UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

POSTGRADO EN MEDICINA VETERINARIA

CARACTERIZACIN DE LA RESPUESTA INMUNE SECUNDARIA

INDUCIDA POR REESTIMULACIONES ANTIGENICAS, EN BOVINOS
INFECTADOS CRONICAMENTE CON Anaplasma marginale

AURA T. CAMMILLI B.

Trabajo de grado presentado ante la Ilustre

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
como requisito parcial para optar al ttulo de
MAGISTER SCIENTIARUM en MEDICINA VETERINARIA,
mencin MICROBIOLOGIA

Tutor: Pedro M. Aso. U.S.B.

MARACAY, MAYO DEL 2001

 Fecha 4 de Mayo de 2001

EVALUACION DEL TRABAJO DE GRADO

Quienes suscriben, tutor y miembros del jurado examinador, hacen constar que el
trabajo de grado titulado CARACTERIZACION DE LA RESPUESTA INMUNE
SECUNDARIA INDUCIDA POR REESTIMULACIONES ANTIGENICAS EN
BOVINOS INFECTADOS CRONICAMENTE CON Anaplasma marginale, una vez
ledo, revisado y presentado, cuenta con el veredicto de APROBADO, en todas sus
partes, de los que aqu abajo firmamos

TUTOR: Prof Pedro Mara Aso

JURADO Prof. JURADO Prof.

SUPLENTE Prof. SUPLENTE Prof.

- ii -
 DEDICATORIA

A mi hija adorada, Amelia Sofa

A mi esposo querido Rafael, apoyo eterno
A mis padres, Clara y Francisco, amores incondicionales

- iii -
 AGRADECIMIENTOS

A mi tan amada Amelia Sofa por todo el tiempo en el que le rob mi presencia. Slo
Dios sabe cunto la extraaba en esos momentos. Gracias por comprender an a tu corta
edad. Que Dios te bendiga.
A mi esposo por su comprensin, devocin, apoyo e inclusive silencio. Que Dios te
bendiga.
A mis padres, por su amor incondicional, su dedicacin, apoyo y comprensin. A mi
madre por sustituirme muchas veces, de la mejor forma posible, en la educacin de mi
hija. A mi padre por sus lgrimas que tantas veces me hicieron reverdecer en los
momentos de sequa. Que Dios los bendiga.
A mis dos buenas hadas madrinas, Silvana y Marisela Rosa, por su comprensin,
sus acertados consejos y por el apoyo moral en todos los momentos amargos, que fueron
muchos. Gracias amigas.
Al Dr. Aldo Rosa, que aunque no est con nosotros, una vez ms comprend que su
manto de sabidura me cobijaba en los momentos difciles. Gracias to lindo, porque as
te considero.
A mi amigo incondicional, Carlos Ochoa, por pasarme la linterna cuando las luces
del tnel se haban apagado. Gracias amigo.
A mi tutor y amigo, Henry Caballero, por esa enorme experiencia acadmica,
personal y de vida que me entreg, y que al igual que sus guisos y regalos, me llenaron
la busaca para continuar de la mejor forma posible, mi camino.
Al Dr. Pedro Aso por sus generosos, sabios y justos consejos, los cuales me ayudaron
a llegar al final del tnel.
Al Dr. Armando Reyna-Bello por abrirme generosamente las puertas de su espacio de
trabajo y hacerme la estada amena y grata. Por su 19 purificada y sus ELISAS
indirectos.
- iv -
 A mi amigo el Dr. Oswaldo Scremin por su generosa colaboracin y apoyo
incondicional en el prstamo y manejo de los animales. Por abrirme las puertas de la
Finca Sta. Mara y ponerme a la orden todo lo necesario. Te lo agradecer siempre,
amigo.
A mi amiga Aldays Pantoja, por aparecer en momentos crticos, y haberme ayudado y
acompaado a solucionarlos.
A los colaboradores de la Finca Sta. Mara Jos Siano, Omar Salazar, Toms Meza,
Anibal Sumoza y Carmen Medina, por la ayuda prestada en el manejo y mantenimiento
de los animales.
A la Lic. Ild Gonzlez de Basso, por realizar el contaje de poblaciones leucocitarias
a cambio de nada. Gracias por tu generosidad.
A la Dra. Lorea Baroja por haberme cado del cielo en uno de los momentos ms
difciles y desesperantes de mi tesis. Gracias por tu generosa e incondicional ayuda.
Al Dr. Juan De Sanctis y a la Lic. Patricia Rodrguez, por los servicios prestados con
el citmetro de flujo, en el Instituto de Inmunologa de la UCV.
Al personal del bioterio de la USB, el Sr. Luis Hidalgo, el Sr. Anibal Zambrano, el Sr.
Flix Parejo, la Sra. Rosario Franklin, por su colaboracin y ayuda en el manejo de los
animales.
Al Dr. Emir Espinoza, a la Dra. Marcela Valencia, a la Lic. Trina Perrone, a la
Lic. Irina Fernndez, a la MV. Zulma Alvarez, a la Lic. Adriana Rodrguez, al
Lic. Lennys Gonzlez y a la Lic. Lilia Turcio, por participar en la esplenectoma del
becerro 822.
A los profesores Olga Tkachuk y Francisco Garca por pertenecer a mi Comit
Asesor, y ayudarme a proseguir mi camino.
A la profesora Elizabeth Marcano por sus atenciones y consejos objetivos y cordiales,
a toda hora.
A los profesores y tcnicos de la ctedra de Microbiologa e Inmunologa de la FCV,
por haber coincidido en mi vida en momentos particularmente difciles para mi y haber,
de alguna forma, aliviado las cargas. Gracias a Aurico Sousa, Luis Gonzlez, Mara
Luisa Garca, Freddy Cordero, Zoraida Navas, Edgar Mejas.
-v-
 A la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Central de Venezuela, por
haberme recibido y permitido continuar mis estudios superiores.
Al Dpto. de Biologa Celular, especialmente al Grupo de Bioqumica e Inmunologa
de Hemoparsitos, de la Universidad Simn Bolivar, por abrirme cordialmente las
puertas de sus instancias, y permitirme realizar mi tesis de maestra.
Al Lab. de Inmunobiologa de la Universidad Simn Rodrguez, por haberme
permitido realizar la fase final de la tesis, en condiciones tan gratas y amenas.
Al Instituto de Inmunologa de la Facultad de Medicina de la Universidad Central de
Venezuela, por haberme permitido determinar las variaciones de las subpoblaciones
leucocitarias, en el proyecto.
A todos aqullos que de alguna forma colaboraron conmigo y me facilitaron con su
generosidad, la prosecusin de mis estudios.
Muchas gracias, a cada uno de Uds.

- vi -
 FINANCIAMIENTO

Esta tesis fue financiada por el Decanato de Investigaciones de la Universidad Simn

Bolivar, a travs del proyecto N S1-CB 126; as como tambin por, Fundacite Aragua-
CONICIT, a travs del expediente N 2000 FRH-02-0502-4, correspondiente al rea de
Tecnologa y Ciencias Agropecuarias y Veterinarias.

- vii -
 RESMEN

La anaplasmosis es una enfermedad hemoparastica causada por la rickettsia de vida

intraeritroctica Anaplasma marginale; que afecta a los bovinos, causando cuantiosas
prdidas econmicas. Los bovinos infectados desarrollan respuesta inmune celular y
humoral que le permite controlar la infeccin primaria, y le confiere proteccin contra
retos homlogos. Sin embargo, el mecanismo de proteccin inmune no es an del todo
conocido. Las estrategias para analizar la respuesta inmune contra la rickettsia se han
centrado en: 1. Estudiar la cintica de produccin de anticuerpos y citocinas;
2. Evaluacin de la funcin de las clulas inmunes en el control de la infeccin mediante
la ablasin del bazo la aplicacin de drogas supresoras; 3. La produccin de
anticuerpos neutralizantes y opsonisantes; y, 4. La identificacin de eptopes protectores.
En el presente trabajo nos hemos propuesto abordar el problema desde una perspectiva
distinta: caracterizar los linfocitos T de memoria y determinamos la cintica de la
respuesta de los isotipos de anticuerpos producidos por la inmunizacin con cuerpos
iniciales (IB), antgeno soluble (Ag.Sol.) y la protena mayor de superficie 5
recombinante (MSP-5) en toretes infectados crnicamente con A. marginale. Para sto
se seleccionaron 4 toretes denominados 805, 808, 812 y 815, de aproximadamente 1 ao
de edad, a los cuales se le aplicaron cuatro dosis a intervalos de 15 das de IB
(torete 805), Ag.Sol. (torete 808), MSP-5 (torete 812), y adyuvante incompleto de
Freund (torete 815) (control), respectivamente. Tambin se utilizaron sueros seriados de
3 becerros infectados experimentalmente con Anaplasma marginale. La respuesta de
inmunidad celular contra las diferentes preparaciones antignicas, fue evaluada
semanalmente mediante un ensayo de proliferacin celular in vitro. La produccin de los
diferentes isotipos de anticuerpos contra la MSP-5, fue evaluada mediante la tcnica
de ELISA. Las proporciones de las subpoblaciones de linfocitos CD2, CD4, CD8,
linfocitos , linfocitos B y monocitos de clulas mononucleares de sangre perifrica

- viii -
(CMSP), se estimaron semanalmente por citometra de flujo utilizando los siguientes
anticuerpos monoclonales: BAQ95A, GC50A1, CACT80C, CACT81A, BIG73A y,
DH59B. El fenotipo de la poblacin de linfocitos que prolifera in vitro se determin
igualmente por citometra de flujo. El torete 805 inoculado con IB, desarroll una
respuesta inmune celular a partir del tercer inculo con el antgeno, la respuesta mostr
un perfil dosis-dependiente del antgeno. La linfoproliferacin in vitro correspondi a la
subpoblacin de linfocitos . Las CMSP de este animal, tambin respondieron al
Ag.Sol., no as, a la MSP-5. Los toretes 808 y 812 inmunizados con Ag.Sol. y MSP-5,
respectivamente, no desarrollaron inmunidad celular contra ninguno de estos antgenos.
El torete 815 (control) desarroll una respuesta muy ligera, pero transitoria, contra los
antgenos mencionados. El anlisis de isotipos de anticuerpos contra la MSP-5 de sueros
provenientes de becerros infectados experimentalmente, mostr un incremento de la
produccin de IgM y de IgG1 en contra de la MSP-5, a partir de la tercera semana
post-infeccin, hasta el final de la fase experimental. Coincidiendo sto con la fase
aguda de la infeccin. La produccin del isotipo IgM se mantuvo alta en las siguientes
semanas, no as, la produccin de IgG1 que comenz a disminuir rpidamente. La
produccin de IgG2 en contra de la MSP-5, comenz en los tres becerros, durante la fase
de convalecencia. La respuesta secundaria contra la MSP-5 en los toretes inmunizados,
fue diferente. Ninguno de los toretes desarroll anticuerpos del isotipo IgM contra la
MSP-5. El nico torete que produjo anticuerpos del isotipo IgG2 contra la MSP-5, fue
el 812, inoculado con la MSP-5. La respuesta del isotipo IgG1 contra la MSP-5 de este
animal fue igualmente vigorosa; mientras que, los toretes 808 y 815 no respondieron, y
el torete 805 mostr un leve incremento entre la semana 7 y 8 de la primera inoculacin.
En resmen, los IB fueron los nicos inmungenos que indujeron una fuerte respuesta
inmune celular. Los linfocitos T de memoria generados por el IB, reconocieron el
Ag.Sol. pero no, la MSP-5. Durante la infeccin primaria, la respuesta de isotipos contra
la MSP-5 fue predominantemente del tipo IgM e IgG1, los cuales aparecieron
tempranamente durante la fase aguda de la infeccin. La MSP-5 fue el nico antgeno
capaz de inducir una respuesta secundaria de anticuerpos, caracterizada por la
produccin de IgG1 e IgG2.
- ix -
 SUMMARY

The anaplasmosis is a hemoparasitic bovine disease caused by the intraerithrocytic

rickettsia Anaplasma marginale, that causes an economic drawback. The affected cattle
develops cellular and humoral immune response that make it take control of the primary
infection and get protection of homologous challenge. However, the immune protection
mechanism isnt completedly know. The strategies to analyze the immune response
against the rickettsia are being centered in 1. The study of the kinetic antibodies and
citokines production 2. The evaluation of the immune cells function in the infection
control by means of the spleen ablation or by the application of suppressor drogues 3.
The production of opsonizing and neutralizing antibodies. Our proposal was to aboard
the problem from a different point of view: characterize the memory T lymphocyte and
determinated the antibodies isotypes response induced by the immunization with initial
bodies (IB), soluble antigen (Ag.Sol.) and the major protein surface 5 (MSP-5) in
chronic infected calves with A. marginale. We selected 4 calves named 805, 808, 812,
815 of 1 year old and inoculated them with four doses in intervals of fifteen days of IB
(young cattle 805), AgSol. (young cattle 808), MSP-5 (young cattle 812) and with FIA
(control young cattle 815), respectivally. We also use sera weeky obtained of three
experimentally infected calves. The immune cellular response against the different
antigenic preparations was weekly evaluated in an in vitro cellular proliferation assay.
The different isotypes of antibodies produced against MSP-5 were evaluated by means
of the ELISA test. The proportions of lymphocytes subpopulations CD2, CD4, CD8,
lymphocytes, B lymphocytes and monocytes of peripheric blood mononuclear cells
(PBMC) were estimated by citometric flow utilizing the monoclonal antibodies
following BAQ95A, GC50A1, CACT80C, CACT81A, BIG73A and DH59B. The
phenotype of the lymphocyte population that proliferated in vitro was determinate by

-x-
citometric flow. The calf 805 inoculated with IB developed a cellular immune response
upon the third antigen inoculation. The response showed an antigen dependent-dose
profile. The lymphoproliferation in vitro stimulated with IB corresponsed at the
lymphocyte subpopulation. The PBMC of this animal also responded to the Ag.Sol.,
but not to the MSP-5. The 808 and 812 calves immunized with Ag.Sol. and MSP-5,
respectively, do not developed cellular immunity against any of this antigens. The 815
calf (control) developed a weak but transitory response against the mentioned antigens.
The antibodies isotypes analysis against the MSP-5 of sera obtained from experimental
infected calves showed an increase of the IgM and IgG1 production against the MSP-5,
from the third week to the end of the experimental period. This was coincident with the
acute phase of the infection. The IgM isotype production was high constant for the
following weeks, but not the IgG production, that rapidly started to decrease. The IgG2
production against the MSP-5 started in the three calves, during the convalescence
phase. The secondary response against the MSP-5 was different in the inoculated calves.
None of the calves developed antibodies of the IgM isotype against the MSP-5. The only
one that developed antibodies of IgG2 isotype against the MSP-5 was the 812, which
was inoculated with the MSP-5. The IgG1 isotype response against the MSP-5 of this
animal was vigorous, while the 808 and 815 calves did not responsed, and the 805
showed a weak increase between the week 7 and 8 of the first inoculation. In brief, the
IB had been the only immunogens that induced a very strong celular immune response.
The memory T lymphocytes generated by the IB, recognised the Ag.Sol., but not, the
MSP-5. During the primary infection, the isotypes response against the MSP-5 was
predominantly of the type IgM and IgG1, which appeared early during the acute phase
of the infection. The MSP-5 was the only antigen able to induce an antibodies secondary
response, characterized by the IgG1 and IgG2 production.

- xi -
 INDICE DE CONTENIDO

EVALUACION DEL TRABAJO DE GRADO............................................................................................iii

DEDICATORIA............................................................................................................................................iv
AGRADECIMIENTOS..................................................................................................................................v
FINANCIAMIENTO..................................................................................................................................viii
RESMEN....................................................................................................................................................ix
SUMMARY...................................................................................................................................................xi
INDICE DE CONTENIDO.........................................................................................................................xiii
INDICE DE TABLAS..................................................................................................................................xv
INDICE DE FIGURAS...............................................................................................................................xvi
INTRODUCCION..........................................................................................................................................1
Objetivo general:.........................................................................................................................................2
Objetivos especficos:.................................................................................................................................2
REVISION BIBLIOGRAFICA......................................................................................................................3
La rickettsia y la enfermedad......................................................................................................................3
Epidemiologa e impacto econmico de la anaplasmosis...........................................................................4
Inmunogenicidad del A. marginale.............................................................................................................6
Antgenos e inmungenos de A. marginale................................................................................................7
Mecanismos de inmunidad: Papel de los linfocitos T de memoria............................................................8
Mecanismos de inmunidad contra otras Rickettsias y parsitos intracelulares........................................13
MATERIALES Y METODOS......................................................................................................................16
Animales de experimentacin...................................................................................................................16
Observacin y registro clnico..................................................................................................................16
Infeccin...................................................................................................................................................16
Determinacin de la rickettsemia.............................................................................................................17
Criopreservado de A. marginale...............................................................................................................17
Purificacin de cuerpos iniciales de A. marginale....................................................................................18
Preparacin del Antgeno soluble de A. marginale...................................................................................19
Obtencin de la MSP-5 recombinante de A. marginale..........................................................................20
Purificacin de la MSP-5 recombinante de A. marginale........................................................................21
Esquema de inmunizacin........................................................................................................................22
Toma y anlisis de las muestras de sangre................................................................................................23
Sueros de respuesta inmune primaria.......................................................................................................23
Contaje diferencial y total de leucocitos de sangre perifrica..................................................................23
Aislamiento de clulas mononucleares para ensayos de blastognesis y fenotipaje................................24
Ensayo de proliferacin de linfocitos.......................................................................................................24
Preparacin de las clulas mononucleares para citometra de flujo.........................................................25
Citometra de flujo....................................................................................................................................27
Cinticas de los isotipos de anticuerpos especficos producidos en contra la MSP5...............................28
RESULTADOS.............................................................................................................................................31
Observaciones clnicas y hematolgicas...................................................................................................31
Establecimiento de las condiciones ptimas del ensayo de proliferacin celular....................................33
Especificidad de la respuesta inmunoproliferativa...................................................................................36
Variacin de los porcentajes de diferentes subpoblaciones leucocitarias de sangre perifrica................40
Cinticas de los isotipos de anticuerpos durante las respuestas inmunes primaria y secundaria.............46
DISCUSION.................................................................................................................................................50

- xii -
 Marco de referencia en el cual se inscribe el presente trabajo..................................................................50
Observaciones clnicas y hematolgicas...................................................................................................52
Establecimiento de las condiciones ptimas del ensayo de proliferacin celular....................................53
Respuesta linfoproliferativa en contra de diferentes antgenos de A. marginale......................................55
Variaciones de diferentes subpoblaciones leucocitarias de sangre perifrica...........................................58
Cinticas de los isotipos de anticuerpos producidos en contra de la MSP-5............................................59
CONCLUSIONES........................................................................................................................................62
SUGERENCIAS...........................................................................................................................................63
BIBLIOGRAFIA CITADA...........................................................................................................................64

- xiii -
 INDICE DE TABLAS

Tabla Pgina
I Anticuerpos monoclonales utilizados en el fenotipaje celular 26

- xiv -
 INDICE DE FIGURAS

Figura Pgina
1 Variacin de las concentraciones de leucocitos totales (-), 32
linfocitos (-), neutrfilos (-) y eosinfilos (-), de sangre
perifrica, durante y despus de repetidas inoculaciones () de los
toretes con 100 g de protenas de: IB (torete 805), Ag.Sol. (torete
808), MSP-5 (torete 812), disueltas en 1 mL de PBS con
1 mL de adyuvante incompleto de Freund. El torete 815 recibi
nicamente PBS con adyuvante incompleto de Freund.
2 Efecto de la concentracin del mitgeno (A) y del tiempo de 34
incubacin del cultivo (B), sobre la proliferacin in vitro de
CMSP estimuladas con Con A.
3 Efecto del "cocktail" de inhibidores proteolticos sobre la 35
respuesta proliferativa de CMSP, estimuladas con ConA.
4 Efecto de IB sobre la actividad proliferativa de CMSP, 37
estimuladas con Con A, a 3 y 6 das de cultivo.
5 Efecto de la cantidad de clulas mononucleares (A) y del tiempo 38
de cultivo (B), sobre la proliferacin de linfocitos T de memoria
especficos contra A. marginale.
6 Actividad linfoproliferativa IB-especfica in vitro de los linfocitos 39
T de memoria del torete 805 inoculado varias veces con IB, y del
torete 815 (control) inoculado mltiples veces, pero slo con el
adyuvante ms PBS.
7 Fenotipo de las subpoblaciones leucocitarias de CMSP, que 41
proliferan in vitro al reestmulo con IB.
8 Actividad proliferativa in vitro a IB, Ag.Sol. y MSP-5, de los 42
linfocitos T de memoria del torete 805, inoculado tres veces
con IB.
9 Actividad linfoproliferativa Ag.Sol.-especfica in vitro de los 43
linfocitos T de memoria del torete 808 inoculado varias veces con
Ag.Sol., y del torete 815 (control) inoculado mltiples veces, con
el adyuvante ms PBS.
10 Actividad linfoproliferativa MSP-5-especfica in vitro de los 44
linfocitos T de memoria del torete 812 inoculado varias veces con
MSP-5, y del torete 815 (control) inoculado mltiples veces, pero
slo con el adyuvante ms PBS.
11 Variacin de los porcentajes de diferentes subpoblaciones de 45
CMSP, durante el curso de repetidas inoculaciones.
12 Cinticas de los isotipos de anticuerpos especficos producidos 47
contra la MSP-5 recombinante, en la respuesta inmune primaria
de los becerros 5, 6 y 7, infectados experimentalmente..

- xv -
Figura Pgina
13 Cinticas de los isotipos de anticuerpos especficos producidos en 48
contra de la MSP-5, en la respuesta inmune secundaria de los
toretes 805, 808, 812, y 815, infectados crnicamente con
A. marginale, e inoculados () mltiples veces con: IB, Ag.Sol.,
MSP-5 y FIA, respectivamente.

- xvi -
 1

INTRODUCCION

La anaplasmosis es una enfermedad hemoparastica causada por la rickettsia de vida

intraeritroctica Anaplasma marginale, transmitida por artrpodos; ampliamente
distribuida a todo lo largo y ancho de las regiones tropicales y sub-tropicales del mundo.
Es una enfermedad que afecta a los bovinos nativos de estas regiones, y causa cuantiosas
prdidas econmicas.
La inmunidad protectiva en contra de A. marginale desarrollada por el animal durante
la infeccin, y la inducida por inmunizacin con diferentes antgenos, son hechos que
nos refieren que existen eptopes capaces de inducir proteccin, y que el bovino es capaz
de desarrollar la respuesta inmune apropiada para resolver la enfermedad.
Hasta la fecha, poco se conoce acerca del tipo de respuesta inmune que induce
A. marginale durante una infeccin; as como tambin, del mecanismo de proteccin
que se logra en el bovino, durante la misma. Se sabe que el A. marginale induce durante
la fase aguda, la aparicin de linfocitos T que responden especficamente a la
estimulacin antgenica in vitro (Gale et al., 1996 a). No obstante y en ensayos previos,
pudimos observar que, los linfocitos T de sangre perifrica de bovinos infectados
crnicamente con A. marginale, no responden in vitro a la estimulacin antgeno-
especfica, lo cual a su vez tambin dificulta, el anlisis y la caracterizacin del tipo de
respuesta inmune celular.
Las causas de la falta de respuesta proliferativa pudieran ser varias: 1. La poblacin
de linfocitos T de memoria especfica contra antgenos de A. marginale, est
residenciada en otro compartimiento del sistema inmune (Gale et al., 1996 a); 2. La
rickettsemia es muy baja (105 A. marginale/ mL) como para mantener por estmulacin
constante, una poblacin de linfocitos T lo suficientemente grande que luego pueda
responder a re-estmulos in vitro; 3. Los eritrocitos no presentan molculas del complejo
mayor de histocompatibilidad (MHC), y en consecuencia, no tienen la capacidad de
 2

estimular a los linfocitos T; y, 4. La rickettsia al permanecer dentro del eritrocito, no es

procesada antignicamente hablando por los macrfagos, y en consecuencia, las clulas
T no son estimuladas (Crist, Wisseman y Murphy, 1984).
Como hiptesis proponemos que: la reestimulacin de bovinos infectados
crnicamente, con antgenos de Anaplasma marginale, incrementa la frecuencia de
linfocitos T de memoria en sangre perifrica, e induce una respuesta inmune del Tipo 1.
Caracterizada por: 1. Una elevada proliferacin antgeno-especfica de linfocitos T
in vitro y, 2. El incremento en la produccin de anticuerpos antgeno-especficos del
isotipo IgG2 en sangre perifrica.
Para probar la hiptesis nos propusimos alcanzar los siguientes objetivos:
Objetivo general:
Caracterizar la respuesta inmune secundaria inducida por reestimulaciones
antignicas en bovinos infectados crnicamente con Anaplasma marginale.
Objetivos especficos:
Determinar las condiciones ptimas del cultivo in vitro del ensayo de proliferacin
celular, para la deteccin de linfocitos T de memoria especficos contra antgenos de
A. marginale.
Evaluar la cintica de la produccin de los isotipos de anticuerpos especficos
producidos en toretes infectados crnicamente y sometidos a re-estmulos antignicos
sucesivos de A. marginale, mediante la tcnica de ELISA; y compararla con la cintica
de una respuesta inmune primaria.
.
 3

REVISION BIBLIOGRAFICA

La rickettsia y la enfermedad
El Anaplasma marginale es una rickettsia de vida intraeritroctica de 0,3 a 1,0 m
de dimetro; miembro del genogrupo ehrlichial II del orden Rickettsiales, emparentada
filogenticamente con: Rickettsia tsutsugamushi, Ehrlichia canis y Cowdria
ruminantium, todas bacterias intracelulares (Weisburg et al., 1989; Dame et al., 1992).
Como se dijo anteriormente, el A. marginale infecta al ganado bovino y otras especies de
rumiantes silvestres, causando la anaplasmosis (Kuttler, 1984).
La transmisin de la enfermedad ocurre biolgicamente a travs de las garrapatas
duras de la familia Ixodidae (Kocan, 1986); y mecnicamente por moscas hematfagas
de la familia Tabanidae (Hawkins et al., 1982). Otras formas de transmisin reportadas
han sido, la iatrognica (Guglielmone, 1995) y, la trasplacentaria (Fowler y Swift, 1975).
El ciclo de vida en la garrrapata Dermacentor andesonis, ha sido descrito en detalle.
El A. marginale invade las clulas epiteliales del intestino medio de la ninfa, y a los
cincos das se observa dentro de vacuolas denominadas colonias, las cuales van
mostrando cambios morfolgicos conforme avanza el desarrollo de la ninfa hacia el
estado de adulto. La rickettsia tambin ha sido observada dentro de vesculas en las
glndulas salivares, las cuales se piensa que, juegan un papel relevante en la transmisin
de la enfermedad (Kocan, 1986).
En el husped vertebrado, el ciclo se inicia cuando una partcula infectiva (cuerpo
inicial) penetra el eritrocito por endocitosis. Esta se replica dentro de la vacuola de
inclusin por fisin binaria, hasta formar el cuerpo marginal que contiene de 4 a 8
cuerpos iniciales. Posteriormente, stos salen del eritrocito por un mecanismo
aparentemente no ltico, e invaden a otros eritrocitos (Ristic y Watrach, 1963;
Giardina et al., 1983).
La infeccin por A. marginale se desarrolla clnicamente de manera aguda, y sobre la
misma se distinguen tres fases: 1. La fase prepatente o de incubacin, que se inicia con
 4

la infeccin y progresa hasta que el porcentaje de eritrocitos infectados alcanza

el 1 %. Tiene una duracin entre 20 y 40 das, y transcurre en forma asintomtica.
2. La fase aguda suele durar entre 7 y 10 das, y se caracteriza por un aumento
geomtrico de la parasitemia, conjuntamente con anemia severa, prdida de peso,
aumento de la temperatura corporal, y eventualmente, la muerte del animal. 3. La fase de
recuperacin o convalecencia, en la cual el animal sana, y se reduce el nmero de
eritrocitos infectados a un nivel subpatente. Los animales durante este perodo son
asintomticos y resistentes a la re-infeccin con retos homlogos.
La infeccin produce alteraciones patolgicas en los sistemas: sanguneo
(Jones et al., 1968a; Ajayi et al., 1978); reproductor (Swift, 1989); e, inmune
(Ristic et al., 1972), del hospedero. La severidad de la anaplasmosis depende de:
factores genticos (Losos, 1986); el status nutricional (Ajayi et al., 1978); la edad del
animal (Jones et al., 1968b); los mtodos de manejo de la ganadera, y la cepa del
parsito (Kreier y Ristic, 1963). De tal manera que, infecciones hiperagudas,
agudas, subagudas, y crnicas, han sido descritas en condiciones de campo y en
condiciones experimentales.
Epidemiologa e impacto econmico de la anaplasmosis
Como se mencion anteriormente, la anaplasmosis afecta grandes poblaciones de
ganado bovino que habitan en las regiones tropicales y subtropicales, ocasionando
cuantiosas prdidas econmicas, lo cual la convierte en un problema grave de salud
animal (Losos, 1986). En los Estados Unidos de Norteamrica donde la enfermedad
ocurre independientemente de otras hemoparasitosis, se ha estimado que, la infeccin
ocasiona la muerte de 50.000 a 100.000 reses al ao, que con un costo promedio de
502 $ por res, representa prdidas anuales entre los 25 y 50 millones de dlares
(McCallon, 1973; USDA, 1996). Las prdidas subclnicas por: abortos, reduccin
significativa de la ganancia de peso, y gastos de asistencia mdica y medicinas, pudieran
duplicar y hasta cuadruplicar esta cifra (Alderink y Dietrich, 1981).
En Venezuela el impacto econmico atribuible especficamente a la anaplasmosis, es
difcil de estimar, por un lado, porque se suele presentar frecuentemente en forma
coenzotica con otras enfermedades hemoparasticas, y por el otro, debido a las
 5

deficiencias en el registro sanitario nacional, lo que hace difcil obtener cifras precisas al
respecto. Sin embargo, Schroeder et al. (1970) estimaron en Venezuela para los aos
1966-1969, prdidas en el orden de los 74 millones de bolvares anuales, unos 16
millones de dlares para esa poca.
La seroprevalencia de A. marginale en Venezuela para los aos 1966-1969 fue de
66,5 %, segn prueba de aglutinacin capilar (Schroeder et al., 1971). Estudios ms
recientes realizados en la regin centro-occidental del pas, mostraron con la prueba de
inmunofluorescencia, una seroprevalencia del 57,7 %; y mediante el test de aglutinacin
del ltex, una del 48,6 %, (James et al., 1985). Reyna-Bello et al. reportaron en 1998, la
cifra de 47 % por la tcnica de "Anlisis inmunoabsorbente ligado a enzimas" (ELISA).
Las medidas de control de la infeccin incluyen uno combinacin de los siguientes
mtodos: 1. Control de la poblacin de garrapatas mediante la aplicacin regular de
ixodicidas a los bovino; 2. Aplicacin de antibiticos para tratar prevenir la infeccin;
y, 3. Uso de vacunas. Los dos primeros mtodos son costosos, exigen
intensas jornadas de trabajo, adems crean una poblacin de bovinos cada vez
ms susceptible a la infeccin. Por contraste la vacunacin, es un mtodo econmico y
eficaz para el control de la enfermedad (Palmer, 1989; Montenegro-James et al., 1995;
Palmer y McElwain, 1995).
Las estrategias inmunoprofilcticas para el control de la anaplasmosis incluyen:
la premunicin; la inmunizacin con cepas de A. marginale atenuadas inactivadas; y, el
uso de inmungenos a base de homogenizados de membranas protenas aisladas de
la rickettsia. Sin embargo, ninguno de estos mtodos ha sido totalmente eficaz.
La premunicin y el uso de vacunas con parsitos atenuados, inducen un alto nivel de
proteccin, pero al mismo tiempo conllevan riesgos de transmisin de otras infecciones
y enfermedades emergentes. Las vacunas a base de parsitos inactivados inducen
anticuerpos anti-eritrocitos que producen eritrlisis en animales recin nacidos. Slo las
vacunas de subunidades proticas resultan ser hasta ahora, las ms seguras y confiables,
con el nico inconveniente de que inducen proteccin parcial (Palmer, 1989).
Inmunogenicidad del A. marginale
 6

El A. marginale es una rickettsia altamente inmunognica capaz de inducir

una respuesta especfica de anticuerpos y celular. La presencia de anticuerpos
especficos ha sido detectada durante las distintas fases de la enfermedad, mediante
diferentes mtodos serolgicos, tales como: fijacin de complemento (Murphy et al.,
1966); aglutinacin capilar y de tarjeta (Ristic, 1962); fluorescencia (Goff et al., 1990);
y, ELISA (Winkler et al., 1987).
La cintica de anticuerpos fijadores de complemento ha sido bien documentada.
Estos anticuerpos especficos son detectados a los pocos das de la infeccin, y son
exclusivamente del tipo inmunoglobulina M (IgM). Durante la fase aguda de la
enfermedad, alcanzan un ttulo mximo de aproximadamente 1:10.240, de los cuales
el 75 % son del tipo IgM y el 25 % del tipo inmunoglobulina G (IgG). Luego el ttulo
declina gradualmente hasta alcanzar un valor de 1:20, a los 545 das de la infeccin
(Murphy et al., 1966).
La inmunidad mediada por clulas en la anaplasmosis, ha sido evaluada por ensayos
in vivo e in vitro. La infeccin con cepas virulentas atenuadas de A. marginale, no
induce reaccin cutnea de hipersensibilidad tarda, mientras que, la inoculacin
con la forma inactiva de la rickettsia conjuntamente con adyuvante, induce una
intensa reaccin al aplicar el antgeno sobre la piel (Carson et al., 1976; Montenegro-
James et al., 1995).
La respuesta de inhibicin de la migracin de macrfagos (RIMM) ha sido seguida
durante el curso de la infeccin con A. marginale, bajo diferentes condiciones
experimentales. Los bovinos que mostraron incremento de la RIMM al final de la fase
prepatente durante la fase aguda, desarrollaron una infeccin suave y sobrevivieron; en
contraposicin a los que no experimentaron el aumento, los cuales desarrollaron una
infeccin severa y perecieron (Buening, 1976). Los bovinos vacunados con la forma
inactiva del A. marginale, desarrollaron una RIMM transitoria y suave que no
confiri proteccin inmunolgica completa; en contraste a los que recibieron
las formas vivas, los cuales resultaron resistentes a la re-infeccin (Carson et al., 1977a;
Carson et al., 1977b).
Antgenos e inmungenos de A. marginale
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Los antgenos inductores de inmunidad, se postula que se encuentran en la superficie

del A. marginale (Palmer y McGuire, 1984). En soporte a esta conjetura se ha
demostrado que, bovinos inmunizados con las fracciones de membranas de
A. marginale, aisladas por centrifugacin en gradientes de densidad de sacarosa,
desarrollan una significativa proteccin contra retos homlogos, en comparacin con los
animales inmunizados slo con el adyuvante. El nivel de proteccin obtenido ha sido
similar al observado por premunicin (Tebele et al., 1991).
El uso de sueros inmunes de conejo y de bovino conjuntamente con anticuerpos
monoclonales, ha permitido caracterizar seis protenas potencialmente protectoras sobre
la membrana citoplasmtica de A. marginale, denominadas en ingls Major Surface
Proteins (MSP). As tenemos con sus respectivos pesos moleculares: MSP-1a
(105 kiloDaltons), MSP-1b (100 kDa), MSP-2 (42-36 kDa), MSP-3 (86 kDa), MSP-4
(31kDa) y la, MSP-5 (19 kDa) (Palmer y McGuire, 1984; Tebele et al., 1991).
Algunas de las MSPs han sido estudiadas en la induccin de una inmunidad
protectiva usando tanto polipptidos nativos purificados, como recombinantes.
Inmunizacin de bovinos con MSP-1 nativa recombinante, MSP-2 nativa y MSP-4
nativa recombinante, han inducido proteccin en contra de anaplasmosis aguda. Esta
"proteccin" ha sido definida estadsticamente como la reduccin significativa en el pico
de rickettsemia y en la anemia, comparada con bovinos controles inmunizados slo con
el adyuvante (Palmer et al., 1986; 1988; Palmer, 1989; Palmer y McElwain, 1995). No
obstante, aunque se sugiera hoy en da que a travs de estos inmungenos se puede
inducir inmunidad, ninguno de stos ha sido rigurosamente optimizado para determinar
si el nivel de proteccin es suficiente para proteger en el campo.
La MSP-5 ha sido caracterizada como una protena de superficie de membrana, la
cual es codificada por una copia simple de genes (Visser et al, 1992). A diferencia de la
MSP-1a y la MSP-1b, las cuales median la adherencia a los eritrocitos bovinos, su
funcin todava no se conoce. Comparativamente con otras MSPs, su valor protectivo no
es relevante, ya que becerros inmunizados tanto con MSP-5 nativa como recombinante,
no fueron protegidos ante diferentes tipos de retos comparados con becerros control
inmunizados con adyuvante solamente (Palmer y McElwain, 1995). Sin embargo, en
 8

varias ocasiones, se le ha reportado como una protena conservada en todas las especies
reconocidas de Anaplasma, y se ha encontrado que al menos un eptope conservado de
sta, resulta inmunodominante en becerros infectados. De all su gran valor como
antgeno de reconocimiento para el diagnstico de la anaplasmosis en bovinos
(Reyna-Bello et al., 1998).
Otro grupo igualmente importante de antgenos, pero menos estudiados, son los
denominados "Antgenos solubles". El Antgeno soluble se define como, cualquier
preparacin antignica obtenida despus de la ruptura mecnica de los eritrocitos
infectados, seguido de una centrifugacin a 100.000 x g. La preparacin puede contener:
antgenos de excrecin-secrecin o metablicos (exo-antgenos) del parsito, liberados
por s slos al sobrenadante de cultivo al plasma; protenas del parsito liberadas al
citoplasma del eritrocitos; y, molculas propias del parsito, que de alguna forma, son
adheridas tienen afinidad por la membrana celular del eritrocito (Aso, 1985).
Antgenos solubles obtenidos de los sobrenadantes de cultivos contnuos de Babesia
bovis y B. bigemina, han podido inducir grados variables de inmunidad protectiva,
lo cual a su vez ha significado que, una preparacin antignica inerte, puede
tener la capacidad de inducir al menos proteccin parcial (Smith et al., 1981;
Timms et al., 1983; Montenegro-James et al., 1987). En el caso particular de
A. marginale se ha demostrado que, sueros de animales infectados en forma
natural y experimental, reconocen diferentes polipptidos de 33, 29-30, 27 y
19 kDa, en la fraccin de antgenos solubles de la rickettsia (Leal et al., 2000).
No obstante, est claro que el gran reto de lograr a largo plazo proteccin en contra
de mltiples infecciones hemoparasticas co-endmicas usando vacunas multivalentes,
requerir una mayor rigurosidad en la seleccin de los antgenos.
Mecanismos de inmunidad: Papel de los linfocitos T de memoria.
Una caracterstica importante del sistema inmune es, la memoria inmunolgica.
La memoria inmunolgica se define como la capacidad que tiene el sistema inmune
durante un reto secundario, de reconocer la identidad del patgeno, y desarrollar una
rpida y vigorosa respuesta capaz de controlar la infeccin en corto tiempo. Esta es
especfica, y se mantiene a largo plazo; es adems un fenmeno celular, reflejo de la
 9

expansin clonal de clulas precursoras, reactivas especficamente en contra de un

antgeno en particular.
Los linfocitos T de memoria no previenen la infeccin. Sin embargo, despus
de la re-exposicin al patgeno, proliferan rpidamente, y se diferencian a
clulas efectoras que controlan la extensin de la infeccin, previniendo la enfermedad
(Ahmed y Gray, 1996). El desarrollo de linfocitos T de memoria durante la respuesta
inmune, es un proceso complejo sobre el cual se pueden distinguir tres fases.
La primera fase consiste en la activacin y expansin de los linfocitos T vrgenes por
las clulas presentadoras de antgeno (APC); ocurre durante los primeros siete das
despus del reto antignico, estando bajo la influencia de las citocinas y molculas co-
estimuladoras secretadas y expresadas por las APC. Los linfocitos T despus de ser
estimulados por las APC, entran en repetidos ciclos de divisin celular, expandindose la
poblacin inicial de 100 a 5.000 veces. En este momento se activa una serie de genes,
conduciendo a la secrecin de citocinas y a la expresin de sus receptores. Se generan
los linfocitos T efectores, sensibles a factores de crecimiento como, la interleucina 2
(IL-2) y la interleucina 4 (IL-4). Cuando son re-estimulados con el antgeno, stos
sintetizan en pocas horas, elevados niveles de estas citocinas.
Las clulas efectoras T median diferentes actividades inmunes segn su
especializacin. Ejercen actividad citotxica directamente; activan a los macrfagos; y
ejercen potentes funciones reguladoras sobre diferentes clulas, como los linfocitos B.
La segunda y tercera fase corresponden a la muerte y contraccin de la poblacin de
linfocitos T efectores y, al perodo de estabilidad, respectivamente. La primera de stas,
ocurre entre los 7 y 30 das posteriores al estmulo antignico, y en ella son eliminadas al
menos el 95% de las clulas efectoras antgeno-especficas. Sprent (1997) seala que,
este hecho ocurre por un desbalance entre la expresin incrementada de molculas pro-
apoptticas como Fas y Factor de Necrosis Tumoral (TNF), y la reducida expresin de
molculas anti-apoptticas como las de la familia de protenas Bcl2. En la segunda de
stas o fase de estabilidad, se mantiene una poblacin estable de clulas denominadas
linfocitos T de memoria, los cuales persisten por muchos meses y aos.
 10

El origen de las clulas de memoria no est claro an. No se tiene certeza de si se

originan a partir de las clulas efectoras, son una pequea poblacin de clulas
activadas programadas a tranformarse en clulas de memoria (Sprent, 1997).
La transformacin del linfocito T vrgen en clula efectora y de memoria, va
acompaada de cambios significativos en la expresin diferencial de molculas de
superficie denominadas en ingls "Clusters Differentiation" (CD). En ratones y
humanos, los linfocitos T vrgenes expresan una elevada densidad de las isoformas de
alto peso molecular A, B, y C de CD45 (antgeno leucocitario comn; juega un papel
importante en la transduccin de la seal de la tirosina fosfatasa que acta durante la
activacin de la clula T) conocidas como CD45R (con expresin celular restringida;
CD45RA en clulas T vrgenes), adems de, una baja densidad de la isoforma de bajo
peso molecular denominado CD45RO (expresada principalmente en clulas T de
memoria). Adicionalmente, muestran altos niveles de CD62L (cuyo nombre comn es
selectina-L; acta en la adhesin endotelial de linfocitos T) y baja densidad de: CD44;
ICAM-1 (molcula de adhesin intercelular); LFA-1 (antgeno asociado a la funcin del
linfocito); CD43 (cuyo nombre comn es sialoforina; activacin de la clula T); y las
integrinas, 41 (se conoce con el nombre de VLA-4; importante en la activacin muy
tarda de las clulas T, y media el "homing" de los linfocitos al endotelio en los lugares
perifricos de la inflamacin) y 47 (receptor del ligando VCAM-1). La activacin del
linfocito T por el antgeno, revierte el patrn de expresin de estas molculas,
conduciendo a una marcada disminucin de la densidad de CD62L y de CD45RA/B/C, y
al aumento en la expresin de: CD45RO; CD44; CD54 (ICAM-1) (ligando del LFA-1);
CD43 (Bell, 1992; Beverley, 1992; Swain et al., 1996; Sprent, 1997).
El desarrollo de anticuerpos monoclonales contra antgenos de diferenciacin de
linfocitos bovinos, ha permitido el progreso rpido en la caracterizacin del sistema
inmune de esta especie. Algunos de los CD homlogos definidos para la especie humana
y la murina, han sido descritos para bovinos. Las molculas equivalentes de los: CD1,
CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, CD44, CD45, CD45R, CD45RO,
CD58, y los CD54, han sido caracterizados en bovinos y otras especies de rumiantes
(Naessens et al., 1997).
 11

En el sistema inmune bovino y ovino, las clulas T vrgenes y las de memoria,

muestran un patrn en la expresin de molculas de superficie similar al descrito
anteriormente (Mackay et al., 1990; Howard et al., 1991b; Howard et al., 1992;
Bembridge et al., 1995).
El patrn de secrecin de citocinas de los linfocitos se expresa tambin
diferencialmente, durante la conversin de los linfocitos T vrgenes a clulas efectoras
de memoria. Los linfocitos CD4+ vrgenes en reposo, producen slo IL-2 al ser
estimulados in vitro. La expresin de los genes de otras citocinas ocurre a las
1218 horas post-estimulacin; y la capacidad de secretar citocinas ocurre a los 35 das
despus, cuando las clulas alcanzan el pico de su actividad efectora. El patrn de
expresin de citocinas puede ser polarizado hacia: el tipo denominado "Th1" con
secrecin principalmente de IL-2, interfern gamma (INF-) y, factor de necrosis
tumoral beta (TNF-); hacia el tipo denominado "Th2" con secrecin principalmente
de IL-4, interleucina-5 (IL-5), interleucina-10 (IL-10); inclusive, hacia un patrn
heterogneo denominado "Th0", tanto a nivel individual como a nivel poblacional
(Mosmann et al., 1986; Swain et al., 1996).
La funcin efectora de las clulas Th1 es mediada a travs del INF-. El INF- induce
en los macrfagos la expresin de altos niveles de molculas clase II del complejo
mayor de histocompatibilidad (MHC) y del receptor para la Fc de IgG, mejorando as su
eficiencia como APC y su capacidad fagoctica, respectivamente
(King y Jones, 1983; Zlotnitk et al., 1983).
Esta misma citocina adems de incrementar la produccin y descarga de metabolitos
intermediarios del oxgeno y del nitrgeno, los cuales tienen potente actividad
microbicida (Nathan et al., 1983; Guyre et al., 1983), induce tambin la produccin
de otras como: interleucina 1 (IL-1); Factor de Necrosis Tumoral alpha (TNF-);
interleucina 6 (IL-6); e, interleucina 8 (IL-8), importantes todas por ser mediadores de
la inflamacin, por estar involucradas en la produccin de las protenas con efectos
antibacterianos (Howard et al., 1993).
 12

Finalmente el INF- en humanos, incrementa en forma selectiva la produccion de

inmunoglobulina G2a (IgG2a) e inhibe la secrecin de inmunoglobulina G1 (IgG1)
(Finkelman et al., 1988). En bovinos estimula la produccin de la inmunoglobulina G2
(IgG2) (Estes et al., 1994); y tambin induce la produccin de xido ntrico
(Adler et al., 1994).
Los linfocitos Th2 ejercen su accin efectora principalmente a travs de: IL-4, IL-5, e
IL-10. La IL-4 regula la proliferacin y diferenciacin de linfocitos B y T, de
macrfagos, y de mastocitos. En linfocitos B de humanos y de ratn, la IL-4 incrementa
la expresin de molculas clase II del MHC, del receptor de FcRIIB (cuyo nombre
comn es CD23; receptor de baja afinidad de funcin desconocida), del CD40 (papel en
la activacin de la clula B inducida por el contacto de la clula T), y de la IgM de
superficie; aumentando as la proliferacin en respuesta a la interaccin del antgeno con
el receptor. La IL-4 induce en el ratn el "switch" a IgG1, en el humano a
inmunoglobulina G4 (IgG4), y en ambas especies a inmunoglobulina E (IgE). Posee
adems en linfocitos T humanos, un efecto inhibitorio en la produccin de INF-, por lo
que juega un papel protagnico en la diferenciacin de estas clulas hacia un patrn Th2;
no as en el caso de ratones (Howard et al., 1993).
En bovinos se ha demostrado que IL-4 induce la produccin de una manera dosis-
dependiente de IgG1, de IgE y de IgM, pero no altera la produccin de IgG2 ni de
inmunoglobulina A (IgA). La IL-4 bovina tambin incrementa en los linfocitos B, la
expresin de molculas clase II del MHC, del receptor Fc de baja afinidad de IgE, y del
receptor de IL-2.
La IL-5 afecta principalmente al tejido hematopoytico, actuando como un potente
factor estimulante de eosinofilia (Sanderson, 1992). La IL-5 es el principal factor de
diferenciacin que induce a las clulas B a producir inmunoglobulinas al contacto con
linfocitos T activados (Coffman et al., 1988).
La IL-10 es una citocina que regula negativamente las funciones de varios tipos de
clulas efectoras. En macrfagos suprime la produccin de IL-1, de TNF- y de,
interleucina-12 (IL-12); adems de, disminuir la expresin de molculas clase II del
 13

MHC y de CD28. De este modo afecta, en forma negativa, tanto su capacidad

presentadora de antgeno como su capacidad co-estimuladora, respectivamente. Tambin
inhibe la produccin de xido ntrico (Waal Malefyt et al., 1991).
Las citocinas secretadas por cada subpoblacin Th1 Th2, sirven como factores de
crecimiento y diferenciacin autocrinos, y ejercen funciones regulatorias negativas las
unas sobre las otras. Como se dijo anteriormente, el IFN- producido por clulas Th1,
amplifica el desarrollo Th1 e inhibe la proliferacin de clulas Th2; mientras que, la
IL-10 producida por clulas Th2, bloquea la activacin de clulas Th1. El resultado neto
de la amplificacin mediada por citocinas ms la regulacin cruzada, consiste en que,
una vez que una respuesta inmune de clulas T comienza a desarrollarse a lo largo de un
patrn Th1 de un patrn Th2, tiende progresivamente a polarizarse en una en otra
direccin. Durante una infeccin, el desarrollo in vivo de linfocitos T efectores de
memoria con un patrn polarizado Th1 Th2, puede tener importantes consecuencias
para el control progresin de la enfermedad (Abbas et al., 1996).
En bovinos, el estudio de 62 clones de linfocitos T especficos contra antgenos de
varios parsitos revel que la mayora co-expresaban IL-4 e INF-, en consecuencia, el
perfl polarizado Th1 vs Th2, era raramente observado (Brown y Estes, 1997).
No obstante en otros sistemas animales, el desarrollo de inmunidad en infecciones
naturales y experimentales han mostrado patrones de produccin de citocinas y
reacciones efectoras que son claramente indicativas de la dominancia Th1 Th2.
Infecciones con patgenos intracelulares como Leishmania spp., Listeria spp. y
Mycobacterium spp. inducen una respuesta del tipo Th1, la cual es principalmente del
tipo celular; mientras que, patgenos extracelulares como los helmintos inducen un
patrn Th2, mediado principalmente por anticuerpos (Brown et al., 1990).
Mecanismos de inmunidad contra otras Rickettsias y parsitos intracelulares
El conocimiento del mecanismo de inmunidad contra A. marginale se ha visto
fuertemente limitado por la imposibilidad de disponer de un modelo experimental en el
ratn, y por el costo elevado de producir bovinos genticamente idnticos que permitan
realizar estudios de transferencia adoptiva de clulas.
 14

Por otro lado, el mecanismo inmune mediante el cual el bovino reduce la rickettsemia
a un nivel subpatente y se hace resistente a retos homolgos, tampoco se conoce.
Aunque la presencia de anticuerpos especficos contra protenas de cuerpos
iniciales de A. marginale, tiene la capacidad de neutralizar inculos letales (Palmer y
McGuire, 1984), de inhibir su interaccin a eritrocitos (McGarey et al., 1994) y de,
incrementar significativamente su fagocitosis por macrfagos (Cantor et al.,1993), sin
embargo, no parece ser suficiente para el control de la infeccin, ya que, la transferencia
pasiva de sueros inmunes no confiere proteccin (Gale et al., 1992). Por lo tanto es fcil
suponer que, en el control de la infeccin, se encuentra implicado un mecanismo
complementario de inmunidad celular. En soporte a esta idea se ha demostrado que, en
becerros esplenectomizados y bovinos portadores sanos inmunosuprimidos tanto con
ciclofosfamida (droga que selectivamente elimina los linfocitos B productores de
anticuerpos) como con dexametasona (frmaco que suprime la actividad de los
linfocitos T), se provoca la recrudescencia de la infeccin (Jones et al., 1968b; Kuttler y
Adams, 1977; Corrier et al., 1981).
Los estudios de inmunidad realizados en diferentes rickettsias emparentadas
filogenticamente con A. marginale y en parsitos intraeritrocticos como
Plasmodium spp., sugieren fuertemente que en el control de las infecciones, participa un
mecanismo mixto de inmunidad humoral y celular mediado por linfocitos T CD4 +,
secretores de INF- e IL-2. Esto nos proporciona un marco de referencia de los posibles
mecanismos de inmunidad involucrados en la infeccin contra A. marginale.
La infeccin de ratones con Rickettsia tsutsugamushi y R. rickettsii induce la
aparicin de linfocitos T especficos que proliferan in vitro ante los estmulos
antignicos rickettsiales. El INF- producido por las clulas estimuladas in vitro,
incrementa la actividad rickettsicida de los macrfagos, e inhibe el crecimiento de la
rickettsia en las clulas endoteliales. La produccin de INF- por linfocitos T in vitro, y
los ttulos de ste en suero, se incrementan paralelamente con la adquisicin de la
resistencia en contra de la infeccin rickettsial (Kodama et al.,1987).
 15

La transferencia adoptiva de clulas T CD4+ y CD8+ confiere proteccin contra

dosis letales de Rickettsia conorri en ratones. El INF- y el TNF- inducen la
eliminacin de la rickettsia tanto in vivo como in vitro, a travs de un mecanismo que
involucra la sntesis de xido ntrico (Hui-min Feng et al., 1997). Adicionalmente, el
tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti INF- de ratones resistentes a
Rickettsia conorii, los hace sensible despus de una infeccin experimental, y provoca
una mortalidad del 47 % en contraposicin al grupo control, el cual resulta totalmente
resistente a la re-infeccin (Han Li et al., 1987).
Durante el estado eritroctico asexual de Plasmodium chabaudi chabaudi se ha
demostrado que, ambas subpoblaciones Th1 y Th2, estn involucradas en la
proteccin. Mientras las clulas Th1, durante los primeros 10 das de
la infeccin, protejen a travs de un mecanismo dependiente del xido ntrico, las clulas

Th2, despus de los primeros 18 das post-infeccin, protejen estimulando y

acelerando la produccin de IgG1 especfica, con la resolucin total de la
enfermedad al cabo de varias semanas (Suss et al.,1988; Meding y Langhorne, 1991;
Taylor-Robinson et al.,1993).
El anlisis de lneas celulares obtenidas de becerros inmunizados con membranas
citoplasmticas de A. marginale, ha demostrado que estn constitudas por linfocitos
CD4+ del tipo que producen INF-. Lo que ha resultado a su vez consistente con la
hiptesis de que, la respuesta inmune protectiva en contra de parsitos rickettsiales en
gran parte depende del INF- (Brown et al., 1998).
 MATERIALES Y METODOS

Animales de experimentacin
Se utilizaron 5 animales (Bos taurus) raza Holstein, procedentes de la Finca
Experimental Sta. Mara de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad
Central de Venezuela, ubicada en la carretera Cagua-La Villa, en el Municipio Zamora
del Edo. Aragua. Los toretes 805, 808, 812 y 815 resultaron por criterios serolgicos,
parasitolgicos, y clnicos, negativos a tripanosomiasis y babesiosis, pero positivos a
anaplasmosis. Durante toda la investigacin, fueron mantenidos en dicha finca, intactos
y en condiciones higinicas libres de garrapatas. Hospedados en corrales de

aproximadamente 9 m2, alimentados diariamente con 5 Kg. de cebada (residuos de

cervecera) por animal, y pasto ad libitum.
El becerro 822 result por los mismos criterios, negativo a tripanosomiasis,
babesiosis y anaplasmosis. Este fue esplenectomizado, y mantenido en condiciones
higinicas libres de garrapatas, en el bioterio de la Universidad Simn Bolivar en
Sartenejas, Edo.Miranda. Fue infectado experimentalmente con A. marginale, y tratado
con Emicina LA (Pfizer), de acuerdo a la posologa recomendada por el fabricante, en el
momento en el cual el hematocrito alcanz un valor menor del 10 %.
Observacin y registro clnico
El estado fsico de los animales se examin interdiariamente durante el curso del
experimento (10 semanas), y se efectu cada 15 das, un registro clnico de: temperatura,
frecuencia cardaca y respiratoria.
Infeccin
El animal esplenectomizado (822) fue infectado experimentalmente con un inculo
de 2,7 x 108 A. marginale (aislado Zulia 1990 A), contenido en una suspensin de
eritrocitos infectados, preservados con dimetil sulfxido (DMSO) (Riedel de Han, cat.
N 34943) 4 M en nitrgeno lquido. El inculo se dividi en dos alcuotas iguales de
3,5 mL, que se aplicaron en forma intravenosa e intramuscular. La parasitemia fue
seguida interdiariamente durante la fase prepatente de la infeccin, y diariamente
durante la fase aguda.
Determinacin de la rickettsemia
La parasitemia se determin semanalmente utilizando la tcnica fluorescente de
naranja de acridina y bromuro de etidium (Caballero, 1993). Consisti en mezclar 90 L
de sangre con 10 L de una solucin de naranja de acridina (Sigma , cat. N A-6014) y
bromuro de etidium (Sigma , cat. N E-8751), a una concentracin de 100 g /mL en
buffer fosfato salino (PBS) (fosfato disdico (Na2HPO4) (Sigma , cat. N S-0876);
fosfato monosdico (NaH2PO4) (Fisher Scientific Company, cat. N S-369)) 10 mM
pH 7,2, conteniendo 150 mM de cloruro de sodio (NaCl) (Riedel de Han, cat.
N 13541). Se colocaron 10 L de la mezcla sobre un cubreobjeto inclinado, y se dej
que la gota se deslizara y secara. Se observ el frotis en un microscopio de
epifluorescencia marca Zeiss modelo Standard Lab 16, utilizando una lmpara de 50 W
de mercurio y un juego de filtros, compuesto por un: filtro excitador BP 450-490, divisor
cromtico FT 510, y un filtro supresor 520.
Criopreservado de A. marginale
El criopreservado de A. marginale se obtuvo a partir de muestras de sangre del
becerro 822 infectado experimentalmente, cuando ste alcanz su mxima parasitemia
( 20 %). La sangre se obtuvo por puncin yugular en bolsas de transfusin (Baxter
Fenwal Unidad Bolsang ,cat. N CPDA-1) de 450 mL, que contenan solucin de
citrato-fosfato-dextrosa-adenina como preservativo. Se centrifug en tubos de propileno
estriles (Fisherbrand, cat. N 05-539-7) de 50 mL a 800 x g por 30 min. sin freno, en
la centrifuga International modelo IECNH-SII. La cubierta de leucocitos fue removida
cuidadosamente, y los eritrocitos lavados cuatro veces con PBS hasta obtener un
sobrenadante claro. Por ltimo se resuspendieron lentamente, en igual volmen
de DMSO 4 M diluido en PBS. La suspensin fue congelada a -80 oC, hasta el
momento de su uso.
Purificacin de cuerpos iniciales de A. marginale
Los cuerpos iniciales se aislaron bajo condiciones estriles, segn el procedimiento
descrito por Palmer y McGuire (1984). Se descongelaron 15 mL de criopreservado de
eritrocitos infectados a 37 oC por 15 min., se resuspendieron en 35 mL de PBS, y se
centrifugaron a 28.145 x g por 30 min. en una centrifuga refrigerada Sorvall RC-5B,
usando el rotor SS 34. El sedimento se lav cuatro veces con 40 mL de PBS. Despus
del ltimo lavado, el precipitado blanquecino se resuspendi en 10 mL de PBS, y se
sonic por 2,5 min. a 50 W de potencia (Output power 90%) y 23 kHz, en un sonicador
Microson modelo MS-50. La preparacin se centrifug a 2000 x g durante 30 min., en
una centrifuga Sorvall modelo RT6000B, y se lav el sedimento dos veces con PBS.
Los cuerpos iniciales sedimentados se resuspendieron en 2 mL de PBS y 2 mL de
DMSO 4 M. Finalmente se hicieron alcuotas de 500 L por vial, y fueron
preservadas a -80 C.
La pureza de la suspensin de cuerpos iniciales se determin por microscopa
de luz. La concentracin de protenas de la suspensin se determin mediante el mtodo
de Lowry, modificado por Bollag y Edelstein (1991).
Para los ensayos de proliferacin de linfocitos, el contenido de un vial de cuerpos
iniciales fue previamente centrifugado a 10.000 x g por 1 min., en una centrifuga
Eppendorf Brinkmann modelo 5412. El sedimento se resuspendi en 1 mL de PBS, y se
centrifug nuevamente. Se realizaron otros dos lavados bajo las mismas condiciones.
Finalmente se resuspendi en un volmen de PBS igual al volmen inicial de la
preparacin. A partir del valor inicial de la concentracin de protenas totales de cuerpos
iniciales, se realizaron diluciones de: 20, 10, 5, y 1 g/mL en RPMI 1640 (Gibco , cat.
N 430-1800) pH 7,2, suplementado con: 2 grs/Lts de carbonato de sodio (NaHCO 3)
( Riedel de Han, cat. N 31437); HEPES (Sigma , cat. N H-9136)
a 25 mM; 10% de suero fetal bovino (Gibco BRL, cat. N 16000-044 ), 100 g/mL de
sulfato de estreptomicina (Sigma , cat. N S- 9137), 100 UI/mL de Penicilina G
(Sigma , cat. N 3032), 2 mM de L-glutamina (Gibco , cat. N 810-1051 IL) y
5 x 10-5 M de mercaptoetanol (Sigma , cat. N M-6250), de las cuales se hicieron a su
vez alcuotas, y se almacenaron a -80 C hasta su uso.
Preparacin del Antgeno soluble de A. marginale
El Antgeno soluble fue obtenido segn el mtodo descrito por Aso (1985).
Para sto se recolectaron 500 mL de sangre perifrica con una rickettsemia del 20 %, y
se centrifug a 1470 x g por 20 min. en la Sorvall RT modelo 6000B. Los eritrocitos
empaquetados fueron lavados cuatro veces en una proporcin de 1 en 3: dos con PBS,
seguido de un lavado con buffer glicina-HCl (Sigma , cat. N G-7126) 50 mM pH 3,6
conteniendo 150 mM de NaCl; y finalmente con PBS.
El sedimento se resuspendi en la proporcin 1:3 en PBS suplementado con los
siguientes inhibidores proteolticos: cido etilendiaminotetractico sal disdica (EDTA)
(Sigma , cat. N ED4 SS) 2 mM; fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF) (Sigma , cat.
N P7626) 1 mM; y, fenantrolina (Aldrich, cat. N 13,1377) 2 mM. La suspensin fue
sonicada por 5 min. contnuos a 90 % (45 W) con un sonicador Microson
modelo MS-50, y luego centrifugada por 15 min. a 6.722 x g en una Sorvall
modelo RC-5B. El sobrenadante obtenido se centrifug en una ultracentrifuga Beckman
modelo L870 a 100.000 x g por 1 hora y a 4 C, utilizando un rotor Ty 42,1.
Nuevamente se recuper el sobrenadante el cual contena el Antgeno soluble de
A. marginale en forma cruda, y se congel a 80 C hasta su uso.
Una alcuota de la solucin del Antgeno soluble crudo se descongel a 37 oC
por 15 min., y se procedi a realizar la precipitacin doble del Antgeno soluble con
sulfato de amonio (Riedel-de Han, cat. N 31119) pH 7,0, de la siguiente manera: por
cada 3 mL de antgeno crudo se le aadi gota a gota y con agitacin, 4,5 mL de una
solucin saturada de sulfato de amonio, para obtener una concentracin final del 60 %.
Se centrifug a 11.950 x g por 15 min a 8 C en una centrifuga Sorvall modelo RC5B
con el rotor SS 34. Se descart el sobrenadante, y el precipitado se resuspendi en PBS a
un volmen equivalente al de la alcuota inicial de antgeno crudo. Se reprecipit
nuevamente el Antgeno soluble utilizando el mismo procedimiento. El sedimento se
resuspendi en un volmen equivalente a la mitad de la alcuota inicial de antgeno
crudo. Se dializ por 48 horas con tres cambios de 500 mL de PBS 20 mM, conteniendo
la mezcla de inhibidores proteolticos. Finalmente se centrifug a 20.000 x g por 20 min.
en la Sorvall RC5B con el rotor SS 34.
Se determin la concentracin de protenas del preparado mediante el mtodo
modificado de Lowry, y se verific su antigenicidad a temperatura ambiente por
inmunodifusin en agar al 1% diluido en PBS con 8 % de NaCl. Para la utilizacin del
Antgeno soluble en los ensayos de blastognesis, se esteriliz mediante ultrafiltracin
con filtros millipore de 0.22 m, y se realizaron diluciones a partir del valor inicial de
la concentracin de protenas totales de: 20, 10, 5, y 1 g/mL en RPMI-suplementado.
Se hicieron alcuotas de stas en viales, para ser almacenadas a 80 C hasta su uso.
Obtencin de la MSP-5 recombinante de A. marginale
La protena MSP-5 recombinante de A. marginale fue gentilmente donada por el
Dr. Armando Reyna-Bello, del Lab. de Inmunobiologa de la Universidad Simn
Rodriguez. Brevemente: el ADN genmico fue aislado de cuerpos iniciales de
A. marginale mediante procedimientos standard (Reyna-Bello et al.,1998). Se utiliz la
secuencia de la MSP-5 descrita por Visser et al. (1992) para construir los cebadores y
utilizarlos para amplificar el gen por PCR, a partir del ADN genmico de A. marginale
(Reyna-Bello et al., 1998). El gen msp-5 amplificado por PCR, fue clonado utilizando
el plsmido pCRII (TA cloning kit; Invitrogen San Diego, Calif.) resultando en el
plsmido pAR1902, y como vector, bacterias E. coli cepa INVF' (TA cloning kit;
Invitrogen). El fragmento KpnI-XhoI del plsmido pAR1902 que contena el gen msp-5,
fue purificado utilizando el kit GeneClean ( Bio 101, La Jolla, Calif.), y ligado
al plsmido pTrcHis (Xpress system; Invitrogen), resultando as, en el plsmido
pAR1903, el cual estaba contenido dentro de bacterias E. coli cepa JM 109
(Promega, Madison, Wis.).
Durante el proceso de clonacin, la MSP-5 adquiere en su extremo N-terminal,
6 molculas de histidina contnuas (cola poli his). Estas le confieren a la protena gran
afinidad por el nquel de la resina Invitrogen Pro-Bond , siendo as retenida en la
columna del sistema cromatogrfico IMAC (Inmobilizate Metal Affinity
Chromatography) del X press System Protein Purification (Invitrogen Corporation,
San Diego, CA 92121); y posteriormente eluda en forma pura.
Purificacin de la MSP-5 recombinante de A. marginale
Una nica colonia de la cepa de las bacterias recombinantes que contenan el
plsmido pAR1903, se cultiv a 37 C durante una noche en 50 mL de medio LB (Luria-
Bertani) conteniendo 50 g/mL de ampicilina (Research Organic, cat. N1419A).
Posteriormente y conservando el volmen de 50 mL, el cultivo se diluy hasta que
a una longitud de onda () de 600 nm, se obtuvo una densidad ptica (D.O.) de 0,1.
Se cultiv por 2 horas a 37 C en agitacin. Despus se le aadi isopropil--D-
tiogalactopiranoside (IPTG) (Sigma , cat. N I-5502) hasta obtener una concentracin
final de 1 mM, y se mantuvo por 6 horas ms bajo las mismas condiciones, a fin de que
las E. coli sobre-expresaran la MSP-5. Una vez obtenido el cultivo enriquecido en
MSP-5, se centrifug a 2.737 x g por 5 min. en la centrifuga JOUAN modelo MR 22i
con el rotor AM100.13. El sedimento se resuspendi en 10 mL de buffer lisis de
guanidina pH 7,8, agitndolo lentamente por 10 min. a temperatura ambiente, para
asegurar la lisis celular. Se sonic con tres pulsos de 5 seg. a 50 % de poder con un
sonicador VirSonic 50, para romper el ADN y el ARN. Se removieron los detritos
insolubles por centrifugacin a 2.737 x g durante 15 min., y se transfiri el sobrenadante
a otro tubo para ser almacenado a -20 C hasta su uso.
Se prepar la columna cromatogrfica IMAC segn las instrucciones del fabricante, y
se equilibr con buffer lisis de guanidina (Hidroclorido de guanidina 6M (Sigma , cat.
N G-3272); Na2HPO4 200 mM y NaH2PO4 200 mM, con NaCl 500 mM) pH 7,8
a 37 C. A la columna ya preequilibrada, se le agreg 5 mL de lisado, y se agit
suavemente por 10 min. para permitir que la protena recombinante quedar totalmente
adherida a la resina. Se centrifug a 800 x g por 2 min., y cuidadosamente se aspir el
sobrenadante. Se repiti el proceso con una segunda alcuota de 5 mL del lisado de
bacterias, y luego se procedi al lavado y elusin de la columna bajo condiciones
desnaturalizantes. Para sto se lav la columna tres veces con 4 mL de buffer de unin
(Urea (Sigma , cat. N U-1250) 8M; Na2HPO4 200 mM y NaH2PO4 200 mM con NaCl
500 mM) pH 7,8, se agit cuidadosamente por 2 min., y se centrifug a 800 x g por
2 min. para separar la resina del sobrenadante. De igual forma que en el caso anterior, se
realizaron tres lavados consecutivos con 4 mL de buffer de lavado desnaturalizante
(BLD) (Urea 8M; Na2HPO4 200 mM y NaH2PO4 200 mM con NaCl 500 mM) pH 6.0;
seguidos de tres lavados con 4 mL de BLD pH 5,3. La columna se sostuvo a un soporte
universal, y se eluy la protena agregando 5 mL de buffer de elusin desnaturalizante
(Urea 8M; Na2HPO4 200 mM y NaH2PO4 200 mM con NaCl 500 mM) pH 4,0. De esta
elusin se colectaron fracciones de 1 mL, y se determin su D.O. a 280 nm.
Las fracciones que contenan mayor absorbancia fueron reunidas y dializadas con
agua bidestilada durante 48 h a 4 C utilizando una membrana de dilisis (Sigma ,
cat. N 250-7U), con la finalidad de remover la rea y las sales. La concentracin
de protenas de la solucin dializada se determin mediante el mtodo
modificado de Lowry.
Para la utilizacin de la MSP-5 como antgeno en los ensayos de blastognesis, se
esteriliz por ultrafiltracin con filtros millipore de 0.22 m, y a partir del valor inicial
de la concentracin de protenas totales se realizaron diluciones de: 20, 15, 10, 7,5, 5,
3,75, 1,88, y 1 g/mL en RPMI-suplementado. Se hicieron alcuotas de stas en viales,
para ser almacenadas a 80 C hasta su uso. Para su utilizacin en la determinacin de la
cintica de los isotipos de anticuerpos IgM, IgG1 e IgG2 especficos producidos en
respuesta primaria y en respuesta secundaria en contra de A. marginale, se diluy en
H2O con 0,1 % de SDS, se sonic con un pulso de 3 seg. a 100 % de poder, y se
almacen a 20 C hasta su uso.
Esquema de inmunizacin
Los toretes 805, 808 y 812 fueron inoculados subcutneamente 4 veces cada
15 das, con 100 g de protenas totales de: cuerpos iniciales (IB), Antgeno soluble
(Ag.Sol.), y MSP-5, respectivamente. Los tres antgenos fueron diluidos en 1 mL de
PBS que se mezcl con 1 mL de adyuvante incompleto de Freund (FIA) (Difco
Laboratories, cat. N 0638-59). El torete 815 se utiliz como control, y fue inoculado
bajo un esquema similar de inmunizacin, pero solamente con PBS y FIA.
Toma y anlisis de las muestras de sangre
La sangre perifrica se obtena semanalmente por puncin yugular, utilizando tubos
al vaco de 4 mL con EDTA y de 10 mL sin anticoagulante (Vacutainer Becton
Dickinson, cat. N 366452 y N 6430, respectivamente). En el primer caso para
determinacin de: parasitemia, hematocrito, contaje de leucocitos totales, contaje
diferencial de leucocitos; y en el segundo caso, para la obtencin de suero. Para los
experimentos de blastognesis y de fenotipaje por citometra de flujo, se obtenan 60 mL
de sangre perifrica por puncin yugular, con una jeringa (Weplast) que contena 1 mL
de solucin anticoagulante de cido ctrico, citrato de sodio y dextrosa (ACD) (cido
ctrico hidratado (C6H8O7. H2O) al 0,73 % (p/v) (Riedel de Han, cat. N 33114); citrato
de sodio hidratado (C6H5Na3O7. 2H2O) al 2,2 % (p/v) (Riedel de Han, cat. N 32320);
dextrosa al 2,45 % (p/v) (Fisher Scientific Company, cat. N D-16)) concentrada
10 veces, y esterilizada por filtracin.
Sueros de respuesta inmune primaria
Los sueros con los que se evalu la respuesta inmune primaria, pertenecen a la
seroteca del Grupo de Bioqumica e Inmunologa de Hemoparsitos, de la Universidad
Simn Bolivar. Estos fueron obtenidos de seis becerros de la raza Holstein de 4 a
7 meses de edad, negativos al momento de la infeccin a anaplasmosis y otras
enfermedades endmicas tropicales, los cuales recibieron un inculo de 2,6 mL de una
suspensin de eritrocitos infectados con A. marginale (aislado Zulia 1990 A).
La concentracin de la suspensin de eritrocitos era del 50 % (v/v) en medio de cultivo
RPMI 1640 suplementado con DMSO 6M, y con una parasitemia del 10 %. Los sueros
fueron obtenidos semanalmente durante 28 das antes y 56 das despus, de la infeccin
experimental (Caballero et al., 1995; Afonzo et al., 1996).
Contaje diferencial y total de leucocitos de sangre perifrica
El contaje diferencial de leucocitos se realiz semanalmente sobre frotis teidos con
May-Grnwalds eosin methylenblau (Sigma , cat. N M-6901) - Giemsa (Sigma , cat.
N G-4507). Se determin el porcentaje de: linfocitos, monocitos, neutrfilos,
eosinfilos, y basfilos, sobre el contaje de 100 clulas. La determinacin de leucocitos
totales se realiz tambin semanalmente segn el mtodo convencional de contaje en
cmara (Hyun et al., 1975). Consisti en diluir 100L de sangre en 400L de solucin
de Turk (violeta de genciana (Carlo Erba, cat N 491502) al 0,01 % (p/v) diluida en
cido actico glacial (Riedel de Han, cat. N 33209) al 2 % (v/v)). Se contaron las
clulas utilizando el hemocitmetro y el microscopio Zeiss modelo Standard Lab 16.
Aislamiento de clulas mononucleares para ensayos de blastognesis y fenotipaje
Las clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSP) se aislaron semanalmente y
bajo condiciones de esterilidad, por gradiente de densidad sobre un colchn de Ficoll-
Hypaque (Histopaque, (Sigma , cat. N 1077-1)) d=1,077 g/mL, de acuerdo al mtodo
de Boyum (1968). Para sto se recolectaban 30 mL de sangre perifrica en ACD estril,
se completaban hasta 50 mL con PBS conteniendo 20 % de ACD, y se centrifugaban a
800 x g sin freno por 30 min. a temperatura ambiente, en una centrifuga International
modelo IECNH-SII. La capa blanca de clulas o "buffy coat" se succionaba (aprox.
5 mL), se transfera a un tubo de centrifuga de 50 mL, y se completaba hasta 30 mL con
PBS-ACD. Mediante el uso de una pipeta Pasteur se dispensaban 15 mL de Histopaque
en el fondo del tubo, y se centrifugaba por 45 min., bajo las mismas condiciones
anteriores. Se colectaban las clulas de la interfase, y se resuspendan hasta 45 mL con
PBS-ACD, para nuevamente centrifugar por 10 minutos. El sobrenadante era descartado.
Los eritrocitos contaminantes eran lisados agregando al sedimento 1 mL de agua
destilada estril, seguido por 45 mL de PBS-ACD, y se centrifugaba luego por
10 minutos. El sedimento blanco se lavaba 2 veces con 50 mL de PBS ACD, y se
resuspenda en aproximadamente 1,5 mL de RPMI-suplementado. Se determinaba la
viabilidad celular con el colorante de exclusin vital Trypan blue (Sigma , cat.
N T6146) al 0,2 % (p/v), y se preparaba la suspensin de CMSP a una concentracin de
2 x 106 cls./mL de medio.
Ensayo de proliferacin de linfocitos
 Los ensayos de blastognesis se realizaron semanalmente sobre placas de
microcultivo de 96 pozos (Corning, cat. N 25850), siguiendo el procedimiento descrito
por Muscoplat et al. (1974). Se colocaron en cada pozo de la placa, 2 x 10 5clulas
contenidas en 100 L de RPMI-suplementado junto con: 100 L de RPMI-suplementado
(control negativo); 100 L de Concanavalina A (ConA) (Pharmacia Fine Chemicals, cat.
N 17-0450-01) a 1,25 g/mL (concentracin ptima determinada en ensayos previos)
(control positivo); y cantidades diferentes de cada uno de los antgenos, disueltas en 100
L de RPMI-suplementado. Cada uno de los ensayos se realiz por triplicado. Las
clulas se incubaron a 37 C en una atmsfera de aire saturada de humedad con 5 % de
CO2. A los 6 das de cultivo (tiempo establecido en ensayos previos) se le aada a cada
pozo de la placa, 0,25 Ci de [methyl 3H] Timidina (Amersham, cat. N TRK 300)
(Act. Esp. 25 Ci/mmol) diluda en 10 L de RPMI-suplementado, y se incubaban en
iguales condiciones. A las 18 horas de pulso radioactivo, las clulas se filtraban sobre
discos de fibra de vidrio (Whatman 934 AH) con un cosechador PHD (Cell Harvester
Cambridge Technology,Inc.) modelo 200 A. Los filtros se transferan a miniviales, y se
les aadan 2 mL de "cocktail" de centelleo (LKB, OptiPhase-Hi Safe II). La
radioactividad se cont en un espectrmetro de centelleo (LKB, modelo 1209 Rackbeta).
Los resultados se expresaron en cuentas por minutos (cpm).
Preparacin de las clulas mononucleares para citometra de flujo
La identificacin de las subpoblaciones linfocitarias y leucocitarias se realizaba
semanalmente por inmunofluorometra de flujo. La especificidad e isotipo de los
anticuerpos monoclonales utilizados, aparecen descritas en la Tabla I. Los anticuerpos
monoclonales fueron donados gentilmente por el Dr. William C. Davis de WSU
Monoclonal Antibody Center of Veterinary Microbiology and Pathology, Washington
State University, de Pullman, en los Estados Unidos de Norteamrica.
Todo el proceso de tincin se realiz a 4 C. Sobre una placa de microtitulacin de
96 pozos con fondo en "U" (Falcon 3910, Becton Dickinson), se colocaban 50 L de
cada uno de los anticuerpos monoclonales diludos a la concentracin ptima de
16 g/mL en buffer I (PBS suplementado con: 10% (v/v) de ACD; 15 mM azida de
sodio (NaN3) (Riedel de Han cat. N 13412); 10 mM EDTA; 5 g/mL de rojo fenol
(Sigma , cat. N P-4633); y, 10% (v/v) de suero de cabra). Seguidamente, a cada pozo

Tabla I. Anticuerpos monoclonales utilizados en el fenotipaje celular

Anticuerpos
Antgeno Isotipo Clulas
monoclonales

BAQ95A BoCD2+ IgG1 Linfocitos

GC50A1 BoCD4+ IgM Linfocitos T cooperadores

CACT80C BoCD8+ IgG1 Linfocitos T citotxicos

CACTB81A TCR1-N7 IgG1 Linfocitos

BIG73A IgM IgG1 Linfocitos B

DH59B GM1 IgG1 Granulocitos, monocitos

se aadan 50 L de la preparacin celular (107-108 cls./mL), lo cual se traduce en,
aproximadamente unas 105-106 cls./pozo; a continuacin, se incubaban por 30 min..
Se lavaban las clulas tres veces siguiendo de manera consecutiva, el siguiente
procedimiento: se centrifugaba la placa por 3 min. a 900 x g y 4C en la centrfuga
refrigerada Sorvall modelo RT6000B; se remova el sobrenadante rpida y de una sla
vez volteando la placa contra el lavadero, y se agitaba brevemente en el vibrador
Sybron-thermolyne de plataforma, hasta resuspender el sedimento. A cada pozo y con la
pipeta multicanal, se aadan 200 L de buffer I. Despus del tercer lavado, las clulas
se resuspendan en 100 L del conjugado (anticuerpos polivalentes anti
inmunoglobulinas de ratn obtenidos en cabra acoplados a FITC) ( Sigma, cat.
N F-1010) diluido 1:100 en buffer II (igual al buffer I pero sin suero de cabra). Las
clulas se incubaban por 30 min. y en oscuridad, y se lavaban como se describi
anteriormente. Por ltimo, se resuspendan en 100 L de formaldehido (Merck, cat.
N 4003) al 2% (p/v) en PBS. La placa se envolva con papel parafilm para evitar la
evaporacin, y se guardaba a 4 C en la oscuridad. Al da siguiente el contenido de cada
pozo se colocaba en tubos de 12 x 75 mm con tapa (Falcon Becton Dickinson, cat.
N 2063), y se les aada aproximadamente 200 L de PBS. Se guardaban a 4 C hasta
el conteo. La proporcin de clulas identificadas por los diferentes anticuerpos
monoclonales, se determinaba por citometra de flujo. Controles de autofluorescencia
(clulas no tratadas con el anticuerpo primario, ni con el conjugado) y control de isotipo
(clulas tratadas con un anticuerpo monoclonal primario de especificidad no relacionada,
ms el conjugado) fueron incluidos en el ensayo.
Citometra de flujo
 Para cuantificar las subpoblaciones de linfocitos y monocitos se utilizaba un
citmetro de flujo Coulter Epics Elite ESP, conectado a un PC Pentium 90MHz con
8 Mb de memoria RAM. Los datos de 5000 eventos clulas eran adquiridos y
analizados usando el software Elite Coulter. El citmetro de flujo se encuentra en el
Instituto de Inmunologa de la Facultad de Medicina de la Universidad Central de
Venezuela, en Caracas, Dtto. Federal.
Cinticas de los isotipos de anticuerpos especficos producidos en contra de la
MSP5
Los sueros de los animales 805, 808, 812 y 815 como se dijo anteriormente, fueron
colectados cada semana durante toda la fase experimental del proyecto, antes y despus
de cada reto antignico. Las cinticas de los isotipos de anticuerpos especficos
producidos durante retos primarios y secundarios en contra de A. marginale, fueron
evaluadas mediante una modificacin de la tcnica ELISA descrita por
Reyna-Bello et al. (1998). Brevemente: 3 placas para ELISA de 96 pozos (Dynatech
Immulon 2) (una para cada isotipo de anticuerpo) fueron sensibilizadas por adsorcin
pasiva con la MSP-5 recombinante, a una concentracin de 2 g/mL (concentracin
ptima determinada en ensayos previos) (100L/pozo) en buffer carbonato (NaHCO3
(Riedel de Han, cat. N 31437) y Na 2CO3 (AnalaR , cat. N 10240)) 0,05 M pH 9,6.
Seguidamente se incub toda la noche a 4 C en cmara hmeda. Los pozos fueron
lavados 6 veces con solucin de NaCl 150 mM conteniendo 0,1 % de Tween 20
(Mallinckrodt Chemical OR , cat. N H285-01), utilizando un lavador de placas
automtico Wallac 1296-024 Delfia PlateWash. Los sitios sin cubrir por la MSP-5
fueron bloqueados con leche descremada comercial al 5 % disuelta en PBS 0,02 M
conteniendo NaCl 150 mM pH 7,2 y de (200 L/pozo). Las placas se colocaron en
cmara hmeda a 37 oC por 1 hora, en una incubadora Thelco modelo 6DM.
Inmediatamente despus del proceso de lavado en iguales condiciones que las antes
descritas, se agregaron 100 L/pozo de las muestras de los sueros de cada
animal/semana, diluidas 1:200 (dilucin ptima determinada en ensayos previos) en PBS
conteniendo 0,1 % de Tween 20 (PBS-T). Nuevamente se incub en las mismas
condiciones por 1h, y luego se repiti el proceso de lavado de las placas. Se agregaron
100 L/pozo en cada placa de anticuerpos monoclonales: anti-IgM bovino
(WSU Monoclonal Antibody Center, Washington, U.S.A., N GC50A1) diluido 1:400
(dilucin ptima determinada en ensayos previos) en PBS-T para la placa N 1; anti-
IgG1 bovino (Serotec, cat. N MCA627) diluido 1:100 (dilucin ptima determinada en
ensayos previos) en PBS-T para la placa N 2; y, anti-IgG2 bovino (Serotec, cat.
N MCA626), diluido 1:100 (dilucin ptima determinada en ensayos previos) en
PBS-T para la placa N 3. Se incub, y lav de igual forma que en los pasos anteriores.
Se agreg a cada placa el anticuerpo polivalente anti-Ig de ratn conjugado a peroxidasa
(Sigma ImmunoChemicals, cat. N A-0412) (100 L/pozo) diluido 1:1.500 (dilucin
ptima determinada en ensayos previos) en PBS-T. Una vez ms se incub, y se lav.
Por ltimo, en cada pozo de las placas se colocaron 100 L del sustrato para la
peroxidasa, constituido por buffer citrato 0,1 M pH 4 (cido ctrico hidratado 0,1 M;
citrato de sodio-2-hidratado 0,1M) conteniendo perxido de hidrgeno comercial al
0,0005 % y 2,2- azino-bis (cido 3-etilbenz-tiazolina-6-sulfnico) (ABTS) (Sigma , cat.
N A-1888) al 0,1 %. Las placas se incubaron por 45 min. a temperatura ambiente en
oscuridad y en agitacin, para luego hacer las lecturas de D.O. a una de 405 nm,
utilizando un lector de ELISA BIORAD modelo 3550.
Es necesario mencionar que, se realiz un blanco por triplicado en cada placa,
conformado por: MSP-5 (2 g/mL) (100L/pozo) ms bloqueante (5 % de leche
descremada comercial en PBS 0,02 M con NaCl 150 mM pH 7,2 ) (200 L/pozo) ms
PBS-T (100 L/pozo) ms conjugado (anticuerpo polivalente anti-Ig de ratn conjugado
a peroxidasa diluido 1:1.500 en PBS-T) (100 L/pozo) ms ABTS (100 L/pozo
del sustrato para la peroxidasa). El promedio de sus valores de D.O. fue restado
a cada uno de los obtenidos en los pozos experimentales, con el fin de restar la
absorbancia inespecfica.
Durante el proceso de estandarizacin de la tcnica de ELISA, se realizaron ensayos
previos a fin de establecer: 1. Las concentraciones ptimas del antgeno, de los sueros,
de los anticuerpos monoclonales y del conjugado y, 2. Los controles, para as poder
determinar con exactitud, la reaccin especfica del suero con el antgeno, y de los
anticuerpos monoclonales anti-IgG1, IgG2 e IgM con los sueros.
Los controles establecidos por duplicado fueron: 1. control del antgeno y del sistema
[MSP-5 + bloqueante + suero bovino positivo y negativo diluido 1:100 +
inmunoglobulinas de cabra anti-IgG bovino conjugado a peroxidasa (Jackson
Immunoresearch Laboratories, cat. N 101035003) diluidos 1:10.000 + ABTS];
2. control del anticuerpo monoclonal [suero bovino como antgeno diluido 1:100
+ bloqueante + anticuerpo monoclonal P801H22A5 (donado gentilmente por el
Dr. Reyna-Bello) + anticuerpo polivalente anti-Ig de ratn conjugado a peroxidasa
(Sigma ) + ABTS]; 3. control del conjugado [anticuerpo monoclonal P801H22A5 como
antgeno + bloqueante + anticuerpo polivalente anti-Ig de ratn conjugado a peroxidasa
+ ABTS]; 4. control de la especificidad del conjugado [suero bovino como antgeno
diluido 1:100 + bloqueante + anticuerpo polivalente anti-Ig de ratn conjugado a
peroxidasa + ABTS]; 5. control de la reaccin inespecfica del bloqueo [MSP-5
+ bloqueante + anticuerpo monoclonal + anticuerpo polivalente anti-Ig de ratn
conjugado a peroxidasa + ABTS].
Adems se realizaron en cada placa de ELISA y por duplicado, controles con tres
sueros positivos de respuesta primaria (pertenecientes al Grupo de Bioqumica e
Inmunologa de Hemoparsitos, de la U.S.B.) y uno negativo (de origen francs, donado
gentilmente por el Dr. Reyna-Bello).
 RESULTADOS

Observaciones clnicas y hematolgicas

Los animales desde el punto de vista clnico, no mostraron cambios significativos a
todo lo largo de la fase experimental, en su: temperatura corporal (fluctuaciones entre
38 y 39,8 C), frecuencia respiratoria (entre 25-60 P/min) y cardaca (entre
60-95 P/min), as como, en sus movimientos ruminales (2 mov/ min).
Las variaciones en las concentraciones de leucocitos totales y de las poblaciones de
linfocitos, neutrfilos y eosinfilos de sangre perifrica de los toretes 805, 808 y 812,
durante y despus de las inoculaciones con: IB, Ag.Sol. y MSP-5, respectivamente, se
muestran en la Figura 1. Las variaciones de estas poblaciones leucocitarias del torete
815 (control) inoculado bajo un esquema similar pero slo con el FIA, tambin se
muestran en la Figura 1.
En el torete 805 (estimulado antignicamente 4 veces con IB) la concentracin de
leucocitos totales se increment en forma contnua durante la fase experimental, y a
expensas de la poblacin de linfocitos, que tambin aument paulativamente.
Las poblaciones de leucocitos totales y linfocitos de los toretes 808 (estimulado
antignicamente 4 veces con Ag.Sol.) y 812 (estimulado antignicamente 4 veces con
MSP-5), fluctuaron entre los valores normales reportados de 4,0-12,0 x 106 clulas/mL y
2,5-7,5 x 106 clulas/mL, respectivamente (The Merck Veterinary Manual, 1986),
durante los das de post-inoculacin. El torete 815 (control) mostr durante los primeros
30 das, desde el primer inculo, un incremento sostenido en la poblacin de linfocitos y
una disminucin constante en la poblacin de neutrfilos. La poblacin de leucocitos
totales fluctu entre valores normales, durante este perodo. Las concentraciones de las
subpoblaciones de linfocitos y neutrfilos y la de la poblacin total de leucocitos,
mostraron una marcada disminucin entre los 30 y 49 das post-inoculacin. El animal
no present sntomas clnicos de enfermedad alguna durante este perodo.
 2 2

0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70

Das post-inoculacin Das post-inoculacin

Figura 1

Figura 1. Variacin de las concentraciones de leucocitos totales (-), linfocitos (-),

neutrfilos (-) y eosinfilos (-), de sangre perifrica, durante y despus de repetidas
inoculaciones () de los toretes con 100 g de protenas de: IB (torete 805), Ag.Sol.
(torete 808), MSP-5 (torete 812), disueltas en 1 mL de PBS con 1 mL de adyuvante
incompleto de Freund. El torete 815 recibi nicamente PBS con adyuvante incompleto
de Freund.
 El hematocrito de cada uno de los animales, fluctu aproximadamente entre un 20
y un 35 % con respecto a sus valores iniciales. La parasitemia en cada uno de los toretes
se mantuvo en valores menores al 1 %, durante toda la fase experimental
Establecimiento de las condiciones ptimas del ensayo de proliferacin celular
Para determinar el nivel de proliferacin celular in vitro de los linfocitos T de
memoria antgeno-especficos de sangre perifrica de cada torete estimulado
antignicamente in vivo, fue necesario previamente estandarizar la tcnica de
inmunoproliferacin in vitro de CMSP. Se utiliz como control positivo de proliferacin
celular inespecfica, clulas estimuladas con Con A.
En la Figura 2A se muestra el efecto de la concentracin de Con A sobre la
proliferacin celular, expresada en cuentas por minutos (cpm). Se determin que la
concentracin de 1,25 g/mL de Con A, era la ptima para obtener la mxima
proliferacin celular in vitro.
La Figura 2B muestra el efecto del tiempo de incubacin del cultivo y del tiempo de
pulso radioactivo, sobre la proliferacin celular in vitro, a una concentracin ptima de
Con A. Cuando el pulso radioactivo era de 4 horas, las clulas cultivadas por 48 horas,
mostraron una proliferacin celular superior a las cultivadas por 72 horas. Sin embargo,
cuando el pulso radiactivo fue de 18 horas, no se observaron diferencias entre las clulas
cultivadas a 48 horas y las cultivadas a las 72 horas. Por razones prcticas de trabajo, se
escogi como tiempo de cultivo, 72 horas, en vista de que en este tiempo, la
proliferacin celular continuaba siendo elevada. Como tiempo ptimo de pulso
radioactivo se consider el de 18 horas, por las mismas razones antes mencionadas.
La cantidad ptima de methyl- 3H timidina/pozo para ser utilizada en los ensayos de
proliferacin celular fue estimada en 0,25 Ci (actividad especfica de 25 Ci/mmol)
diluida en 10 L de RPMI- suplementado.
El "cocktail" de inhibidores proteolticos que se utiliz en la preparacin del Ag.Sol.,
tiene efecto txico sobre los linfocitos T como se muestra en la Figura 3. El "cocktail"
inhibe dramticamente la respuesta proliferativa de las CMSP a esas concentraciones.
 Horas de Cultivo

Figura 2. Efecto de la concentracin del mitgeno (A) y del tiempo de incubacin del
cultivo (B), sobre la proliferacin in vitro de CMSP estimuladas con Con A.
En A, 2 x 105 clulas resupendidas en RPMI-suplementado, fueron colocadas en placas
de cultivo de 96 pozos con diferentes concentraciones de ConA, e incubadas por
48 horas a 37 C y 5 % de CO 2. Las clulas fueron cosechadas despus de 18 horas de
pulso con [methyl- 3H] timidina. En B, 2 x 105 clulas resupendidas en RPMI-
suplementado, fueron incubadas con Con A a 1,25 g/mL por 48 y 72 horas bajo las
mismas condiciones, y fueron cosechadas despus de un pulso de 18 horas con
[methyl-3H] timidina. La proliferacin celular se expresa en cuenta por minutos (cpm).
 10

- + Con A (1,25 g/mL)

Control Control
RPMI 1640 Con A + 2 L Fenantrolina
(1,25g/ mL) PMSF y EDTA

Figura 3. Efecto del "cocktail" de inhibidores proteolticos sobre la respuesta

proliferativa de CMSP estimuladas con ConA. 2 x 10 5 clulas resupendidas en RPMI-
suplementado, fueron colocadas en placas de cultivo de 96 pozos con Con A a
1,25 g/mL ms 2 L del "cocktail" de inhibidores proteolticos (fenilmetil sulfonil
fluoruro (PMSF) 1mM; fenantrolina 2 mM y cido etilendiaminotetractico (EDTA)
2mM), e incubadas por 72 horas a 37 C y 5 % de CO 2. Las clulas fueron cosechadas
despus de18 horas de pulso con 0,25 Ci de[methyl-3H] timidina en 10 L de RPMI-
suplementado. La proliferacin celular se expresa en cuenta por minutos (cpm).
 El efecto que tienen los IB sobre la actividad proliferativa in vitro de CMSP a Con
A, a 3 y 6 das de cultivo, se observa en la Figura 4. A los 3 das de cultivo, la actividad
proliferativa inducida por la Con A, no es modificada por la presencia de IB en el medio.
Sin embargo, a los 6 das, la respuesta de las clulas a Con A, se vi alterada a los 40 y
80 g/mL de cuerpos iniciales.
La cantidad de clulas por pozos y el tiempo de cultivo, son factores importantes en
la optimizacin del ensayo de proliferacin celular antgeno-especfico. Para determinar
los valores adecuados de cada una de estas variables, se utilizaron linfocitos T en fase de
expansin y proliferacin del animal 805 despus de la 4ta inoculacin, reestimulados
in vitro con 20 g/mL de IB, incubados por 6 das en condiciones ptimas de
temperatura y CO2. En la Figura 5A se muestra, cmo en condiciones ptimas para el
cultivo de clulas in vitro, una cantidad entre 100.000 y 400.000 cls./pozo, resulta
adecuada para la reestimulacin de linfocitos T de memoria in vitro. Se escogi para los
subsiguientes ensayos de proliferacin y reestimulacin de linfocitos T de memoria
in vitro, la cantidad de 2x 105 CMSP/pozo.
De igual forma, en la Figura 5B se observa, el efecto del tiempo de cultivo in vitro
sobre la proliferacin de linfocitos T de memoria especficos, en contra de A. marginale.
El tiempo de 7 das de cultivo result ptimo para la reestimulacin y proliferacin de
linfocitos T de memoria in vitro. Sin embargo, por razones prcticas se utilizaron 6 das
como tiempo de cultivo.
Especificidad de la respuesta inmunoproliferativa
En la Figura 6 se observa que los linfocitos T de memoria del torete 805 inician su
actividad linfoproliferativa IB-especfica dosis-dependiente, a partir de los 28 das de la
fase experimental, despus de haber sido re-estimulados dos veces, y persiste a los 35 y
49 das de la fase experimental, despus de, tres y cuatro reestmulos antignicos,
respectivamente. Se observ la mxima actividad linfoproliferativa, a los 35 das. La
dosis ptima de estimulacin antignica in vitro se observ entre los 10 y 20 g/mL de
IB. Una vez amplificada y expandida en sangre perifrica la poblacin de linfocitos T de
 c
40

20

Control
- Control+ 20 40 80
memoria mediante reestmulos
RPMI 1640 sucesivos
Con A con IB, son suficientes 5 g/mL de IB, para
Con A (1,25 g / mL)
(1,25 g / mL)
+ IB (g / mL)
reestimularlos in vitro.

Figura 4. Efecto de IB sobre la actividad proliferativa de CMSP, estimuladas con

Con A, a 3 y 6 das de cultivo. 2 x 10 5 clulas resupendidas en RPMI-suplementado
fueron colocadas en placas de cultivo de 96 pozos con Con A a 1,25 g/mL ms
diferentes concentraciones de IB, e incubadas por diferentes tiempos a 37 C y 5 % de
CO2.. Las clulas fueron cosechadas despus de 18 horas de pulso con 0,25 Ci de
[methyl-3H] timidina en 10 L de RPMI-suplementado. La proliferacin celular se
expresa en cuenta por minutos (cpm).
Figura 5. Efecto de la cantidad de clulas mononucleares (A) y del tiempo de
cultivo (B) sobre la proliferacin de linfocitos T de memoria especficos contra
A. marginale. En A, diferentes cantidades de CMSP provenientes del animal 805 a
los 15 das (63 das desde la primera inoculacin) despus de la 4 ta inoculacin con
IB, fueron re-estimuladas in vitro con 20 g/mL de IB, e incubadas por 6 das a
37 C y 5 % de CO 2.. En B, 2 x 105 clulas fueron colocadas en placas de cultivo de
96 pozos con 20 ug/mL de IB, e incubadas por 4, 7, 9 das a 37 C y 5 % de CO2..
En ambos experimentos las clulas fueron cosechadas despus de 18 horas de pulso
con de [methyl-3H] timidina. La proliferacin celular se expresa en cuenta por
minutos (cpm).
Figura 6. Actividad linfoproliferativa IB-especfica in vitro de los linfocitos T de
memoria del torete 805 inoculado varias veces con IB, y del torete 815 (control)
inoculado mltiples veces, pero slo con el adyuvante ms PBS. 2 x 10 5 clulas
mononucleares de sangre perifrica fueron colocadas en placas de cultivo de 96 pozos,
estimuladas in vitro con diferentes concentraciones de IB, e incubadas por 6 das a
37 C y 5% de CO2.. Un control positivo estimulado con Con A a 1,25 g/mL, fue
introducido en el ensayo. Las clulas fueron cosechadas despus de 18 horas de pulso
con 0,25 uCi de [methyl-3H] timidina en 10 L de RPMI-suplementado.
La proliferacin celular se expresa en cuenta por minutos (cpm).
 La concentracin de IB utilizada en los ensayos posteriores de proliferacin, para
la reestimulacin in vitro de linfocitos T de memoria especficos, fue la de 20 g/mL. El
torete 815 (control) mostr una aparente aunque muy ligera actividad proliferativa IB-
especfica in vitro de sus linfocitos de sangre perifrica, a partir de los 21 das post-
inoculacin. Probablemente debido, a la recrudescencia de la rickettsemia en su
condicin de crnicamente infectado. Las CMSP de ambos toretes
(el 805 y el 815) respondieron a la proliferacin celular inducida con Con A, lo cual a su
vez tambin demuestra que, las clulas, estaban fisiolgicamente activas.
La figura 7 muestra el fenotipo de subpoblaciones leucocitarias de CMSP
que prolifera in vitro al estimular con IB. Las clulas corresponden al animal 805
despus de la 4ta inoculacin con IB. La subpoblacin proliferante presenta el
fenotipo de linfocitos .
La Figura 8 muestra la actividad proliferativa in vitro de los linfocitos T de
sangre perifrica, del torete 805, en contra de los antgenos IB, Ag.Sol. y MSP-5,
inmediatamente despus de la tercera inoculacin. Los linfocitos T responden
a los antgenos IB y Ag.Sol., en un patrn dosis dependiente, pero no responden
contra la MSP-5.
Las actividades linfoproliferativas especficas contra el Ag.Sol. y contra la MSP-5
in vitro de los linfocitos T de memoria de los toretes 808 y 812, se muestran en las
Figuras 9 y 10, respectivamente. En ninguno de los dos toretes se observ induccin de
una respuesta inmunocelular. El torete 815 mostr nuevamente a los 21 das, una
pequea respuesta inmunoproliferativa in vitro, al Ag. Sol y a la MSP-5.
Variacin de los porcentajes de diferentes subpoblaciones leucocitarias de sangre
perifrica
Los porcentajes de subpoblaciones leucocitarias de CMSP, durante y despus de
repetidas inoculaciones antignicas de los toretes 805, 808, 812 y 815, inoculados con:
IB, Ag.Sol., MSP-5 y FIA, respectivamente, se muestran en la Figura 11. Las
subpoblaciones de linfocitos T CD2, CD8 y linfocitos B, mostraron variaciones
similares entre valores normales en los cuatro toretes. La subpoblacin de linfocitos
Figura 7. Fenotipo de las subpoblaciones de leucocitarias de CMSP que prolifera
in vitro al reestmulo con IB. Las clulas corresponden al animal 805 despus de la
4ta inoculacin con IB. 1,5 x 106 clulas fueron cultivadas en placas de 24 pozos,
con 20 g/ mL de IB con RPMI 1640, por 6 das a 37 C y 5% de CO 2. Luego, las
distintas subpoblaciones fueron identificadas con anticuerpos monoclonales por
inmunofluorometra de flujo.
 20

0 5 10 15 20

gmL protena

Figura 8. Actividad proliferativa in vitro a IB, Ag.Sol. y MSP-5, de los linfocitos T de

memoria del torete 805, inoculado tres veces con IB. 2 x 10 5 CMSP fueron colocadas en
placas de cultivo de 96 pozos, estimuladas in vitro con diferentes concentraciones de IB,
Ag.Sol. y MSP-5, e incubadas por 6 das a 37 C y 5% de CO 2.. Las clulas fueron
cosechadas despus de un pulso de 18 horas con [methyl-3H] timidina. La proliferacin
celular se expresa en cuenta por minutos (cpm).
Figura 9. Actividad linfoproliferativa Ag.Sol.-especfica in vitro de los linfocitos T de
memoria del torete 808 inoculado varias veces con Ag.Sol., y del torete 815 (control)
inoculado mltiples veces, con el adyuvante ms PBS. 2 x 105 CMSP fueron colocadas
en placas de cultivo de 96 pozos, estimuladas in vitro con diferentes concentraciones de
Ag. Sol., e incubadas por 6 das a 37 C y 5% de CO 2.. Un control positivo estimulado
con Con A a 1,25 g/mL, fue introducido en el ensayo. Las clulas fueron cosechadas
despus de un pulso de 18 horas con [methyl-3H] timidina. La proliferacin celular se
expresa en cuenta por minutos (cpm).
Figura 10. Actividad linfoproliferativa MSP-5-especfica in vitro de los linfocitos T de
memoria del torete 812 inoculado varias veces con MSP-5, y del torete 815 (control)
inoculado mltiples veces, pero slo con el adyuvante ms PBS. 2 x 10 5 clulas
mononucleares de sangre perifrica fueron colocadas en placas de cultivo de 96 pozos,
estimuladas in vitro con diferentes concentraciones de MSP-5, e incubadas por 6 das a
37 C y 5% de CO 2.. Un control positivo estimulado con Con A a 1,25 g/mL, fue
introducido en el ensayo. Las clulas fueron cosechadas despus de un pulso de
18 horas con [methyl-3H] timidina. La proliferacin celular se expresa en cuenta por
minutos (cpm).
 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Das post - inoculacin

Figura 11. Variacin de los porcentajes de diferentes subpoblaciones de CMSP durante

el curso de repetidas inoculaciones. Las subpoblaciones fueron cuantificadas por
inmunocitometra de flujo, durante y despus de repetidas inoculaciones antignicas ( )
de los toretes 805 (-), 808 (-), 812 (-) y 815 (-) con: IB, Ag.Sol., MSP-5 y
FIA, respectivamente.
 CD4 fluctu entre valores del 4 al 10 %, en los toretes 808, 812 y 815 en el torete
805 mostr un fuerte ascenso entre los 42 y 56 das post-infeccin. La subpoblacin de
linfocitos en los toretes 805 y 815, mostr variaciones entre valores normales;
mientras que, en los toretes 808 y 812, se observ un significativo aumento a los 42 das.
Los monocitos mostraron marcados incrementos en los toretes 805 y 815 a los 42 y
7 das post infeccin, respectivamente en el resto de los toretes, esta subpoblacin
celular, fluctu entre valores normales.
Cinticas de los isotipos de anticuerpos durante las respuestas inmunes primaria y
secundaria
Las cinticas de la respuesta inmune primaria de los isotipos IgM, IgG1 e IgG2 se
evaluaron mediante test de ELISAs, y se muestran en la Figura 12. La respuesta del tipo
IgM se hizo detectable en los tres becerros infectados (5, 6, 7) experimentalmente, a
partir de la tercera semana de infeccin, al inicio de la fase aguda; y mostr un constante
incremento, hasta la fase final del experimento. El becerro control no infectado, no
mostr ningn cambio en la respuesta, hasta la semana 9 post-infeccin. La respuesta del
isotipo IgG1 en los tres becerros infectados, se increment significativamente, entre la
tercera y la cuarta semana post-infeccin; comenzando a declinar ligeramente, a partir de
la quinta semana. El becerro control no mostr respuesta de IgG1 especfica.
La respuesta del isotipo IgG2 del becerro nmero 7, se inicia en la semana 6 post-
infeccin, mientras que, las de los becerros 5 y 6, comienzan entre la semana 7 y 9.
El becerro control no mostr ningn cambio en las densidades pticas a 405 nm.
En la Figura 13 se muestran las cinticas de las respuestas inmunes secundarias de los
isotipos IgM, IgG1 e IgG2, contra la MSP-5, de los toretes 805, 808, 812 infectados
crnicamente y re-estimulados antignicamente con IB, Ag.-Sol y MSP-5,
respectivamente; y del torete 815, no estimulado. Los toretes 805, 808 y 812, no
desarrollaron respuestas de anticuerpos del isotipo IgM, contra MSP-5. Los valores de
los isotipos IgG1 e IgG2 de los toretes 805, 808 y 812 son en lnea general, mayores a
los obtenidos en el torete control, no estimulado.
El torete 805 reestimulado cuatro veces con IB, mostr un aparente incremento
en la produccin del isotipo IgG1 contra la MSP-5, pero a partir de la semana 8, es decir,
 0,25

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Semanas post - infeccin

Figura 12. Cinticas de los isotipos de anticuerpos especficos producidos contra la

MSP-5 recombinante, en la respuesta inmune primaria de los becerros 5, 6 y 7,
infectados experimentalmente. La respuesta se evalu mediante un test de ELISA para
la deteccin del isotipo de IgM, IgG1 e IgG2 especfico, producidos semanalmente
antes y despus de la infeccin con A. marginale. El pico de parasitemia () ocurri
entre la 3ra y 4ta semana post-infeccin. Los resultados son expresados como promedio
de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm (D.O.405 nm), entre pozos triplicados.
 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Semanas post - inoculacin

Figura 13 . Cinticas de los isotipos de anticuerpos especficos producidos en contra de

la MSP-5, en la respuesta inmune secundaria de los toretes 805, 808, 812, y 815,
infectados crnicamente con A. marginale e inoculados () mltiples veces con: IB,
Ag.Sol., MSP-5 y FIA, respectivamente. La respuesta se evalu mediante un test de
ELISA para la deteccin del isotipo IgM, IgG1 e IgG2 especfico, producidos
semanalmente antes y despus de cada inoculacin con A. marginale. Los resultados
son expresados como promedio de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm
(D.O.405 nm), entre pozos triplicados.
 despus de la cuarta inoculacin. No obstante, no se puede asegurar con exactitud,
que este torete haya desarrollado una respuesta de anticuerpo del isotipo IgG2, en contra
de la misma.
Las respuestas de los isotipos IgG1 e IgG2 contra la MSP-5 del torete 808 re-
estimulado in vivo con Ag.Sol., mostraron un comportamiento fluctuante durante las
semanas post- inoculacin.
El torete 812 reestimulado con MSP-5, present una marcada produccin
de anticuerpos de los isotipos IgG1 e IgG2, alcanzando ambos isotipos, el mximo
valor de produccin despus de la tercera inoculacin. Esto sugiere en forma
contundente, el total y especfico reconocimiento de la MSP-5 como antgeno
utilizado en las reestimulaciones in vivo o inoculaciones del torete 812, la cual a su
vez indujo una respuesta humoral secundaria, caracterizada por la produccin de
anticuerpos del tipo IgG1 e IgG2.
 DISCUSION

Marco de referencia en el cual se inscribe el presente trabajo

La inmunidad protectiva desarrollada durante la infeccin natural y la inducida por
inmunizacin con antgenos de A. marginale, son hechos bien documentados pero cuyos
mecanismos han sido poco estudiados. El conocimiento del mecanismo de inmunidad en
contra de A. marginale, se ha visto fuertemente limitado por no disponer de 1. Un
modelo experimental en animales de laboratorio; 2. Bovinos genticamente idnticos
para los estudios de transferencia adoptiva de clulas; y 3. Tcnicas de cultivo in vitro de
la rickettsia, que permitan evaluar la accin de cualquier componente del sistema
inmune sobre el ciclo intraeritroctico del parsito.
Las investigaciones realizadas hasta la fecha, se han centrado en estudiar: 1. La
cintica de produccin de anticuerpos (Murphy, Osebold y Aalund, 1966), y de algunas
citocinas como el factor inhibidor de la migracin de macrfagos (Carson, Sell y Ristic,
1977a Carson, Sell y Ristic, 1977b) y el INF- (Gale et al., 1996) 2. La evaluacin de
la funcin de las clulas inmunes en el control de la infeccin, mediante la ablasin del
bazo (Jones et al., 1968b) de la aplicacin de drogas supresoras (Kuttler y Adams,
1977; Corrier, Wagner y Adams, 1981) 3. La produccin de anticuerpos neutralizantes
(Palmer y McGuire, 1984) y opsonizantes (Cantor, Pontzer y Palmer, 1993) y, 4. La
identificacin de eptopes protectores (Palmer y McElwain, 1995). A pesar de estos
trabajos realizados, el mecanismo inmune de control de la infeccin, sigue siendo
desconocido. Los resultados sugieren fuertemente la participacin conjunta de la
inmunidad humoral y celular en el control de la infeccin.
El presente trabajo forma parte de un proyecto general cuyo objetivo global es
abordar el estudio de la inmunidad contra A. marginale desde una perspectiva diferente.
Mediante la caracterizacin de los linfocitos T efectores y de memoria, y de los
isotipos de anticuerpos especficos producidos en contra de antgenos de A marginale
durante una infeccin primaria, se busca poder inferir el tipo de respuesta inmune
inducida por la rickettsia.
La estrategia trazada para alcanzar este propsito fue la de expander in vitro mediante
estimulaciones antignicas sucesivas, las poblaciones de linfocitos T de sangre perifrica
reactivas en contra de antgenos de A. marginale, y las cuales se generaran durante la
infeccin primaria. Las estimulaciones sucesivas con antgenos de A. marginale nos
permitiran obtener lneas celulares y a partir de stas, clones especficos. El fenotipo y
especificidad de cada clon, se correlacionara con el (los) isotipo(s) de anticuerpo(s)
producido(s). La caracterizacin fenotpica de los clones y de los isotipos de anticuerpos
especficos producidos contra un antgeno, nos permitira luego, determinar el tipo de
respuesta inmune involucrada en el control de la infeccin y de los antgenos relevantes
en su induccin.
El primer paso para alcanzar el objetivo general de mi trabajo de grado, era obtener y
caracterizar lneas y clones de linfocitos T especficos contra antgenos de A. marginale.
Sin embargo, las circunstancias nos obligaron a redisear la estrategia metodolgica. La
primera situacin que se nos present fue, la imposibilidad de encontrar animales libres
de A. marginale para estudiar la inmunidad primaria, por lo que decidimos estudiar los
linfocitos T de memoria en bovinos infectados crnicamente. De all, el estudio
preliminar de la capacidad proliferativa a antgenos de A. marginale de los linfocitos T
de toretes infectados crnicamente, nos llev al segundo problema, los becerros
analizados no respondan in vitro a reestmulos antignicos. Ante esta nueva situacin,
decidimos reestimular por inmunizaciones sucesivas, a los toretes infectados
crnicamente, con el objeto de incrementar la frecuencia de linfocitos T de memoria en
sangre perifrica, y de esta manera, obtener linfocitos T de memoria in vitro.
La estrategia fue asertiva, logramos obtener una vigorosa respuesta en al menos uno
de los tres toretes, lo que nos permiti establecer las condiciones ptimas de cultivo de
linfocitos T in vitro, as como tambin, estudiar la cintica de la respuesta inmune celular
y de los isotipos de anticuerpos producidos especficamente, en contra de los antgenos
empleados de A. marginale.
Observaciones clnicas y hematolgicas
Los toretes 805, 808 y 812, an despus de haber sido inoculados cuatro veces
consecutivas con los antgenos IB, Ag.Sol. y MSP-5, respectivamente, no desarrollaron
anemia, hipertermia, ni mostraron variaciones de sus parmetros respiratorios y
cardacos, durante el experimento. Al igual que el torete 815 control, que fue inoculado
slo con el FIA. Los resultados indican que las preparaciones antignicas, eran inocuas.
Los cuatro toretes, sin embargo, desarrollaron una fuerte reaccin inflamatoria en el
lugar de las inoculaciones. Caracterizada por la formacin de granulomas de bordes bien
delimitados, de aprximadamente 3 a 5 cms de dimetro, y consistencia slida. La
formacin de estos granulomas se la atribuimos al carcter irritante del FIA. Este
adyuvante estimula una fuerte reaccin inflamatoria localizada, que induce la migracin
y secuestro de monocitos, linfocitos, clulas de Langerhans', y leucocitos, contribuyendo
as, a la hiperplasia del tejido y a la consiguiente formacin del granuloma (Vanselow,
1987). El FIA acta retardando la absorcin del antgeno y estimulando las clulas
mononucleares en el sitio de su aplicacin, en los ganglios de drenaje del antgeno, lo
cual a su vez, contribuye a potenciar la respuesta inmune (Vanselow, 1987).
No obstante, le han sido atribuidas reacciones colaterales, que han restringido su uso
(Cox y Coulter, 1997).
En los ltimos aos, han sido diseados una gran variedad de adyuvantes de
igual potencia y mayor seguridad (Cox y Coulter, 1997). Sin embargo, nosotros
decidimos ensayar con el FIA, por un lado, porque nos aseguraba la induccin de una
respuesta inmune intensa y rpida, y por el otro, debido a la imposibilidad de adquirir los
otros, que se sabe, ofrecen riesgos menores, y hasta son utilizados en vacunas para
animales domsticos.
Durante la fase aguda de la anaplasmosis bovina se ha reportado que, los animales
sufren un incremento significativo de la poblacin total de leucocitos, que regresan a
sus valores normales durante la fase de convalecencia (Ajayi, Wilson y Campbell, 1978
Afonso et al., 1996). El aumento ocurre a expensas de la poblacin de neutrfilos
(Adam, Paul y Zaman, 1971 Afonso et al., 1996). No obstante, los toretes infectados
crnicamente e inoculados con los distintos antgenos rickettsiales, mostraron un patrn
de respuesta leucocitaria, diferente. El torete 805 desarroll una fuerte linfocitosis a
partir de la tercera inoculacin con IB, que coincide con la aparicin de la respuesta
proliferativa antgeno-especfica. Por el contrario, los toretes 808 y 812, no mostraron
cambios sustanciales en los valores correspondientes a sus poblaciones leucocitarias. El
torete 815 (control) mostr unas inesperadas e inexplicables, linfopenia y neutropenia, a
partir de la tercera inoculacin con FIA. El torete en cuestin, no mostr signos
visibles de enfermedad alguna, por lo que estimamos sufri una infeccin subclnica de
algn virus bacteria. Sin embargo, no se observ la presencia de ningn otro
hemoparsito que no fuera A. marginale, en los frotis de sangre de este torete,
realizados semanalmente.
Si comparamos los cambios obtenidos en la poblacin linfocitaria del torete 805
inoculado con IB, con las de los toretes 808 y 812 estimulados antignicamente con
Ag.Sol. y MSP-5, respectivamente, podemos inferir que, el antgeno corpuscular, indujo
una expansin clonal de linfocitos especficos. Mientras que los antgenos, Ag.Sol. y
MSP-5, no modificaron la distribucin de ninguna de las subpoblaciones leucocitarias.
Esto pareciera indicar que, los IB, poseen un potencial inmunognico superior a los
contenidos en el Ag.Sol. y en la MSP-5.
Establecimiento de las condiciones ptimas del ensayo de proliferacin celular
El ensayo de proliferacin de linfocitos T in vitro es una tcnica confiable y de fcil
ejecucin que permite: 1. Evaluar el estado inmunocompetente de un animal;
2. Identificar la subpoblacin que prolifera ante un estmulo antignico especfico;
3. Determinar la subpoblacin celular y/ los factores requeridos para su activacin; y, 4.
Estudiar los eventos intracelulares que siguen a la estimulacin de los mismos
(Taffs y Sitkovsky, 1991).
La proliferacin de linfocitos especficos in vitro es influenciada por mltiples
factores, tales como: el tiempo de incubacin del cultivo en condiciones idneas de CO 2
y de humedad; la concentracin del agente estimulante (mitgeno o antgeno); la
cantidad del radioistopo marcador que se utiliza para cuantificar la proliferacin
celular; el tiempo del pulso radioactivo; la forma del fondo de la placa de cultivo; la
cantidad de clulas por pozo; el volmen del cultivo, etc. (Kristensen, Kristensen y
Lazary, 1982). En consecuencia, nuestro primer paso fue establecer las condiciones
ptimas del cultivo in vitro, a fin de obtener resultados confiables y comparables.
En los ensayos de proliferacin celular in vitro se utiliz como control positivo,
clulas estimuladas con Con A. Este control nos permiti evaluar en cada ensayo, el
estado funcional de los linfocitos. La concentracin ptima de estimulacin de este
mitgeno result ser la de 1,25 g/mL, en concordancia con los resultados obtenidos por
otros autores (Muscoplat et al., 1974).
Los tiempos ptimos de incubacin con la Con A y con las diferentes preparaciones
antignicas, fueron tambin evaluados, al igual que el tiempo de pulso ptimo con el
radioistopo. El tiempo ptimo de incubacin para Con A fue de 3 das, y para IB de
7 das. El efecto de la magnitud del pulso radioactivo fue similar con la Con A
(1,25 g/mL) y con el antgeno, los IB (20 g/mL). La concentracin ideal del
radioistopo methyl-3H timidina/pozo se estim en 0,25 Ci (segn una actividad
especfica de 25 Ci/mmol) diluida en 10 L de RPMI-suplementado. Los valores
obtenidos para cada una de estas variables, estn dentro de los reportados por otros
autores (Kristensen, Kristensen y Lazary, 1982).
Los linfocitos T de memoria IB-especficos mostraron despus de los 7 das,
descenso en la capacidad linfoproliferativa, debido probablemente a la disminucin en el
medio de algn factor nutricional, del mismo antgeno, inclusive debido, al deterioro
de la capacidad interactiva entre las clulas.
Por razones de orden prctico y para conveniencia en la logstica del trabajo, se
seleccionaron como tiempos ptimos de cultivo y de pulso radioactivo, 6 das y
18 horas, respectivamente. A estos tiempos, la magnitud de la proliferacin, era an
significativamente elevada.
Los resultados muestran que el ensayo de proliferacin celular tiene una alta
sensibilidad. El mtodo es capaz de detectar proliferacin a partir de 50 mil clulas por
pozo. Si consideramos que la proporcin estimada de clulas T reactivas en contra de un
antgeno es inferior al 1 %, entonces tenemos que, el ensayo, fue capaz de detectar por lo
menos 500 clulas proliferantes.
 Existen otros factores que se relacionan con la preparacin antignica, que pueden
interferir en el ensayo de proliferacin celular. En el caso particular del Ag.Sol., se
utiliza el "cocktail" de inhibidores proteolticos para evitar la degradacin por parte de
las proteasas, de las protenas antignicas liberadas al sobrenadante durante la
sonicacin de los eritrocitos. El "cocktail" a la concentracin utilizada para preparar el
Ag.Sol., tiene un dramtico efecto supresor sobre la respuesta proliferativa de las CMSP
a la Con A. Sin embargo, al diluir el Ag.Sol. desde la solucin madre a la solucin de
trabajo, el "cocktail" se diluye en un factor de 50 a 100 veces. En consecuencia su accin
sobre la proliferacin celular, se ve fuertemente atenuada, como se muestra en la
Figura 8, donde se observa la proliferacin celular antgeno-especfica contra el Ag.Sol..
Los IB no suprimen la capacidad proliferativa de los linfocitos T a Con A, lo cual
indica que, al menos in vitro, no tienen actividad inmunomoduladora negativa
sobre la respuesta proliferativa de estas clulas. Como ha sido demostrado para
Trypanosoma cruzi (Kiersenbaun y Sztein, 1993).
Respuesta linfoproliferativa en contra de diferentes antgenos de A. marginale
La presencia de linfocitos T reactivos contra antgenos de A. marginale ha sido
reportada previamente por varios investigadores (Buening, 1973; Carson, Kakoma y
Ristic, 1980). Ms recientemente, Gale et al. (1996) en un estudio ms sistemtico,
evaluaron la respuesta proliferativa in vitro contra IB durante el curso de una infeccin
primaria. Reportaron que los bovinos mostraban dos fuertes pero transitorios picos de
actividad proliferativa, el primero ocurra casi coincidencialmente con el pico de
parasitemia, y el segundo, 20 das despus del mismo. La respuesta en los animales
crnicamente infectados era variable entre individuos, y en el tiempo.
Nosotros evaluamos durante tres meses la respuesta proliferativa de tres toretes
infectados crnicamente con A. marginale, y no observamos respuesta proliferativa
antgeno-especfica. Las posibles causas de esta ausencia de respuesta pudieran ser
atribuidas a: 1. Un estado de tolerancia especfica inducida durante la fase aguda de la
infeccin; 2. Una baja frecuencia de linfocitos T de memoria a consecuencia de una baja
carga de antgeno, insuficiente para estimular esta importante subpoblacin celular; y,
3. A un confinamiento de los linfocitos T de memoria a algn rgano especfico
como el bazo.
Las repetidas inoculaciones del torete 805 con IB, indujeron la aparicin de linfocitos
T antgeno-especficos que reaccionaban in vitro cuando eran reestimulados nuevamente
con IB. Lo cual demostr que, el animal, no estaba inmunosuprimido especficamente, y
que los repetidos estmulos antignicos incrementaron la frecuencia de linfocitos T en
sangre perifrica. Los linfocitos T de este animal, tambin reconocieron al Ag.Sol., y
respondieron contra ste, en un patrn dependiente de la concentracin.
En un estudio semejante al nuestro, bovinos libres de A. marginale fueron
inmunizados con membranas externas de la rickettsia. Se encontr que las CMSP de
estos animales, respondan contra las protenas MSP-1, MSP-2, MSP-3 y a la rickettsia
homogenizada en un patrn dosis-dependiente, similar al obtenido por nosotros en el
torete 805 (Brown et al., 1998).
El anlisis fenotpico de la poblacin celular del animal 805 que prolifer in vitro
en forma especfica en contra de IB, mostr que corresponda a la poblacin de
linfocitos . Sin embargo, Brown et al. en el trabajo mencionado anteriormente
reportaron que, la poblacin proliferante encontrada por ellos era linfocitos T CD4. La
discrepancia entre nuestro resultado y el de los autores mencionados se debe,
probablemente, a las diferencias en los diseos experimentales entre ambos estudios,
como son: 1. El estado de infeccin crnica de nuestros animales en contraposicin a los
animales sanos utilizados por ellos 2. El uso del adyuvante incompleto de Freund contra
saponina y, 3. El uso de IB contra membranas externas, como antgenos. Estos factores
pudieran haber modificado el tipo de respuesta inmune, contra un determinado antgeno.
Estudios realizados con antgenos derivados de Mycobacterium paratuberculosis,
Babesia bovis y Fasciola heptica han demostrado que, los linfocitos T , pueden jugar
un papel bastante complejo. Experimentos en cultivos de proliferacin celular especfica
contra antgenos de M. paratuberculosis, en los cuales se han eliminado selectivamente
y/ se han reconstituido los linfocitos T , se ha demostrado que, esta subpoblacin,
inhibe la respuesta proliferativa de linfocitos CD4 al antgeno, y este efecto es a su vez
modulado, por clulas CD8 (Chiodini y Davis, 1992 Chiodini y Davis, 1993).
Los linfocitos de bovinos inmunizados con antgenos de Babesia bovis y Fasciola
heptica, tienden a proliferar in vitro bajo condiciones de ciclos de repetidas
estimulaciones antignicas y en presencia de medio condicionado, en mayor extensin
que los linfocitos T CD4. An no se ha establecido si esta capacidad a proliferar
depende, de la presencia de citocinas en el medio, de un efecto inhibitorio de estas
clulas, sobre la capacidad de las clulas CD4 a proliferar en respuesta al antgeno. Lo
que si es evidente es que, la remocin de los linfocitos en los cultivos, conduce a una
mayor proliferacin de clulas CD4, facilitando as su clonacin (Brown et al., 1994a;
Brown et al., 1994b).
Se ha demostrado que, los linfocitos , tienen la capacidad de unirse a protenas
antignicas sin la presentacin previa de stas unidas a las molculas del MHC. Las
funciones en la respuesta inmune de este grupo de linfocitos , particularmente en
bovinos, todava no han sido determinadas. Sin embargo se cree que, juegan un papel
importante en el control de infecciones secundarias de bovinos con A. marginale
(Wyatt et al., 1996). Ms recientemente se demostr que stas clulas tienen la
capacidad de unirse a protenas de shock trmico (HSP) presentes en el PPD (purified
protein derivative). Las HSP son producidas por las clulas en respuesta al incremento
de la temperatura y de otros factores limitantes del ambiente. Estas protenas son
tambin inducidas por condiciones de stress internas, como respuestas inflamatorias e
infecciones virales (Goldsby, Kindt y Osborne, 2000).
Los resultados obtenidos durante una infeccin primaria durante una inmunizacin,
hay que interpretarlos crticamente, debido a que los antgenos durante una infeccin
primaria con A. marginale, son capturados y procesados en el bazo, mientras que,
cuando son inoculados subcutneamente, son drenados a los ganglios linfticos del rea
donde son procesados y presentados a los linfocitos T. Las respuestas inmunes generadas
en cada uno de estos rganos, pudieran ser diferentes, debido a las marcadas diferencias
en la composicin celular entre diferentes subpoblaciones de linfocitos, macrfagos y
clulas dendrticas (Nolte et al., 2000).
El Ag.Sol. no indujo respuesta inmunoproliferativa en el torete 808. Sin embargo, sus
componentes fueron reconocidos por las CMSP del torete 805 inoculado con IB.
El resultado muestra que el contexto en el que es presentado el antgeno al sistema
inmune es relevante para la induccin de una inmunidad de tipo celular. Los
componentes del Ag.Sol. forman parte de los IB, sin embargo, no inducen inmunidad
celular como lo hace el IB corpsculo completo. El Ag.Sol. no logra inducir
inmunidad protectiva en bovinos inmunizados (Aso, 1985), lo cual pudiera ser
explicado, por su incapacidad de generar una respuesta inmune celular.
El torete 812 inmunizado con la MSP-5, no desarroll inmunidad celular contra esta
protena, as como tampoco, los toretes 805 y 808 inmunizados con IB y Ag. Sol.,
respectivamente, los cuales contienen a su vez entre sus componentes, la MSP-5.
Los resultados muestran claramente que esta protena es incapaz de generar respuesta
inmune celular, an cuando est presente en los IB.
El torete 815 (control) present a los 21 das, una ligera actividad linfoproliferativa
cuando sus CMSP se confrontaron in vitro con diferentes concentraciones de IB, de
Ag.Sol., y de MSP-5. Coincidiendo sto con el aumento detectado a los 21 das, de su
poblacin de leucocitos totales y de su subpoblacin de linfocitos.
Variaciones de diferentes subpoblaciones leucocitarias de sangre perifrica
El uso de anticuerpos monoclonales contra antgenos de diferenciacin de leucocitos
bovinos nos permiti evaluar la dinmica de las subpoblaciones de los leucocitos,
durante el curso de las repetidas inoculaciones. Los valores normales de los porcentajes
correspondientes a las subpoblaciones de linfocitos T bovinas por edad y raza de
animales, no han sido hasta la fecha, sistemticamente establecidos. Los datos
reportados para bovinos por los diferentes autores muestran gran discrepancia, la cual
pudiera ser atribuida a las diferencias etarias y entre razas, as como tambin al mtodo
utilizado para su determinacin (Howard y Morrison, 1991a Park, et al., 1992
Sigal, Gmez y Braun, 1992).
 Los porcentajes de las subpoblaciones de linfocitos CD2, CD8 y linfocitos B no
mostraron diferencias significativas en ninguno de los animales. Sin embargo, la
subpoblacion de linfocitos CD4 mostr un fuerte incremento en el torete 805, despus de
la tercera inoculacin con IB mientras que, los linfocitos mostraron un considerable
incremento en el mismo perodo de tiempo, en los toretes 808 y 812. Los cambios
observados no mostraron relacin con el curso de la inmunidad celular y humoral
desarrollada en estos animales. Ha sido demostrado que las clulas de sangre perifrica
pueden presentar grandes fluctuaciones fisiolgicas en sus concentraciones, debido a
cambios en sus patrones de circulacin y migracin diferencial a tejidos y rganos
(Westermann y Pabst, 1990). En un estudio anterior, Caballero et al. (2000) observaron
que, las diferentes subpoblaciones linfocitarias no mostraron cambios significativos
durante el curso de una infeccin experimental con A. marginale, que pudieran ser
atribudas al proceso infeccioso.
Cinticas de los isotipos de anticuerpos producidos en contra de la MSP-5
El sistema de inmunoglobulinas bovinas est conformado por IgM, IgG1, IgG2,
IgG3, IgA, e IgE, las cuales, estn bien caracterizadas desde el punto de vista fsico-
qumico (Butler, 1983), funcional (McGuire y Musoke, 1981) y gentico (Aitken,
Hosseini y MacDuff, 1999). Cada isotipo de inmunoglobulina presenta una funcin
efectora caracterstica que puede jugar un papel importante en el control y resolucin de
una infeccin particular (Roitt, Brostoff y Male, 1996).
Palmer et al. (1999) han propuesto que la IgG2 bovina, juega una funcin importante
en el control de la rickettsemia durante una infeccin aguda con A. marginale. La
propuesta indica que los anticuerpos del isotipo IgG2 especficos contra las MSPs
opsonizan los cuerpos iniciales que son luego fagocitados y eliminados por macrfagos,
activados a su vez por linfocitos T productores de INF-. En soporte a esta hiptesis se
ha observado que, bovinos que desarrollan inmunidad protectiva despus de ser
vacunados con membranas de A. marginale, presentan altos ttulos de anticuerpos del
isotipo IgG2 contra las MSP-1 y MSP-2, en contraposicin con los que desarrollan una
inmunidad parcial, que presentan altos ttulos de IgG1 contra las mismas protenas
(Brown et al., 1998).
 La MSP-5 es una protena de superficie de 19kDa, muy conservada entre diferentes
aislados geogrficos de A. marginale, y entre especies del gnero Anaplasma (Visser
et al., 1992). La protena es altamente inmunognica e induce anticuerpos que son
detectables algunos das antes de la fase aguda de la infeccin (Knowles et al., 1996), y
est asociada no covalentemente al dmero MSP-1a y MSP-1b, que juega un papel
importante como adhesina (Vidotto et al., 1994).
Las cinticas de anticuerpos totales contra la MSP-5 durante infecciones primarias
naturales y experimentales con A. marginale, han sido evaluadas por ELISA competitivo
(Knowles et al., 1996) y ELISA convencional (Reyna-Bello et al., 1998),
respectivamente. Durante la infeccin natural la respuesta de anticuerpo se hace patente
una semana antes de que se inicie la fase aguda, y alcanza su valor mximo de 4 a 5 das
antes de que los animales alcancen el pico de parasitemia (Knowles et al., 1996);
mientras que, en la infeccin experimental, la respuesta de anticuerpos especficos
contra la MSP-5 se detecta a partir de los 21 das post-infeccin, justo al inicio de la fase
aguda de la enfermedad, y se incrementa exponencialmente durante este perodo,
hasta alcanzar sus valores mximos a los 28 das post-infeccin cuando los animales
entran en la fase de convalecencia, despus del tratamiento con oxitetraciclina
(Reyna-Bello et al., 1998).
En el presente trabajo nosotros diseccionamos la respuesta inmune primaria de
anticuerpos en sus diferentes isotipos contra la MSP-5, durante una infeccin
experimental. Las cantidades de anticuerpos de los isotipos IgM e IgG1 especficos
contra la MSP-5, comenzaron a hacerse patentes, simultneamente, en todos los becerros
infectados a partir de los 21 das post-infeccin. El isotipo IgM mostr un permanente
incremento hasta el final del experimento, mientras que, la IgG1 mostr una produccin
que aument en forma exponencial durante la fase aguda, y a partir de sta, tambin
comenz a declinar su cantidad. El isotipo IgG2 mostr un comportamiento diferente.
La respuesta de este isotipo se hizo patente despus de la fase aguda de la infeccin, a la
sexta semana post-infeccin en uno de los becerros, y a la novena semana post-
infeccin, en los otros dos animales.
 La expresin y secrecin de los isotipos IgM, IgG1 e IgG2 por los linfocitos B
bovinos, depende de su estimulacin diferencial con INF- IL-4 (Estes, Closser y
Allen, 1994). El INF- induce la produccin del isotipo IgG2, mientras que, la IL-4
promueve la secrecin de IgM e IgG1. Estas citocinas son el principal marcador de
linfocitos T cooperadores del tipo Th1 y Th2, respectivamente. Los resultados obtenidos
sugieren en consecuencia que, durante una infeccin primaria con A. marginale, la
respuesta inmune primaria contra la MSP-5 es, durante la fase aguda, del tipo Th2, y
durante la fase de covalecencia, del tipo Th1. La immunizacin de bovinos tanto con
MSP-5 nativa como con MSP-5 recombinante, no protege a los animales contra retos
homlogos (Palmer y McElwain, 1995). Es posible que los anticuerpos generados en
contra de esta protena, sean del tipo IgG1, los cuales a su vez tienen poco valor
protectivo por no tener capacidad opsonizante, como postulan Palmer et al. (1999).
La cintica de los isotipos durante la respuesta inmune secundaria, fue diferente a la
observada durante la respuesta primaria. Ninguno de los tres toretes desarrollaron IgM
contra la MSP-5, como era de esperarse en una respuesta inmune secundaria. La
ausencia de anticuerpos del isotipo IgM, mostr que, la cantidad de estas
inmunoglobulinas especficas contra la MSP-5, decae durante la fase convaleciente de la
enfermedad. El torete 812 desarroll una fuerte respuestas de IgG1 e IgG2, entre la
tercera y cuarta inmunizacin con la MSP-5 recombinante. La respuesta inmune
secundaria en este animal, fue de un patrn mixto Th1 y Th2. Los toretes 805 y 808
inmunizados con IB y Ag. Sol., respectivamente, mostraron una respuesta dbil a pesar
que ambas preparaciones antignicas presentaban cantidades abundantes de la MSP-5
(Leal et al., 2000; Tebele, McGuire y Palmer, 1991).
La fuerte respuesta de anticuerpos de los isotipos IgG1 e IgG2 del torete 812,
contrast con la ausencia de una respuesta proliferativa de los linfocitos T in vitro a
reestmulos con la MSP-5 recombinante. Posibles explicaciones a esta discordancia
pudieran haber sido que, los linfocitos T efectores y de memoria que se generan
durante la infeccin la inmunizacin en contra de algunos antgenos de la rickettsia,
son rpidamente eliminados por apoptsis celular durante la fase de contraccin
de la respuesta inmune celular; que, la respuesta de anticuerpo en contra de la MSP-5
es T independiente.
 CONCLUSIONES

1. El IB fue el nico inmungeno que indujo una fuerte respuesta inmune celular.
2. Los linfocitos T de memoria generados por el IB, reconocen el Ag.Sol. pero no, la
MSP-5.
3. El IB induce la proliferacin de los linfocitos T , en CMSP inmunes a IB,
cuando son reestimuladas in vitro.
4. Durante la infeccin primaria, la respuesta de isotipos contra la MSP-5 es
predominantemente del tipo IgM e IgG1, las cuales aparecen tempranamente
durante la fase aguda de la infeccin.
5. La MSP-5 fue el nico antgeno capaz de inducir una respuesta secundaria de
anticuerpo, caracterizada por la produccin de IgG1 e IgG2.
 SUGERENCIAS

1. Realizar un estudio similar con un mayor nmero de animales, y durante una

infeccin primaria.
2. Utilizar saponina como adyuvante.
3. Evaluar la respuesta inmune celular generada por diferentes vas de penetracin del
antgeno.
4. Evaluar la respuesta inmune celular y de isotipos contra otros antgenos de
A. marginale, que han sido postulados como candidatos a vacunas.
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