TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ADN A

PARTIR DE TEJIDO VEGETAL

Abril Sebastian
Rodriguez Andrea
Rojas Angie
Ruiz Johanna
Beltrán Daniela
Bolivar Jennifer

IV E
Estudio de ADN antiguo en plantas

usualmente limitado a muestras no mayores a 200

años ya que la longitud del fragmento que se
amplifica se relaciona con el grado de
degradación del ADN.

muy fragmentado en muestras mayores a un millón de

años de fósiles de plantas hallados en el contenido
intestinal de restos de mamíferos y homínidos.

métodos de extracción que recuperen la mayor cantidad de ADN

posible a partir de poca cantidad de tejido, son fundamentales.
Es importante conocer
la finalidad, los
recursos. Por ejemplo
en las plantas el ADN
es mayor que en uno
de animales.
 alto contenido de polisacáridos y polifenoles los cuales no son
eliminados mediante extracción con fenol (a diferencia de los
microbios).

forma un complejo insoluble con ácidos nucleicos y

Bromuro de cetiltrimetilamonio (BCTMA).
precipita selectivamente el ADN, dejando atrás
Tiocianato de guanidinio (TICG) carbohidratos, proteínas y otros componentes
contaminantes.

Purificación de ADN vegetal. desnaturaliza y disuelve proteínas, desintegra estructuras

celulares, y disocia nucleoproteínas presentes en los ácidos nucleicos. Debido a esta
propiedad, el TICG puede ser utilizado para extraer el ADN de prácticamente cualquier tipo de
tejido.

Método Collins et al.
(1987) con base en
solución tampón de
lisis.
Posteriormente se adiciona
56 uL de acetato de potasio
8 M para la precipitación
de proteínas.
A éste se le adiciona
100 uL de etanol al
100% y se
centrifugó a 3.500
rpm durante 15 min.
Se agrega 400 uL del tampón
de lisis (0,08 M NaCl, 0,16 M
sucrosa, 0,06 M EDTA, 0,5%
SDS, 0,1 M Tris-CL, pH 8,6)
a la muestra y se homogeniza
en un vial de 1,5mL.
Se incuba durante 60
minutos a -20°C.
Después de descartar el
sobrenadante, se adiciona 100
uL de etanol al 75%, el
producto final se secó y se
resuspendió en 100 uL de agua
ultrapura.
Se incuba a 64°C
durante 30 minutos
Después de la
incubación se centrifuga
a 3.500 rpm durante 15
min, para luego remover
el sobrenadante y pasarlo
a un tubo nuevo.
El producto de ADN es
tratado con un uL de RNAasa
(Fermentas®) a 37°C durante
60 min. Finalmente la
muestra se almacenó a -20°
C.
 Soluciones Paso 1 Paso 2 Paso 3

Se congelan 0.03 g de tejido en Se agregaron 100 μl de

un ultracongelador
Paso 1 marca, se solución de precipitación de
pulveriza la muestra en un proteínas, se mezcló por Paso 3
Solución de lisis Se centrifuga a 10,000
mortero y se coloca en un tubo inversiones y se colocó en hielo
Solución de ARNasa al rpm durante 5 min, se
Eppendorf de 1.5 ml y 300 μl de por 10 min. Posteriormente se
10 % (marca Epicentre) Vestibulum
la solución congue
de lisis. Se mezcla e centrifugó a 10,000 rpm desecha el
Solución de Vestibulum
sobrenadante, congue
se lava
tempus
incuba a 65 °C durante 60 min, durante 5 min en una centrífuga
precipitación de tempus
con 300 μl de etanol al
se agrega ARNasa a una marca Eppendorf, se transfirió
proteínas
Lorem ipsum Isopropanol
dolor sit amet, concentración final de 10 mg/ml el sobrenadante a un tubo 70 % y se deja secar a
absoluto Etanol alelit,
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70% y se mezcla por inversiones nuevo al que se le agregaron temperatura ambiente
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Solución TE 1X suaves e incuba a 37°C durante 300 μl de isopropanol durante 15dolor
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20 min . (2-propanol) y se mezcló por Finalmente
consectetur se hidrata
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inversiones suaves para con TE 1X y se
do eiusmod tempor.
precipitar el ADN almacenó a -20°C
 Paso 2
Soluciones Paso 1 Paso 3
Doyle y Doyle
Se congelaron 0.2 Se centrifugó a
(1990) Solución de Se volvió a
g de tejido en un 10,000 rpm
extracción [CTAB centrifugar a
ultracongelador durante 10 min en
Con modificaciones 2%, NaCl 1.5 M, 10,000 rpm por 10
marca Revco, se una centrífuga
menores, EDTA 20 mM (pH min y se separó
pulverizó la marca Eppendorf,
consistentes en 8), Tris 100 mM nuevamente la
muestra en un y se
aumentar la cantidad (pH 8) y fase superior en
mortero y se transfirió la fase
de buffer de 2-mercaptoetanol un tubo nuevo.
colocó en un tubo acuosa (superior)
extracción y usar 2%], adicionado Para la
para a un tubo nuevo.
isopropanol para la inmediatamente eliminación de
microcentrífuga, Inmediatamente
precipitación. antes de su uso. ARN se trató con
se le agregaron se agregó un
Solución de ARNasa (10 mg/
800 μl de solución volumen igual de
lavado [etanol al ml) incubando
de extracción cloroformo–alcoh
76%, acetato de durante 30 min. a
recién preparada y ol isoamílico y se
amonio 10 mM]. 37°C. En seguida
se incubó a 65°C mezcló por
Solución TE 1X se agregaron 800
en baño María. inversiones
[Tris-HCl 10 mM y μl de isopropanol
suaves.
EDTA 1mM]. a -20°C, y se
Solución de colocó una hora
Cloroformo–alcoh Finalmente en el congelador
ol isoamílico para precipitar el
(24:1, V/ V) ADN. Para formar
Se tiró el sobrenadante, se lavó la pastilla
Isopropanol la pastilla de ADN,
con 400 μl de solución de lavado una y otra
absoluto Solución se centrifugó
vez, con 400 μl de alcohol al 70%. Se dejó
de ARNasa (10 nuevamente a
secar a temperatura ambiente y se
mg/ml) (marca 10,000 rpm por 10
resuspendió en una cantidad 1:1 de
Epicentre) min
solución TE 1X.
Funciones de los diferentes reactivos
Nombre del reactivo Descripción Función

EDTA ● Ácido etilen.diamino-tetra Agente quelante de iones

acético. magnesio. No permite que el
● Ácido N-tetraacético Mg++ se una a nucleasas,
protegiendo así el ADN.
Actúan en el proceso de lisis
EGTA celular Agente quelante de iones
magnesio en menor proporción.
Más selectivo para iones Ca++.
Soluciones buffer

SDS Dodecil sulfato de sodio Solubilizar proteínas y

membranas
Detergente aniónico

Tóxico
Funciones de los diferentes reactivos
Nombre del reactivo Descripción Función

Proteinasa K Enzima proteolítica Destruye las membranas

nucleares, liberando a la
Actúa en la eliminación de solución los ácidos nucleicos
proteínas e integridad de la
membrana (homogeneización
de la muestra)

CTAB Bromuro de Se adhiere fuertemente al ADN,

hexadeciltrimetilamonio desplaza las proteínas y
previene la degradación del
Detergente catiónico ADN.
Solubiliza polisacáridos
Funciones de los diferentes reactivos
Nombre del reactivo Descripción Función

Mercaptoetanol Antioxidante Utilizado como agente

antioxidante.
Desnaturaliza estructuras ricas
en G-C

Etanol o Isopropanol Actúan en la precipitación de Se unen a los grupos fosfato,

ADN reduciendo las fuerzas
repulsivas entre las cadenas y
permitiendo que el ADN se
pliegue sobre sí
mismo,haciéndolo insoluble.
Condiciones especiales: Recepción

MUESTRA ADN
Secado al horno, la inadecuada
libre de químicos e impurezas a partir de preservación y almacenamiento de
muestras de herbario. muestras vegetales, la exposición a
sustancias químicas (alcohol,
desinfectantes, plaguicidas) a luz
ultravioleta, los pH muy altos o bajos, la
humedad y el proceso natural de
degradación del material genético, son
factores que afectan negativamente la
calidad del ADN presente en muestras de
herbarios.
Procesamiento y almacenamiento del ADN resultante.
Procesamiento del ADN.

➔ Análisis de expresión de genes.

➔ Variantes genéticas.
➔ Estudiar la genómica funcional de las plantas, los
investigadores también utilizan herramientas epigenéticas,
para descifrar la causa raíz detrás de los fenotipos de
interés.

La regulación génica en las plantas se produce a

través de cambios epigenéticos tales como la
metilación del ADN, la estructura de la cromatina y
los ARN no codificantes (ARNc).
https://media.istockphoto.com/vectors/plant-structure
-vector-illustration-vector-id680526214
 Almacenamiento del ADN.
➔ Esterilidad y pureza del lugar. Destrucción de la muestra
➔ Contenedores de material como vidrio, Concluido el diagnóstico, y pasado el tiempo de
resguardo de la muestra (un mes), la muestra se
resistentes a altas temperaturas.
esteriliza en autoclave durante un tiempo de 15 –
➔ Utilizar guantes en todo momento. 20 minutos a 15-20 libras/ pulgada, antes de ser
➔ Muestra siempre en frío. desechada o incinerada.
➔ Hay que almacenar el ADN diluido desde
simple Agua estéril y filtrada (Agua MiliQ)
hasta en buffers (soluciones tamponadas)
específicos que permitan una mayor
eficiencia en el análisis.
➔ Protocolo de purificación.
➔ 4°C (unas semanas) / -20°C (No a corto
plazo).
➔ NO descongelar y congelar sucesivamente http://www.asembio.cl/wp-content/uploads/2013/11/img9.jpg
las muestras.
Una vez colectado, congelar inmediatamente para
evitar la formación de cristales y la síntesis de
metabolitos secundarios.

● Almacenar a -80 y evitar ciclos de congelación y descongelación antes de proceder

con la extracción.

● Se recomienda congelar varios paquetes pequeños de la misma muestra con la

cantidad a procesar.

EL tejido puede ser liofilizado y almacenado a temperatura ambiente entre 15 y 25 ( no es

viable)
Almacenamiento y procesamiento de la muestra.
Incubación

No ciclos de Varios Liofilización y

congelación paquetes, almacenamient
misma muestra o 15 y 20°c

No para
suculentas.

Tejido foliar Tejido Congelar en

joven nitrógeno líquido No es necesario congelar si proviene de
invernaderos o cultivos in vitro.
Almacenamiento y procesamiento de la muestra.

Semillas Tejidos.

Dependiendo
Refrigeración Refrigeración patógenos a
4°c 4°o -70°c buscar y
Fin del técnicas a
diagnóstico. emplear.
Refrigerar a 4°c
o -70°c
Un mes por si
es necesaria
la
corroboración
 Dificultades
●

●
BIBLIOGRAFÍA
● http://www.publicaciones.inecc.gob.mx/libros/710/extraccion.pdf
● MARCADORES MOLECULARES Y LA EXTRACCIÓN DE ADN. REINALDO VELASCO
MOSQUERA
● http://www.uaaan.mx/DirInv/portal_agraria/agraria/PDFs2/Comparacion.pdf
● http://www.geocities.ws/pedrojrocha/pr/rocha23_3.pdf
● https://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/TP4-09.pdf
● https://www.thermofisher.com/co/en/home/life-science/agricultural-biotechnology/plant-gene-expres
sion-analysis.html
● https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/240516/PROTOCOLO_DE_EXTRACCI_N_DE_D
NA_Y_RNA__A_PARTIR_DE_SEMILLAS_Y_HOJAS.pdf
● file:///C:/Users/Usuario/Documents/Plantillas%20personalizadas%20de%20Office/Dialnet-Estandari
zacionDeLaExtraccionDeADNGenomicoEnTabebu-4149395.pdf
● http://www.publicaciones.inecc.gob.mx/libros/710/extraccion.pdf
● https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8874/tesis812.pdf;sequence=1