La expresión de Ubc9 es esencial para la formación de miotubos en C2C12

Cecilia Riquelme, Kristen K.B. Barthela, Xiao-Feng Qin, Xuedong Liu.

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Colorado-Boulder, Boulder, EE. UU. Centro Oncológico MD Anderson de
la Universidad de Texas, Houston, EE. UU.
Palabras clave: SUMO, Ubc9, Miogénesis, shRNA.

1 ABSTRACTO
La diferenciación miogénica es un proceso biológico fundamental que involucra una serie jerárquica de eventos
que finalmente conduce a la expresión génica específica del músculo y la formación de miofibras. Las
modificaciones postraduccionales de los factores reguladores miogénicos se han implicado como importantes
mecanismos reguladores en este proceso. Aquí investigamos si la modificación de la proteína covalente por un
pequeño modificador similar a la ubiquitina (SUMO), que se sabe que afecta la actividad del factor de
transcripción, puede afectar la diferenciación muscular. Mostramos que la carga global de proteínas sumoiladas
presentes en los mioblastos disminuye progresivamente a lo largo de la miogénesis. Curiosamente, la
eliminación de la enzima conjugadora SUMO, Ubc9, compromete gravemente la diferenciación terminal de las
células musculares C2C12. Sin embargo, no afecta la expresión, la localización y la activación de MyoD y
miogenina. Estos nuevos resultados sugieren que la sumoilación de proteínas juega un papel fundamental en
la diferenciación de mioblastos y es necesaria para regular la actividad de los objetivos clave de MyoD y
miogenina.

2 INTRODUCCIÓN
Las modificaciones covalentes de proteínas pueden alterar rápida y reversiblemente la función de las proteínas.
La modificación postraduccional mediante pequeños modificadores similares a la ubiquitina (SUMO) ha surgido
como un mecanismo regulador importante para controlar la expresión génica y el mantenimiento de la
estabilidad genómica. [1 - 3]. Al igual que la ubiquitinación, la conjugación de SUMO requiere una enzima
activadora de E1 [4] y una enzima conjugadora SUMO E2 conocida como Ubc9 [1 - 3]. Se ha identificado una
lista creciente de ligasas E3, que parecen no ser esenciales, pero generalmente mejoran la velocidad y el grado
de sumoilación del sustrato. [5 - 7]. Los objetivos SUMO informados son predominantemente residentes
nucleares, incluidos factores de transcripción, coactivadores de la transcripción, correpresores de la
transcripción, proteínas del complejo de poros nucleares, proteínas del cuerpo nuclear y proteínas de integridad
del genoma. [8,9]. A pesar de mecanicista conservación entre las vías de sumoilación y ubiquitinación, los
efectos fisiológicos de estas modificaciones son bastante diferentes. La sumoilación puede afectar la
localización subnuclear, la capacidad de activación de la transcripción y la estabilidad de las proteínas al
interferir con la ubiquitinación. [1 - 3], influyendo así en la regulación de procesos esenciales como la expresión
génica. La formación de músculo es un proceso fundamental gobernado por la actividad de factores de
transcripción específicos del músculo que forman la familia MyoD (MyoD, miogenina, Myf-5 y MRF-4) [10]. Estas
proteínas cooperan con una segunda familia de factores de transcripción conocida como familia MEF2 [11].
Juntos constituyen una red esencial para la regulación de eventos miogénicos [12]. Durante este proceso, las
células precursoras del músculo (mioblastos) salen irreversiblemente del ciclo celular, regulan positivamente la
expresión de proteínas específicas del músculo y comienzan a fusionarse para formar células multinucleadas
diferenciadas terminalmente (miotubos). Por lo tanto, la diferenciación miogénica se acompaña de cambios
drásticos en la morfología y la arquitectura celular, en respuesta a la necesidad de reorganizar las proteínas
citoesqueléticas para formar el sarcómero funcional [13]. Aunque se han dilucidado muchos aspectos
específicos de la diferenciación muscular, todavía existen importantes interrogantes sobre los mecanismos que
controlan la regulación precisa y compleja de sus eventos temporales. El presente estudio investiga si la
sumoilación de proteínas juega un papel regulador en la diferenciación miogénica. Mostramos que la eliminación
de la enzima conjugadora SUMO E2 (Ubc9) en mioblastos compromete gravemente la diferenciación terminal.
Sin embargo, en este contexto determinamos que la caída de Ubc9 no afecta la expresión, la localización y la
activación de MyoD y miogenina. Nuestros resultados indican que la sumoilación de proteínas es una actividad
esencial en los mioblastos para la regulación de eventos de la activación de los genes maestros miogénicos.

3 RESULTADOS
La modificación de SUMO disminuye durante la diferenciación de mioblastos.
La conversión de mioblastos C2C12 en miotubos es un modelo bien establecido para estudiar la diferenciación
muscular in vitro. En una caracterización preliminar de la sumoilación como un mecanismo regulador putativo
durante la miogénesis, determinamos el patrón general de modificación de proteínas por SUMO-1 y SUMO2 /
3 durante un curso de tiempo de diferenciación en mioblastos C2C12. Los lisados celulares de C2C12 en varios
puntos de tiempo de diferenciación se prepararon y analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos
anti-SUMO1 y anti-SUMO2 / 3. Figura 1 A muestra que hay una disminución en la cantidad de proteínas
modificadas totales detectadas por SUMO1 (panel superior) y SUMO2 / 3 (panel central). Esta reducción es
detectable después de 2 días de diferenciación, pero es más evidente hacia el final del proceso de
diferenciación. Se utiliza una inmunotransferencia de tubulina como control de carga. Para demostrar la
especificidad de los anticuerpos SUMO1 y SUMO2 / 3, realizamos un western blot analizando las isoformas
SUMO detectadas por estos anticuerpos. Figura 1 B muestra una inmunotransferencia SUMO1 (panel superior)
y SUMO2 / 3 (panel central) realizada con SUMO1, SUMO2 y SUMO3 recombinantes resueltos en un gel de
acrilamida. A partir de este resultado, podemos concluir que ambos anticuerpos reconocen específicamente las
isoformas SUMO contra las que se produjeron. En general, la disminución en la cantidad de proteínas
modificadas por SUMO podría explicarse por una regulación a la baja de la actividad de sumoilación durante la
progresión de la formación muscular o por una disminución en la abundancia de los objetivos SUMO a lo largo
de este proceso.

Ubc9 cambia su localización durante el proceso de diferenciación muscular.

Es la única enzima E2 que se sabe que se requiere para la conjugación de SUMO con proteínas diana [14].
Además, entre las enzimas de ubiquitina E2, Ubc9 es una enzima E2 única porque participa directamente en el
reconocimiento y la unión del sustrato. Para caracterizar aún más la relevancia de la vía SUMO para la
diferenciación muscular, determinamos la expresión y localización de Ubc9 durante la diferenciación de células
C2C12. Según lo determinado por la inmunotinción de Ubc9, la enzima conjugadora E2 se expresa en
mioblastos proliferantes y miotubos completamente diferenciados (Figura 1 C). Además, en consonancia con
informes anteriores [15], Ubc9 se localiza como estructuras puntuadas principalmente en la región perinuclear
(flecha blanca) pero algo también se ve en el citoplasma (panel superior) en mioblastos. En el día 6, Ubc9 se
distribuye de manera más homogénea y amplia en los miotubos mientras mantiene su organización en
estructuras puntiformes (Figura 1 C, panel inferior). Este cambio en la distribución sugiere que Ubc9 puede estar
sujeto a una regulación diferencial de su función durante la diferenciación miogénica.

Figura 1 - Regulación de la vía SUMO durante la diferenciación de mioblastos. (A) Regulación de la actividad de conjugación
SUMO durante la miogénesis. Los lisados de células C2C12 extraídos en los puntos temporales indicados se analizaron
mediante inmunotransferencia con anti-SUMO1, anti-SUMO2 / 3 y anti-tubulina. Los marcadores de masa molecular se
indican en la figura. El asterisco (*) indica una banda muy probablemente específica para RanGAP1 sumoilada. (B) La
especificidad de los anticuerpos anti-SUMO1 y anti-SUMO2 / 3 se probó mediante inmunotransferencia. Se analizaron
quinientos nanogramos de hSUMO1 (1), hSUMO2 (2) y hSUMO3 (3) purificados recombinantes en una SDS al 14%. La
membrana se incubó con 1/1000 anti-SUMO1 o 1/500 anti-SUMO2 / 3 como se describe en Procedimientos
experimentales. Como control de carga, se analizó otro gel simultáneamente mediante tinción con azul de Coomassie. (C)
Caracterización de la expresión y localización de Ubc9 durante la diferenciación de mioblastos. Las células C2C12 fijadas
en los puntos de tiempo indicados de un curso de tiempo de diferenciación, el día 0 (D0) y el día 6 (D6), se tiñeron con un
anticuerpo contra Ubc9 (el campo representativo se muestra en el panel izquierdo). La tinción nuclear se realizó
simultáneamente mediante el montaje con DAPI (panel derecho). Se muestra un aumento mayor de una tinción
representativa (recuadro). Barra de escala = 20 μ metro.
La caída de Ubc9 conduce a un fenotipo de fusión defectuosa en la diferenciación de mioblastos
C2C12
Para evaluar aún más el papel de la actividad de Ubc9 en la regulación de la miogénesis, disminuimos la
expresión de Ubc9 en las células precursoras del músculo. Se transfectaron transitoriamente mioblastos C2C12
con dúplex de oligonucleótidos de ARN interferente corto (ARNip) para apuntar al mouse Ubc9 (mUbc9). Como
se muestra en Figura 2 A (panel superior), la transfección de uno de los dúplex de ARNip contra Ubc9 da como
resultado una clara disminución en el número de miotubos después de 4 días de diferenciación en comparación
con las células de control. La cuantificación se realizó para determinar el número de núcleos positivos para la
tinción de cadena pesada de miosina (MHC) o para determinar el número de núcleos presentes en miotubos
sobre el total de núcleos (Figura 2 A, panel inferior). Mientras que las células transfectadas con el oligo control
mostraban el 30% de los núcleos en los miotubos (columna gris, 1), las células transfectadas con un oligo de
ARNip específico contra Ubc9 albergaban solo el 6% de los núcleos en los miotubos (columna gris, 2).
Curiosamente, la transfección del oligo de ARNip específico de Ubc9 también afectó la expresión de la cadena
pesada de miosina, pero de forma menos dramática en comparación con la formación de miotubos (columnas
blancas frente a columnas grises). Es importante destacar que la inhibición de ambos marcadores de
diferenciación puede rescatarse mediante la reexpresión de un ADNc de Ubc9 de ratón revuelto, que codifica
una versión de Ubc9 resistente a ARNip (ver procedimientos experimentales). En estos casos, los porcentajes
se recuperan a niveles comparables a los de los controles (columnas blancas y grises, 3). Adicionalmente, el
recuadro muestra que la expresión de Ubc9 es anulada por el oligo ARNip específico de Ubc9 (2) y los niveles
de la proteína pueden ser rescatados (3). Aunque es evidente que los niveles de Ubc9 rescatados no son tan
altos como los del tipo salvaje endógeno, son suficientes para rescatar ambos marcadores de diferenciación.

Para caracterizar este fenotipo con más detalle, se creó una línea celular estable de caída de Ubc9 mediante
transferencia lentiviral de un ARN en horquilla corto dirigido contra mUbc9 (shUbc9). De manera similar a lo que
se observó con los oligos de ARNip dirigidos a Ubc9, las células C2C12 que expresan shUbc9 mostraron un
defecto en la formación de miotubos (Figura 2 B, panel superior). Para confirmar que el ARN en horquilla de
hecho derriba la expresión de Ubc9 y que este efecto también se mantiene durante el transcurso del tiempo de
diferenciación, se evaluaron los niveles de proteína Ubc9 mediante inmunotransferencia. Figura 2 B (panel
inferior) muestra una transferencia Western de un curso de tiempo de diferenciación de 6 días y demuestra que
los niveles de Ubc9 disminuyen en un 70% en comparación con las células de control.

A continuación, determinamos el efecto de la caída de Ubc9 en el perfil de los objetivos globales modificados
por SUMO en C2C12. Para ello, se analizaron los lisados celulares de células C2C12 transducidas de forma
estable con control FG12 y FG12 que expresaba shUbc9 mediante inmunotransferencia con anti-SUMO1 (Fig.
3 A, panel superior) y anti-SUMO2 / 3 (Fig. 3 A, panel central). Como esperábamos, Fig. 3 A muestra que la
expresión de Ubc9 disminuida da como resultado una cantidad disminuida de objetivos globales modificados
por SUMO. Cabe señalar que en nuestro sistema la expresión de Ubc9 está significativamente disminuida pero
no completamente agotada; por lo tanto, todavía podemos detectar cierta sumoilación que se produce en los
mioblastos. Estos resultados demuestran que el ARN en horquilla de Ubc9 inhibe la expresión de Ubc9 que da
como resultado una actividad de sumoilación disminuida en C2C12.

Figura 2 - El silenciamiento del gen Ubc9 disminuye la formación de miotubos. (A) La expresión de Ubc9 es esencial para
la diferenciación muscular. Las células C2C12 sembradas en cubreobjetos se transfectaron con un oligo de ARNip
inespecífico (1), oligo de ARNip de mUbc9 (2), o cuando se indique con oligo de ARNip de mUbc9 junto con un vector que
codifica la proteína mUbc9 resistente al ARNip (ensayo de rescate) (3). Luego se desencadenó la diferenciación durante 4
días, después de lo cual las células se fijaron y analizaron por inmunofluorescencia usando un anticuerpo contra la cadena
pesada de miosina (MHC) y se montaron con DAPI. Se muestran campos representativos. Arriba a la izquierda: células de
control transfectadas con un ARNip no específico. Arriba a la derecha: células transfectadas con un ARNip dirigido
específicamente contra Ubc9. Barra de escala = 40 μ metro. En el panel inferior, en cada condición, se puntuaron el
porcentaje de núcleos positivos para MHC (columnas blancas) y el porcentaje de núcleos en miotubos (MT) (columnas
grises) sobre el total de núcleos. Se incluyó la cuantificación del ensayo de rescate (3). El análisis estadístico se realizó
utilizando ANOVA de una vía para comparar todos los pares de columnas (N = 6). Los valores representados por la columna
1 frente a la columna 2 son significativamente diferentes (* P < 0,001); lo mismo es cierto para los valores representados
por la columna 3 frente a la columna2 (# P < 0,001). El recuadro muestra una mancha occidental para Ubc9 en las tres
condiciones experimentales. (B) Efecto de eliminación estable de Ubc9 en la diferenciación de C2C12. Las líneas celulares
estables C2C12 se tiñeron para la cadena pesada de miosina (MHC) y DAPI después de 6 días de diferenciación. En cada
caso se muestra un campo representativo. Arriba a la izquierda: células C2C12 infectadas con el vector lentiviral de control.
Arriba a la derecha: el efecto de C2C12 infectado con un vector lentiviral que alberga una secuencia corta en horquilla
complementaria a Ubc9 (FG12_shUbc9). Barra de escala = 40 μ metro. En el panel inferior, los lisados de control FG12 y
FG12_shUbc9 se prepararon durante el curso de la diferenciación y se analizaron para la expresión de Ubc9 usando un
anticuerpo contra Ubc9. El panel inferior muestra una α- tubulinwestern blot de la misma membrana que el control de carga.
La expresión disminuida de Ubc9 no conduce a una alteración del ciclo celular
Es bien sabido que el agotamiento de Ubc9 en Saccharomyces cerevisiae previene la progresión del ciclo celular
en la fase G2 o temprana M, induciendo una acumulación de células en esta etapa [16]. Además, en células
eucariotas superiores se ha demostrado que la pérdida de función de Ubc9 induce un compromiso con la
apoptosis en una proporción considerable de la población [17]. Para determinar si la caída de Ubc9 en C2C12
perturba la progresión del ciclo celular, analizamos el perfil del ciclo celular de los mioblastos FG12_control y
los que expresan la horquilla FG12_Ubc9 mediante citometría de flujo. Fig. 3 B, panel izquierdo, muestra un
histograma que cuantifica la cantidad de ADN de ambas poblaciones celulares mediante la incorporación de
yoduro de propidio. El análisis cuantitativo de los resultados obtenidos en Fig. 3 B no muestra una diferencia
significativa en el perfil del ciclo celular entre las poblaciones de células de control y las que expresan shUbc9
(panel derecho). Esto afirma que la caída de Ubc9 a este nivel no causa acumulación de células en la transición
G2 / M ni apoptosis en C2C12. Por lo tanto, es poco probable que los defectos en la diferenciación miogénica
sean un efecto indirecto de la perturbación del ciclo celular. Sin embargo, la expresión de Ubc9 no se agotó por
completo en nuestro sistema a diferencia del caso de la deleción genética en células de levadura y pollo.
Todavía es muy posible que la eliminación completa de Ubc9 pueda conducir a la muerte celular o la detención
del crecimiento en mioblastos. La diferenciación miogénica, sin embargo, parece ser más sensible a cambios
sutiles en los niveles de Ubc9.
Fig. 3 - Efecto de la caída de Ubc9 sobre la actividad de sumoilación sobre los objetivos generales y la progresión del ciclo
celular. (A) Disminución de la abundancia de objetivos de sumoilación global en la línea celular estable de caída Ubc9. Las
líneas celulares estables se analizaron mediante inmunotransferencia SUMO1 (panel superior), SUMO2 / 3 (panel central)
y tubulina (panel inferior) en los puntos de tiempo indicados. (B) Análisis de los perfiles de control FG12 (traza sombreada)
y FG12_shUbc9 (traza superpuesta sin sombrear) de la incorporación de yoduro de propidio en el ADN mediante citometría
de flujo (panel izquierdo). El panel de la derecha muestra una cuantificación de los perfiles del ciclo celular que se muestran
a la izquierda. Ambas líneas celulares no muestran diferencias obvias al comparar la proporción de células en diferentes
fases del ciclo celular (partición G1, S y G2 / M).
La caída de Ubc9 no afecta la expresión de los MRF
La diferenciación del músculo esquelético se rige por una regulación estricta tanto de la actividad como del nivel
de expresión de una serie de factores de transcripción, en particular el factor regulador muscular (MRF),
miembros de la familia, MyoD y miogenina. Debido a que la inhibición de la expresión de Ubc9 tiene un fuerte
impacto en la diferenciación miogénica y dado que SUMO se ha caracterizado por regular principalmente la
actividad de las proteínas nucleares, razonamos que la expresión disminuida de Ubc9 podría afectar la función
de los MRF. Por lo tanto, primero evaluamos si la expresión y / o localización de MyoD y miogenina se vieron
afectadas. La inmunotinción para MyoD en el fondo de la caída del ARNip de Ubc9 no muestra diferencias en
la expresión y localización en comparación con las células de control (Figura 4 A, panel superior). Se obtuvieron
resultados similares para la miogenina donde el número de núcleos con tinción positiva para la miogenina
nuclear no difiere entre el control (49%) y las células donde Ubc9 fue silenciado (45%) (inmunotinción, panel
inferior). Además, estudiamos la activación de la expresión de miogenina como indicador del progreso del
proceso de diferenciación. Figura 4 B no muestra diferencias ni en los niveles ni en el momento de la expresión
de miogenina, cuando los lisados de ambas líneas de células de los establos se analizaron mediante
transferencia Western. Estos resultados sugieren que el defecto en la miogénesis como consecuencia de la
inhibición de la expresión de Ubc9 es independiente de una alteración en la expresión y localización de factores
de transcripción clave que controlan el compromiso muscular y los eventos de diferenciación temprana de los
mioblastos.

La actividad de MRF no se ve afectada en células C2C12 con fusión defectuosa

Las familias de factores de transcripción MyoD y MEF2 tienen sitios de unión en las regiones reguladoras de
muchos genes específicos de músculos [18 - 20]. Existen interacciones homotípicas y heterotípicas
cooperativas entre estos factores para establecer un complejo transcripcional funcional. Decidimos determinar
la actividad transcripcional de estos factores en el trasfondo de la caída de Ubc9 mediante la transfección de
varios genes informadores con secuencias de sitios de unión canónicos tradicionalmente utilizadas para
determinar la actividad miogénica. Figura 4 C muestra que no hay diferencia entre las líneas celulares de control
(columnas blancas) y shUbc9 (columnas grises) cuando se determina el pliegue de activación para la actividad
del reportero de miogenina (40 frente a 50 veces), el reportero MEF2 (7.6- vs .7,5 veces), y el α- reportero de
actina cardíaca (6 frente a 8 veces) 48 h después de desencadenar la diferenciación. Hay una ligera diferencia
cuando se compara la actividad del informador MHC, lo que da como resultado una disminución del 30% en la
actividad cuando el informador se analiza bajo el fondo de caída de Ubc9 estable. Este resultado está de
acuerdo con la evidencia presentada en Figura 2 A donde detectamos núcleos MHC menos positivos en
mioblastos transfectados con los oligos de ARNip específicos de Ubc9. Los resultados obtenidos con cuatro
genes reporteros apoyan la idea de que los defectos en los eventos de diferenciación terminal no se deben
probablemente a la alteración de la actividad de MyoD y miogenina.
Figura 4 - La expresión alterada de Ubc9 no se correlaciona con la expresión y actividad alterada de los miembros de los
factores de transcripción de la familia MyoD. (A) Localización de MyoD y miogenina. En el panel izquierdo, se transfectaron
mioblastos C2C12 con oligos de ARNip inespecífico y ARNip específico de Ubc9, respectivamente. Las células se fijaron
y tiñeron después de 4 días de diferenciación con anti-MyoD (panel superior) y después de 6 días de diferenciación con
anti-miogenina (panel inferior). Barra de escala = 20 μ m (panel superior); barra de escala = 40 μ m (panel inferior). (B)
Evolución temporal de la expresión de miogenina. Se prepararon lisados celulares de las líneas celulares FG12 control y
FG12_shUbc9 a partir de células mantenidas en medio de crecimiento (D0) o después de los puntos de tiempo indicados
en el medio de diferenciación y se analizaron mediante inmunotransferencia de miogenina. El panel inferior muestra un α-
Western blot de tubulina de la misma membrana que el control de carga. (C) Análisis de la actividad de luciferasa de varios
genes indicadores específicos de músculo. Las líneas celulares de control FG12 y FG12_shUbc9 estables se transfectaron
transitoriamente con un indicador de miogenina, un indicador de MHC, un indicador de MEF2 (MM) y α- reportero de actina
cardíaca en experimentos separados. La actividad de cada indicador se midió en células mantenidas en medio de
crecimiento y 48 h después del cultivo en medio de diferenciación. Se calculó el doblez de activación en cada caso.
4 DISCUSIÓN
La mayor parte de nuestro conocimiento sobre las consecuencias funcionales de la modificación SUMO se ha
adquirido a partir de una serie de estudios que analizan el impacto de la sumoilación en la actividad de una sola
proteína. A partir de estos estudios, se piensa que la sumoilación afecta principalmente a proteínas nucleares
para las que la modificación conduce a una represión de su función. Sin embargo, el impacto de la sumoilación
como mecanismo para regular los procesos celulares globales es poco conocido. En el presente estudio,
caracterizamos la importancia funcional de la sumoilación como una supuesta modificación postraduccional
involucrada en la regulación de la miogénesis. Demostramos que el deterioro de la sumoilación al derribar la
expresión de la única conjugación SUMO genera un fenotipo deficiente de fusión en mioblastos C2C12. Esta
observación sugiere que se requiere Ubc9 para regular la función de proteínas clave involucradas en el control
de la formación muscular. Uno de los mecanismos esenciales para controlar la miogénesis es a través de una
regulación temporal y espacial estrechamente coordinada de la actividad transcripcional. Primero planteamos
la hipótesis de que la actividad de uno o más miembros de la familia de factores de transcripción MRF podría
alterarse cuando se silencia la expresión de Ubc9. Demostramos que estas proteínas no se ven afectadas en
su expresión, localización o actividad bajo el fondo de caída de Ubc9.
Estos datos sugieren que la expresión de caída de Ubc9 tiene poco impacto en la actividad de MRF, aunque no
se puede descartar que las diferencias sutiles en la dinámica de transcripción puedan resultar en defectos en
la formación de miotubos. Se ha demostrado previamente que la expresión de miogenina y MEF-2 no es
suficiente para impulsar una diferenciación exitosa del músculo esquelético [21]. La alteración de eventos de
diferenciación tardía, como la expresión del receptor de acetilcolina y la formación de miotubos con una
activación normal de los MRF, ha sido reportada anteriormente. [21]. En estos estudios, una alteración de la
síntesis y organización de proteínas de la matriz extracelular como los proteoglicanos puede tener un impacto
profundo en la formación de miotubos y la expresión normal de miogenina y MyoD no es suficiente para impulsar
un proceso de diferenciación exitoso. Sería interesante determinar si la pérdida de la expresión de Ubc9 afecta
la síntesis de proteínas de la matriz extracelular en el futuro. Las células del músculo esquelético, los miembros
de MEF2 colaboran con la familia de factores de transcripción MyoD para activar genes críticos para la
diferenciación muscular. Recientemente, se ha informado que MEF2D está sujeto a modificación SUMO y que
esta modificación inhibe su actividad transcripcional por un mecanismo que involucra a HDAC4 como una
supuesta ligasa E3 para la modificación [22,23]. De hecho, en nuestro laboratorio hemos determinado que
MEF2A es sensible a la modificación por SUMO con la consiguiente inhibición de su actividad transcripcional.
[28]. Sin embargo, no está claro en este punto si el grado de sumoilación de MEF2 afecta la diferenciación de
las células musculares o si la modificación dinámica de MEF2 por SUMO regula su función en diferentes etapas
de la diferenciación celular. El silenciamiento de Ubc9 tiene un efecto global y profundo sobre la diferenciación
de las células musculares sin afectar la proliferación celular. Varios procesos regulados por SUMO pueden
haber sido alterados, y es muy probable que esta pequeña proteína modifique varios sustratos más allá de las
proteínas nucleares, como los factores de transcripción analizados en el presente estudio.
Además de la regulación transcripcional de la miogénesis, la formación de músculo requiere la remodelación
del citoesqueleto para el ensamblaje de miofibrillas sarcoméricas. Sería interesante determinar el impacto de la
sumoilación en los cambios citoesqueléticos durante la diferenciación muscular. De acuerdo con esta idea,
varios estudios han confirmado que moléculas más allá de las proteínas nucleares son dianas SUMO
novedosas, incluidas proteínas citoesqueléticas como α- tubulina [24] y miosina no muscular [25], así como
proteínas transmembrana como el canal de potasio K2P1 [26]. No se han determinado las consecuencias
funcionales de la sumoilación hacia proteínas reguladoras del citoesqueleto. Además, debido a que la expresión
y organización de las moléculas de la matriz extracelular son esenciales para impulsar un proceso de
diferenciación exitoso [21], sería interesante estudiar si SUMO puede regular la organización de las proteínas
citoesqueléticas y por lo tanto la comunicación de los yoblastos con la matriz extracelular para impulsar los
eventos de diferenciación tardía.
Otra observación interesante presentada en este estudio muestra que el perfil general de los objetivos
modificados con SUMO (SUMO1 y SUMO2 / 3) disminuye durante la progresión de diferenciación miogénica.
Los cambios en los patrones de sumoilación en respuesta al estrés celular se han informado antes [25]; los
autores demostraron mediante espectrometría de masas que el tratamiento de las células HEK293 con 4-
hidroxinonenal provocó un cambio completo en el perfil de SUMO1 y SUMO3 a diferentes objetivos proteicos.
Esta evidencia plantea la posibilidad de que SUMO se dirija a distintos grupos de proteínas después de las
señales de estrés, lo que podría ser necesario para aumentar la estabilidad de ciertas proteínas necesarias para
la nueva condición. Es peculiar que principalmente sustratos de alto peso molecular (igual y mayor a 75 kDa)
son las proteínas primarias visualizadas después de la inmunotransferencia SUMO (SUMO1 y SUMO2 / 3;
Figura 1 UN). Esto podría deberse al hecho de que los anticuerpos SUMO requieren concentraciones de 100
ng o más de una proteína modificada para ser detectados por quimioluminiscencia (datos no mostrados); por
tanto, esta aproximación nos permite detectar las especies más abundantes que están sumoiladas y no
podemos descartar la presencia de especies menos abundantes modificadas por SUMO que también podrían
estar cambiando su grado de sumoilación. La limitación de la sensibilidad de este enfoque técnico también
podría explicar la posible evidencia contraria a la intuición, incluido el deterioro de la formación de miotubos
cuando Ubc9 se silencia con el hecho de que la sumoilación puede regularse negativamente durante el proceso
de diferenciación. No es posible saber si la modificación de los objetivos de menor abundancia aumenta con la
diferenciación y si esto podría ser un evento necesario para la formación de miotubos.
En resumen, nuestras observaciones amplían la comprensión del papel fisiológico de la sumoilación en sí. Estos
son hallazgos novedosos, en los que mostramos que se requiere Ubc9 para la formación de miotubos y hay un
cambio en el patrón de sumoilación a lo largo del proceso de diferenciación. Los experimentos en curso
ayudarán a determinar los objetivos putativos de la proteína SUMO que regulan los eventos de diferenciación
tardía en la vía miogénica.

5 PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Oligos y plásmidos
Se adquirieron de Dharmacon oligos de ARN de interferencia pequeños sintéticos (ARNip) contra mUbc9. Los
oligos fueron transfectados utilizando Transmessenger Reagent (QIAGEN) siguiendo las condiciones del
fabricante. Tras probar cuatro secuencias diferentes para apuntar a Ubc9 y el grupo SMART (incluye todas las
secuencias), el oligo nº 4 (GTAGCTGTCCCAACAAAGA) produjo el fenotipo más espectacular y se caracterizó
más. Se mutó un plásmido que codificaba Ubc9 humano (pCMV Sport6_human Ubc9) en dos bases usando el
kit QuikChange siguiendo las condiciones del fabricante (Stratagene); las dos bases están ubicadas en la región
dirigida por el ARNip. Esta secuencia codificada de Ubc9 codifica la misma secuencia de aminoácidos, pero no
debería ser reconocida por el ARNip. Basado en la secuencia del oligo # 4, diseñamos una secuencia de ADN
en horquilla corta y la clonamos en el lentivector FG12 [27].

Cultivo celular, transfección y generación de líneas celulares estables

Los mioblastos de ratón C2C12 (CRL-1772) se adquirieron de ATCC. La línea celular se mantuvo en DMEM
suplementado con L- glutamina, penicilina, estreptomicina y suero bovino fetal al 10%. Para inducir la
diferenciación, las células se cultivaron en DMEM complementado con suero de caballo al 5%. La línea celular
estable de caída de Ubc9 fue generada por lentiviral transferencia de genes mediada como se describió
anteriormente [27]. Después de la infección, las células transducidas positivas se enriquecieron clasificándolas
para la señal de GFP. Para los ensayos de luciferasa, C2C12 se sembraron a 6000 células / cm 2 por triplicado
y 24 h después se transfectaron con el reactivo de transfección FuGENE6 (Roche).

Western blot
Las células se lisaron en hielo en los puntos de tiempo indicados con un tampón que contenía un detergente no
iónico (Tris 50 mM - PH de HCl 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,5%, 20 mM NORTE etilmaleimida, glicerol
al 5%), PMSF 1 mM y un cóctel completo de inhibidores de proteasa (Roche), rotados durante 30 min a 4 ° C y
centrifugado a 4 ° C durante 30 min a 20.000 × gramo. Las muestras se cuantificaron mediante el ensayo de
Bradford y los extractos se resolvieron en una SDS al 8% - PAGE gel y se transfirió a una membrana de
nitrocelulosa. La inmunotransferencia se realizó según condiciones estándar con anti-Ubc9 (BD Bioscience) a
una dilución de 1: 250, anti-SUMO1 (Zymed) a una dilución de 1: 1000, antiSUMO2 / 3 (Chemicon) a una dilución
de 1: 500, o anti-ratón. -tubulina (ICN) a una dilución de 1: 1000. Las membranas se desarrollaron en Super
Signal WestDura (Pierce) según las condiciones del fabricante.

Ensayos de genes informadores

Los constructos informadores que contienen las regiones promotoras de los genes musculares fueron
amablemente proporcionados por: Dr. Stephen Tapscott, informador de miogenina; Dr. BradleyOlwin, α-
reportero de actina cardíaca; Dra. Leslie Leinwand, reportera de MHC; y Dr. Aidong Han, pGL3_MM (promotor
artificial que contiene 2 sitios de unión a MEF2). Las células se transfectaron con los genes indicadores y se
lisaron 48 h después de la transfección y 48 h después de la diferenciación. Todas las células se lisaron en
tampón de lisis pasivo (Promega) y se analizaron con un sistema de ensayo de luciferasa (Promega). Para la
detección se utilizó un luminómetro de placa de microtitulación Dynex. Los pliegues de activación se calcularon
mediante la relación entre la actividad del informador en condiciones de diferenciación y de proliferación. La
figura muestra un experimento representativo de tres experimentos individuales realizados por triplicado.

Microscopio fluorescente
Veinticuatro horas después de la transfección, se indujo la diferenciación de los mioblastos durante 6 días. Las
células se lavaron 3 veces con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con PBS que
contenía Triton X-100 al 0,5%. El análisis de inmunofluorescencia indirecta se realizó mediante incubación con
sobrenadante de hibridoma no diluido de anticuerpos monoclonales anti-miosina de cadena pesada MF-20 o
anti-miogenina F5D (amablemente proporcionado por el Dr. Brad Olwin), 1:25 anti-Ubc9 (Zymed) o 1:30 anti-
MyoD (# sc-760) como anticuerpos primarios. Como anticuerpos secundarios se utilizaron IgG anti-conejo y
anti-ratón affiniPure conjugadas con FITC y Cy3 (Jackson Immuno Research Laboratories). Los cubreobjetos
se montaron con medio de montaje Vectashield que contenía DAPI (Laboratorios Vector). La visualización se
logró con un microscopio de desconvolución LeicaDMRXA con un objetivo de 40 ×. Las imágenes se recopilaron
mediante el software Slidebook y se fusionaron electrónicamente.

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INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

Cronología del artículo: Recibido el 2 de enero de 2006

Versión revisada recibida

12 de marzo de 2006

Aceptado el 13 de marzo de 2006

Agradecemos a la Dra. Leslie Leinwand y al Dr. Hugo Olguin por leer críticamente el manuscrito. Este trabajo está
respaldado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (CA107098) y el Programa de Investigación del
Tabaco de Colorado (2R-45) a Xuedong Liu. K. B. fue apoyado por una beca de formación predoctoral de NIGMS
(T32GM08759).