. (2,014). Atlas de Histología Animal y Vegetal: La célula.
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https://ccqqfar.virtual.usac.edu.gt/pluginfile.php/10327/mod_resource/content/1/atlas-
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Salazar, A., Sandoval, A., & Armendáriz, J. (2013). Biología Molecular. Mc Graw Hill. doi:ISBN: 978-
607-15-0912-3

Timberlake, K. (2013). Química General y Orgánica. México: Pearson.

Conclusión personal
El artículo presenta una idea demasiado innovadora para lograr engañar al
sistema inmune para hacerle desarrollar una inmunidad activa adquirida para un
virus sin que haya tenido contacto con él mediante una vacuna. Ya que estas
vacunas se basan en genes y no en proteínas como en las vacunas para la gripe;
las que se basan en genes transportan instrucciones y le enseñan a las células
inmunológicas a crear un antígeno adecuado para inducir la respuesta inmune.