Cromatografía

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Cromatógrafo de gases
Colector automático de fracciones y de muestras para la cromatografía.

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de

mezclas complejas cuyo objetivo es separar los distintos componentes, la cual tiene
aplicación en todas las ramas de la ciencia; en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos dan como
resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una
separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la
mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan
ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En
este caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.

Índice

1 Historia
2 Clasificación de los métodos de separación en cromatografía
3 Términos empleados en cromatografía[3]
4 Véase también
5 Referencias
6 Enlaces externos

Historia

La cromatografía, (proviene del griego χρῶμα chrōma y γράφω gráphō, que significan
respectivamente "color" y "escribir, registrar", literalmente "escritura de color",
o "registro de color") , fue empleada originalmente con sustancias coloreadas.

Ya en 1850, Runge describió la formación de zonas coloreadas cuando se depositaban

gotas de sustancias colorantes sobre papel secante, pero el desarrollo más
importante vino con los experimentos de Mijaíl Tsvet1 (1872-1919), que empleó por
primera vez en 1906 el término "cromatografía". A comienzos del año 1903, Mijaíl
Tsvet, botánico ruso, logró separar una mezcla de pigmentos de plantas (clorofilas)
en una columna de carbonato de calcio. Más tarde, en 1910, cromatografió un
extracto de yema de huevo en una columna de inulina. Sus investigaciones, sin
embargo, no fueron utilizadas por otros investigadores hasta 1931. Esta demora
quizá se debió al hecho de que los trabajos de Tsvet fueron publicados en ruso y en
una revista que no tenía amplia circulación.

El rápido desarrollo de la cromatografía como herramienta analítica sensible no

ocurrió hasta 1931, cuando Kuhn, con Lederer y con Winterstein, empleó la técnica
para el análisis de pigmentos de plantas, confirmando los primeros trabajos de
Tsvet y su predicción de que el caroteno no era una sola sustancia, sino una mezcla
de varios homólogos estrechamente relacionados. Al mismo tiempo, el tamaño de las
columnas empleadas fue aumentando para poder recuperar los componentes separados.
La técnica, por lo tanto, no era solo analítica sino preparatoria.

Por aquel entonces la cromatografía en columna tenía aplicaciones limitadas, dado

que los componentes que se podían separar eran invariablemente lípidos. Pasaron 10
años antes de que Martin y Synge desarrollaran una técnica mediante la cual se
pudieran separar compuestos acuosos o hidrofílicos. Esto marcó un nuevo interés en
la técnica y en 1944 Consden, Gordon y Martin lograron separar mezclas complejas de
aminoácidos en papel y fueron premiados con el Premio Nobel por sus trabajos. Al
poco tiempo, en 1947, en Estados Unidos de Norteamérica, la Comisión de Energía
Atómica dio a conocer información sobre el uso de la cromatografía de intercambio
iónico para la separación de productos de fisión nuclear.

El desarrollo más reciente en el campo de la cromatografía se deriva de los

trabajos de Stahl, quien en 1956 presentó una técnica práctica mediante la que una
capa delgada sílice gel, celulosa o alúmina era diseminada sobre una placa de
vidrio. Esta técnica, llamada cromatografía de capa fina, resultó en un análisis
más rápido y más sensible para el examen de mezclas complejas y, en muchos casos,
ha sustituido a otros métodos similares más antiguos de cromatografía en papel
toche.

En 1959, Porath y Flodin introdujeron una nueva técnica llamada cromatografía de

filtración de gel. Esta se ha convertido en una nueva y poderosa herramienta para
la separación de sustancias de alto peso molecular, particularmente las proteínas,
y ha encontrado muchas aplicaciones en los campos de la bioquímica, la medicina, la
fisiología y la biología. La mayoría de las técnicas de filtración en gel utilizan
columnas y recientemente se han hecho trabajos con una combinación de filtración en
gel y materiales de intercambio iónico, logrando que las separaciones complejas
sean extremadamente rápidas y eficientes.

Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados

del siglo XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC High
Performance Liquid Chromatography, en inglés) comenzó a desarrollarse en los años
1960, aumentando su importancia en las décadas siguientes, hasta convertirse en la
técnica cromatográfica más empleada. Sin embargo esto se irá modificando con el
paso de los años.
Clasificación de los métodos de separación en cromatografía

Las distintas técnicas cromatográficas2 pueden dividirse según cómo esté dispuesta
la fase estacionaria:

Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o

sobre un papel. Las principales técnicas son:
Cromatografía en papel
Cromatografía en capa fina
Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.
Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:
Cromatografía de líquidos
Cromatografía de gases
Cromatografía de fluidos supercríticos

La cromatografía de gases se aplica a numerosos compuestos orgánicos. En el caso de

compuestos no volátiles, se recurre a procesos denominados de "derivatización", a
fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilicen en las condiciones de
análisis.

Dentro de la cromatografía líquida, destaca la cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC, del inglés High Performance Liquid Chromatography), que es la
técnica cromatográfica más empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad
de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carácter no polar, y la fase
móvil posee carácter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporción de
la misma o de otros disolvente polares, como por ejemplo, metanol). El nombre de
"reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta
de sílice o alúmina, de carácter polar, y por tanto la fase móvil era un disolvente
orgánico poco polar. Una serie eluotrópica es un rango de sustancias de diferentes
polaridades que actúan como fase móvil y que permiten observar un mejor
desplazamiento sobre una fase estacionaria.
Separación de clorofilas mediante cromatografía en papel.
Tipos Fase móvil Fase estacionaria
Cromatografía en papel Líquido Papel de celulosa.
Cromatografía en capa fina Líquido Gel de sílice o alúmina.
Cromatografía de gases Gas Columnas capilares de sílice fundida, con
recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados, columnas
empaquetadas con tierras diatomeas hechas de tubos de vidrio o metal.
Cromatografía líquida
en fase reversa Líquido (polar) Relleno de siloxano de octilo o siloxano de
octadecilo.
Cromatografía líquida
en fase normal Líquido
(menos polar) Relleno de sílice, alúmina o un soporte al que se unen
químicamente grupos polares (ciano, amino, etc).
Cromatografía líquida
de intercambio iónico Líquido (polar) Resinas de intercambio iónico.
Cromatografía líquida
de exclusión Líquido Relleno de pequeñas partículas de sílice o polímeros
con red de poros uniforme.
Cromatografía líquida
de adsorción Líquido Partículas finamente divididas de sílice o de
alúmina.
Cromatografía de
fluidos supercríticos Líquido Columnas abiertas de sílice fundida con
recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces
cruzados.
Términos empleados en cromatografía3

Analito es la sustancia que se va a separar durante la cromatografía.

Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un
líquido (cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un
fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La muestra que se
está separando/analizando (formada de analito/s y el disolvente) se inyecta en la
fase móvil que se mueve a través de la columna. En el caso de la cromatografía
líquida de alta resolución, HPLC, la fase móvil es un disolvente no polar como el
hexano (fase normal) o bien algún disolvente polar (cromatografía de fase reversa).
Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición durante la
cromatografía. Un ejemplo es la capa de gel de sílice en la cromatografía en capa
fina.
Cromatografía analítica se emplea para determinar la existencia y posiblemente
también la concentración de un analito en una muestra.
Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las
partículas de soporte o a las paredes internas de la columna.
Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de
separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden
a los componentes de la mezcla separada.

Cromatograma con picos no resueltos (separados).

Cromatograma con dos picos resueltos.

En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal
(obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas
o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada
por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema
óptimo, la señal es proporcional a la concentración del analito específico
separado.
 Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por ejemplo,
un cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.
Cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes que
se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria
(fase estacionaria) mientras la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección
definida.
Eluyente es la fase móvil que atraviesa la columna.
Serie eluotrópica es una lista de disolventes clasificados según su poder de
dilución.
Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre
partículas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografía líquida en fase reversa para

compuestos fenólicos

Cromatografía preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de

sustancia para un uso posterior, más que para análisis.
Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito particular
en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo
las condiciones fijadas. Véase también: Índice de retención de Kovats
Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografía. Puede
consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es
tratada en el curso del análisis, la fase o fases que contienen los analitos de
interés es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya
separación no resulta de interés es llamada residuo.
Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la
fase móvil líquida en cromatografía de líquidos.
Capacidad de carga Es la cantidad máxima de muestra que puede ser separada en
una sola carga.
Capacidad de fraccionamiento Es el número máximo de componentes que pueden ser
separados en una sola operación.
Selectividad Es la capacidad de poder discriminar y distinguir entre dos
componentes