INFORME PRÁCTICA 7.

Nicolas Esteban Casallas Mendez

ncasallasm@unal.edu.co

1. OBJETIVOS
 Determinar el crecimiento de E. coli en un cultivo discontinuo en caldo BHI
 Determinar el crecimiento por medio del recuento en placa expresado como
UFC/ml en el tiempo.
 Establecer la densidad óptica en el cultivo a través del tiempo. Determinar el pH de
las muestras

2. RESULTADOS
En este informe se analizará los resultados obtenidos en el trabajo de grado
“EVALUACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO PARA ESCHERICHIA COLI ATCC
25922, Y ESTANDARIZACION DE UN MÉTODO ALTERNATIVO DE PRESERVACIÓN A
CORTO PLAZO EMPLEANDO BUFFER FOSFATOS.” (1)

Figura 1. Cinética de crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922

 Figura 2. Fases de crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922. (A) Fase de crecimiento exponencial y (B) Fase de
desaceleración

3. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

En los resultados de este artículo no se presenta una fase de latencia (o adaptación),

posiblemente porque se encontraba adaptado ya que previamente había estado bajo
condiciones de temperatura, aireación y nutrición similares a las de la fermentación,
presentando un crecimiento exponencial desde la hora 0 hasta la hora 8, con una
velocidad de crecimiento de 0.2241 h-1 y con un tiempo de duplicación de 3.09 h. (1)

Es válido resaltar la anotación de las autoras al mencionar a Johan Larsson, quién en el

2001 describió el desarrollo y optimización de un proceso de fermentación discontinua
usando seis fermentadores con capacidad de un litro para la producción de proteínas
recombinantes en E. coli en caldo BHI, midiendo variables como pH, tiempo de cultivo,
temperatura, donde la expresión óptima de la proteína fue con un tiempo de cultivo de
17.8 h, a 36.7ºC con un pH de 6.8 y una velocidad especifica de crecimiento de 0.23h-1
(2).

También se hace un acercamiento al comportamiento de las bacterias entre las 8-22h,

dicho comportamiento no se puede clasificar como fase estacionaria, debido a que se
mantiene un aumento de la concentración celular, pero tampoco entra en la fase
exponencial por lo que la velocidad de crecimiento disminuyó un 93%. (3).

Según los autores mencionados Carbonell y Corchero en el año 2002, describen este
comportamiento como una fase de transición entre la fase exponencial y la fase
estacionaria, lo cual es causado por factores como presencia de microambientes
anaeróbicos, acidificación del medio, disponibilidad de nutrientes, así como otros
mecanismos más sofisticados de comunicación intracelular que contribuyen a regular la
división celular y por lo tanto la densidad de células en el cultivo. (4)

Finalmente como el objetivo de la investigación consultada era observar la reacción de

distintas unidades formadoras de colonias ante diferentes buffer fosfatos el fin de obtener
un método para la preservación de E. coli a corto plazo. No se incluyó la fase de declive o
muerte, esto se puede corroborar en la figura 1, donde la última medición se hizo a las
23h, dónde las bacterias se encontraban en su fase transitoria entre la fase exponencial y
la estacionaria.

Como anotación extra estos resultados se pueden complementar con el uso de recuento
de coliformes, como las pruebas cromogénicas como procedimiento indirecto, o por
ejemplo con el hemocitómetro el cuál es un método directo. Para finalmente obtener un
resultado fidedigno a la muestra.

4. CONCLUSIONES

5. BIBLIOGRAFÍA
1. GARZON RUIZ, A. X., & GOMEZ GUERRERO, J. A. (2007, noviembre).
EVALUACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO PARA ESCHERICHIA COLI
ATCC 25922, Y ESTANDARIZACION DE UN MÉTODO ALTERNATIVO DE
PRESERVACIÓN A CORTO PLAZO EMPLEANDO BUFFER FOSFATOS.
https://www.javeriana.edu.co.
https://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis133
2. ARSSON JOHAN.2001. High-throughput Fed-batch Production of Affibody®
molecules in a novel Multi-fermentor system. Tesis de Master. Linköping
University. Suiza.46pp.
3. QUINTERO R. 1987. Ingeniería Bioquímica. Teoría de las aplicaciones. Edt
Alhambra Mexicana. México. 30-31 pp.
4. CRUEGER W. 1993. Biotecnología: Manual de microbiología. Edt Acribia,
Zaragoza España. 73-117pp.
5. ATKINSON B. 1986. Reactores Bioquímicos. Edt Reverte, S.A. Barcelona España.
19-24 pp.
6. MADIGAN M y MARTINKO J. 1999. Brock Biología de los microorganismos.
Octava Edición. Edt Prentice Hall. Madrid España. 153-155 pp.
7. RAMÍREZ J y FERRAT G.2005. La fase estacionaria en la bacteria Escherichia
coli. Revista latinoamericana de Microbiología (ALAM). Vol 47 No 3-4. 92-101 pp.
 8. SCRAGG A. 2002 Biotecnología para ingenieros: Sistemas biológicos en procesos
tecnológicos. Edt Limusa. México. 283-314 pp.
9. KIRSOP B y SNELL, J.J S.1984. Maintenance of microorganisms. A manual of
laboratory methods, Edt Academic press, United States. Orlando Florida, 5-56, 83-
130 pp.
10. Introducción a la microbiología. (2007). Google Books.
https://books.google.es/books?
id=Nxb3iETuwpIC&printsec=copyright&hl=es&source=gbs_pub_info_r#v=onepage
&q=generaci%C3%B3n&f=false

6. PREGUNTAS

1. Describa las fases del crecimiento microbiano y explique qué ocurre en cada
una de ellas.
Cuando las bacterias se introducen en un medio líquido nuevo, la división celular no
puede comenzar inmediatamente: puede haber una fase de latencia inicial en la que
apenas se dan divisiones celulares. Durante la fase de latencia las células se están
adaptando al nuevo ambiente. La longitud de la fase de latencia dependerá
principalmente de las condiciones en que estaban las células antes de ser introducidas en
el medio. (4)

Una vez adaptadas las bacterias al nuevo medio, las células comienzan a crecer y
dividirse a una tasa que es máxima para la especie en las condiciones existentes, esta es
la fase logarítmica o fase exponencial, en esta fase las células de duplican a velocidad
constante. (5)

Por lo tanto, cuando un nutriente esencial del medio de cultivo se acaba, o algún producto
de desecho se acumula en el medio hasta alcanzar concentraciones inhibitorias del
crecimiento exponencial, la población entonces alcanza la fase estacionaria. En esta fase
no hay incremento neto o decremento del número de células. Sin embargo todavía
ocurren muchas funciones celulares, incluyendo el metabolismo energético y algunos
procesos biosintéticos. (6)

En esta fase disminuye el volumen celular y la forma se redondea, se engrosa la pared,

disminuye el número de flagelos y se incrementa la resistencia celular a condiciones
adversas. El metabolismo se reorganiza, se acumulan compuestos de reserva y aumenta
la degradación de macromoléculas (7).

Una vez que la mayoría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye
bruscamente, por lo que un número pequeño de sobrevivientes pueden persistir en cultivo
por meses o años. Dicha persistencia puede deberse a que las células consiguen crecer
gracias a los nutrientes liberados por las células que mueren y se lisan, observándose
recambio celular (8).
 2. ¿Qué factores afectan el crecimiento microbiano?

Estos se dividen en factores físicos y químicos, tales como:

 Temperatura: La falta de crecimiento a temperaturas bajas se debe a la reducción

de la velocidad de las reacciones bioquímicas y al cambio de estado de los lípidos
de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el
funcionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se
debe a la desnaturalización de proteínas y a las alteraciones producidas en las
membranas lipídicas a esas temperaturas (9).
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular es
lento y las células paran de crecer; aunque suelen morir. Sin embargo, cuando la
temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente y
las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la
temperatura (9).
 Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión
de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del
agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la
humedad relativa (HR) (8).
El valor de la actividad de agua da una idea de la cantidad de agua disponible
metabólicamente, un 80% o más de la masa de una bacteria es agua y durante el
crecimiento, los nutrientes y productos de desecho entran y salen de la célula, por
ello, las bacterias pueden crecer solo sobre materiales que tengan la adecuada
cantidad de agua libre (disponible) (5).

 pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada

tipo de microorganismo tiene un rango de pH en el que puede vivir
adecuadamente. La mayoría de las bacterias como Escherichia coli tienen su
óptimo de crecimiento a pH 7 (neutro), el pH interno se mantiene en un valor muy
cercano a 7,6 siendo el valor óptimo para su metabolismo. Escherichia coli, al igual
que la mayoría de las demás bacterias, pueden realizar reacciones metabólicas
vitales sólo dentro de un intervalo de pH limitado, porque muchas de sus enzimas
funcionan adecuadamente sólo en un intervalo estrecho de pH (5). El pH
intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en
muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de
una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana
citoplásmica. El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el rango
de 6,0 a 8,0(5).

 Oxígeno: Los microorganismos pueden ser divididos en diversos grupos

dependiendo del efecto del oxígeno. Los aerobios son capaces de crecer con
tensión de oxígeno total (21%) y muchos pueden soportar concentraciones más
altas (6). E. coli es un microorganismo que se encuentra dentro del grupo de los
aerobios facultativos, utilizando el oxígeno como aceptor final de electrones en la
 cadena respiratoria cuando está disponible, y en ausencia de oxígeno la energía la
obtienen por fermentación o respiración anaerobia (generalmente el NO3- es un
aceptor final de electrones) (4).

 Nutrientes: Los nutrientes pueden ser divididos en dos grupos 1) Macronutrientes

y 2) Micronutrientes, la mayoría de las bacterias requieren un compuesto orgánico
de algún tipo como fuente de carbono, tales como aminoácidos, ácidos grasos y
compuestos aromáticos. En peso seco, una célula consta de 50% de carbono y a
su vez este es el elemento mayoritario de las macromoléculas (6).

3. Explique el concepto de tiempo de generación

El tiempo de generación corresponde a su reproducción por fisión binaria, cuando el
número de células en cada generación se expresa como potencia de 2, el exponente
indica el número de duplicaciones (generaciones) que ha producido.(10)

El tiempo necesario para que una célula se divida se denomina tiempo de generación, la
mayoria de las bacterias tienen un tiempo de generación de 1-3 horas, otras requieren
alrededor de 24h o más (10).

4. Explique las formas de medir el crecimiento microbiano

Métodos indirectos
- Recuento en placa: En este método se toma una porción de muestra (por
ejemplo 10g), y se añade un volumen de diluyente (en este caso 90ml de
peptona tamponada).
Posteriormente, se siembra 1ml por cada dilución en duplicado, luego se
añade 15ml de medio de cultivo y se homogeniza revolviendo con cuidado la
placa.
Después de la siembra se toman las placas que tengan entre 30-300 colonias,
finalmente se hace la media del número de colonias presentes, esa media se
multiplica por 1000, el número resultante es equivalente a
unidades formadoras de colonias
gramos o mililitros

- Recuento de coliformes: Se diluye un volumen conocido de muestra hasta

obtener 3 series de 3 tubos, se toma 1ml de las diluciones y se incorporan a un
medio BGBL y se incorpora una campana de Durham.
Un tubo BGBL es positivo cuando hay turbidez y la campana es ocupada por el
10% de su volumen por gas. Al tener los resultados positivos se va a una tabla
donde se dará un número, como se mostrará en el ejemplo donde hay 5 tubos
positivos
Dilución Número de tubos positivos
1/10 2
1/100 2
 1/1000 1

Con estos resultados 2-2-1 una tabla los interpreta como el número 28, lo que
significa que hay 28 coliformes/ml de muestra

- Prueba cromogénica: Se filtran un poco más de 10mL de muestra diluida

sobre un filtro de membrana. A continuación la membrana se coloca sobre un
agar y se incuba en posición invertida.
En cuanto a las colonias, se observa cuales son positivas para la Beta-D-
galactosidasa que dan coloraciones rosadas a rojo, y cuales son positivas para
Beta-D-galactosidasa y la Beta-D-glucoronidasa los cuales adquieren una
coloración azul-violeta. Para hacer el recuento debe haber un número de
colonias entre 10-200 por filtro incubado, por lo tanto se haría la siguiente
operaciones para llevar a cabo el recuento.
∑ Coloniasrojo−rosadas+ ∑ Colonias de azuladas−violetas =Recuentode coliformes
Volumen de muestra filtrada

∑ Colonias de azuladas−violetas =Recuento de E .coli

Volumen de muestra filtrada

- Recuento con hematocitómetro: Es un método directo donde se cuentan el

número de células viables con un hematocitómetro haciendo uso de un
microscopio, por este método las células adquieren una coloración azulada
que contrasta con el fondo, gracias a eso se pueden contar el número de
células, es válido aclarar que en dicho hematocitómetro cabe un volumen
exacto de muestra.
Finalmente, al terminar el conteo se hace el siguiente cálculo

Células
=Promedio de células por cuadro∗Factor de dilución∗10 4
mililitro

5.Teniendo en cuenta la USP-37, en el capítulo 85 “PRUEBA DE ENDOTOXINAS

BACTERIANAS”, ¿cuáles son los métodos que se utilizan para la detección de
endotoxinas?, y de ellos, explique uno.
Se dividen en técnicas de coagulación y técnicas de fotométricas cuantitativas
En la primera, se hace uso del lisado de amebocitos obtenido a partir de un lisado de
amebocitos (leucocitos) del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus
tridentatus). La concentración mínima de endotoxina requerida para hacer que el lisado se
coagule en las condiciones estándar es la sensibilidad declarada del lisado empleado
como reactivo.
Es importante confirmar la sensibilidad del lisado para poder detectar la presencia de
endotoxinas, este lisado al momento de entrar en contacto con una muestra, procede a
ser cultivado, si este cultivo forma un gel, cuya integridad mostrará si hay presencia o no
de endotoxinas.

6. Realice un cuadro comparativo indicando el límite de microorganismos

permitidos para tres productos estériles y tres productos no estériles, teniendo en
cuenta la USP-37.

Producto Productos estériles Productos no estériles

Microrganismos Hongos
aerobios filamentosos y
levaduras
Uso cutaneo 10 2
UFC/g o ml 101UFC/g o ml Ausencia de microrganismos
Uso nasal 102UFC/g o ml 101UFC/g o ml Ausencia de microrganismos
Uso rectal 103UFC/g o ml 102UFC/g o ml Ausencia de microrganismos