UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NÚCLEO DE SUCRE
ESCUELA DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
BIOQUÍMICA

ENZIMAS

PROFESORA: INTEGRANTES:
MAJ BRITT MOSTUE ROSMAIRA MARTÍNEZ
C.I.: 23.945.964
JUSMERLIN NÚÑEZ
C.I.:20.065.937

CUMANÁ, MARZO DE 2014

 INTRODUCCIÓN

En todo ser vivo se producen constantemente innumerables reacciones

químicas. Muchas de ellas tienden a transformar las sustancias introducidas con
los alimentos a fin de obtener energía y materia prima para la síntesis de nuevas
estructuras moleculares. Las reacciones químicas se llevan a cabo a gran
velocidad en los seres vivientes gracias a la acció n de las enzimas.

Las enzimas son catalizadores bioló gicos de naturaleza proteica,

producidas por las células de los organismos vivos. Como todo catalizador,
actú an disminuyendo la energía de activació n de una reacció n. Segú n Michaelis y
Menten, el mecanismo seguido en las reacciones enzimá ticas inicia con la
formació n de un complejo intermedio enzima – sustrato. Una característica de
las enzimas es su gran actividad y especificidad frente a un sustrato dado. La
actividad enzimá tica es afectada por una serie de factores externos e internos, en
los que se encuentran la temperatura, el pH, la fuerza ió nica, la concentració n del
sustrato, de la enzima, del producto e inhibidores.

Aunque las enzimas son esencialmente proteínas, muchas só lo pueden

realizar su funció n catalítica en asociació n con otra molécula no proteica,
denominada cofactor, que puede ser un ion metá lico o moléculas orgá nicas. A
estas ú ltimas se les llama coenzimas y una gran parte de ellas son vitaminas. El
sistema completo se conoce como holoenzima y la parte proteica, apoenzima.
Por otro parte, hay enzimas que se producen en el organismo como proenzimas
y requieren de algú n rearreglo en su estructura para ser activa.

Esta prá ctica tuvo dos objetivos principales. El primero de ellos fue la
identificació n de algunas enzimas mediante pruebas cualitativas y el segundo, el
estudio cinético de una reacció n enzimá tica, considerando el efecto del pH, la
temperatura y las concentraciones de la enzima y el sustrato.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Práctica 1: Pruebas iniciales

Se realizaron varias pruebas cualitativas con el fin de detectar la actividad

de tres enzimas: la amilasa, la ureasa y la catalasa. Los resultados obtenidos en
cada prueba se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 1. Identificació n de enzimas.

Muestra Reactivos Observación Conclusión
Ureasa Biuret Coloració n azul Resultado erró neo
Ureasa y Presencia de
Urea Color rojo fucsia
rojo de fenol amoníaco
Color violeta con Presencia de
Extracto de papa Biuret
precipitado azul proteína
Peró xido de Formació n de Producció n de
Extracto de papa
hidró geno burbujas oxígeno
Almidó n e ioduro No se observaron
Saliva Error experimental
de potasio cambios

El reactivo de biuret contiene CuSO4 en solució n acuosa alcalina. Esta

prueba se basa en la formació n de un complejo de coordinació n entre los iones
Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitró geno que forma parte de
los enlaces peptídicos. El complejo formado es de color violeta e identifica la
presencia de péptidos y proteínas. Cuando la prueba es negativa, la solució n
posee coloració n azul, característica de los iones Cu2+.

La ureasa es una enzima de estructura proteica que cataliza la hidró lisis

de la urea a dió xido de carbono y amoníaco. Al ser una proteína, es de esperarse
que la prueba de biuret resultara positiva, pero la coloració n resultante fue azul
(ver figura 1, en anexos). El color azul no, necesariamente, indica la ausencia de
proteínas; es posible que existan sustancias interferentes en la muestra que
impidan que se produzca la reacció n o que las proteínas se hallen a una
concentració n inferior al límite de sensibilidad del método.

La reacció n de hidró lisis de la urea, catalizada por la ureasa, es la

siguiente:

CO ( NH ¿¿ 2)2+ H 2 O →2 NH 3 +CO 2 ¿ (1)

El amoníaco, por ser una base débil puede ser detectado con un indicador
á cido – base. En esta prá ctica se usó rojo de fenol, que vira de amarillo a rojo
fucsia en pH 8. Como era de esperar, el color rojo fucsia obtenido (ver figura 2)
es indicativo de que la hidró lisis fue llevada a cabo bajo la acció n catalítica de la
ureasa; sin la enzima, esta reacció n es indetectable.

Las dos pruebas siguientes fueron realizadas al extracto acuoso de una

papa. En primer lugar, resultó de la prueba de biuret una coloració n violeta (ver
figura 3), concluyéndose que hay presencia proteínas en esta muestra.
Posteriormente, se mezcló el extracto de papa con peró xido de hidró geno, a fin
de comprobar la presencia de la catalasa. É sta es una enzima que se encuentra
en todos los organismos vivos, a excepció n de algunos microrganismos
anaeró bicos, y cuya funció n es catalizar la descomposició n del peró xido de
hidró geno, siguiendo la reacció n:

2 H 2 O 2 → 2 H 2 O+O 2 (2)
En esta prueba, no se observaron cambios de color en la muestra, sino
que se pudo notar la formació n de algunas burbujas (ver figura 4), lo que podría
ser consecuencia de la producció n de oxígeno.
 La ú ltima prueba que se realizó se emplea para identificar la amilasa, que
es una enzima producida principalmente en las glá ndulas salivales y en
el pá ncreas, cuya funció n es catalizar la ruptura de los enlaces glucosídicos
del almidó n para formar azú cares simples. Esta reacció n sigue varias etapas:

almidón(azul ) → alodextrina (azul ) →eritrodextrina(rojo) →acroodextrina(incoloro) → maltosa(incoloro)

Los colores en el subíndice corresponden con los que toma la mezcla de

reacció n en cada etapa al añ adir gotas de ioduro de potasio. É sta se conoce como
la prueba del iodo, se usa para determinar la presencia o alteració n del almidó n
y es el resultado de la formació n de cadenas de poliyoduro a partir de
la reacció n del almidó n con el iodo presente en la solució n.

En la prá ctica, se colocaron sobre un vidrio de reloj varias gotas de KI y se

añ adieron, en pequeñ os intervalos de tiempo, gotas de una solució n recién
preparada de saliva y almidó n. No se observó ningú n cambio, por lo se pensó
que la saliva usada contenía esta enzima en baja concentraciones, repitiéndose la
prueba usando la saliva de otra persona. Finalmente, se constató con los demá s
grupos de estudiantes que la prueba no resultaba positiva, por lo que se
concluye que tal vez el almidó n o el KI usados estaban dañ ados.

Práctica 2: Estudio cinético de la catalasa

 Como se dijo en la discusió n de la prá ctica anterior, de las pruebas
iniciales, la catalasa se encuentra en casi todos los organismos vivos. En esta
oportunidad, se hizo el estudio cinético de la catalasa contenida en la sangre
humana, considerando los efectos sobre la actividad de esta enzima de algunos
factores, como las variaciones de concentració n de enzima y sustrato, así como
los cambios de pH y temperatura.

El estudio cinético se hizo a partir de la cantidad de peró xido de

hidró geno gastado. Para ello, se realizó una valoració n redox con permanganato
de potasio del H2O2 en solució n después de 5 min de reacció n. Esta valoració n
sigue la ecuació n:

5 H 2 O 2 +2 KMnO 4+ 4 H 2 S O 4 → 2 MnS O 2 +2 KHS O4 +5 O 2+ 8 H 2 O (3)

En cada una de las reacciones, el á cido sulfú rico, ademá s de acidificar la

solució n para la posterior valoració n redox, actú a como inhibidor de la catalasa.
Por cada variable considerada, se analizaron de 8 a 10 muestras, donde las
muestras de nú meros impares fueron tomadas como blanco y las de nú meros
pares, reacciones enzimá ticas. Por esta razó n el H2SO4 es añ adido antes que la
catalasa en las soluciones de nú meros impares y después de 5 min, en las de
nú meros pares.

La primera variable considerada fue la concentració n de la enzima, cuyos

datos se presentan en la siguiente tabla:
Tabla 2. Datos del efecto de la concentració n de la enzima.
VolKMnO4 nsol,H2O2 ncat,H2O2
Volumen de reactivo (ml) 0,05 mol/L
(ml) (µmol) (µmol)
N°
(1) (2) (3) (4) (5)
H2O2 H2SO4 H2O Catalasa H2SO4 3
0,05 mol/L 3 mol/L 3 mol/L
1 5,0 3,0 11,0 1,0 - 2,5 312,5 212,5
2 5,0 - 11,0 1,0 3,0 0,8 100,0
3 5,0 3,0 10,0 2,0 - 2,2 275,0 262,5
4 5,0 - 10,0 2,0 3,0 0,1 12,5
5 5,0 3,0 8,0 4,0 - 2,3 287,5 275,0
6 5,0 - 8,0 4,0 3,0 0,1 12,5
7 5,0 3,0 6,0 6,0 - 2,3 287,5 275,0
8 5,0 - 6,0 6,0 3,0 0,1 12,5
9 5,0 3,0 0,0 12,0 - 2,3 287,5 262,5
10 5,0 - 0,0 12,0 3,0 0,2 25,0

La variable nsol,H2O2 es la cantidad de peró xido en solució n después de 5

min de reacció n y ncat,H2O2, la cantidad de peró xido que reacciona como
consecuencia de la actividad de la catalasa, el decir, la diferencia entre los n sol de
las muestras catalizadas y los blanco.

Para observar la tendencia de la actividad enzimá tica frente a la variació n

de su propia concentració n, se realizó una grá fica de ncat en funció n de los
volú menes de la solució n de catalasa añ adidos, considerando que es difícil
conocer la concentració n exacta de la enzima y, ademá s, que la concentració n es
proporcional al volumen añ adido, por lo que la forma de la grá fica sería la
misma.
 280.0

270.0

260.0
ncat (µmol)

250.0

240.0

230.0

220.0

210.0
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0
Volcatalasa (ml)

Grá fica 1. Efecto de la concentració n de la catalasa sobre la descomposició n de H2O2.

En la grá fica 1, se observa un aumento progresivo de la actividad de la

catalasa, hasta alcanzar un má ximo en el que se hace má s o menos constante.
Esta es la tendencia esperada, ya que al aumentar la concentració n de la enzima,
manteniendo constante, pero en exceso, la concentració n del sustrato, se
obtiene una relació n directa y lineal, pero al acabarse el exceso de sustrato, la
rapidez dependerá de la concentració n de éste.

El segundo factor considerado en el estudio cinético, fue la variació n de la

concentració n del sustrato. Los datos y resultados se presentan a continuació n:
 Tabla 3. Datos del efecto de la concentració n del sustrato.
VolKMnO4 [H2O2]
nsol,H2O2 ncat,H2O2
Volumen de reactivo (ml) 0,05 mol/L (mmol/L
(ml) (mmol) (mmol)
)
N°
(1) (2) (3) (4) (5)
H2O2 H2SO4 H2O Catalasa H2SO4 3
0,05 mol/L 3 mol/L 3 mol/L
1 10,0 3,0 0,0 4,0 - 29,8 3,7 3,6 50,0
2 10,0 - 0,0 4,0 3,0 1,0 0,1
3 7,5 3,0 2,5 4,0 - 24,5 3,1 2,5 37,5
4 7,5 - 2,5 4,0 3,0 4,4 0,6
5 5,0 3,0 5,0 4,0 - 15,5 1,9 1,5 25,0
6 5,0 - 5,0 4,0 3,0 3,0 0,4
7 2,5 3,0 7,5 4,0 - 9,0 1,1 1,0 12,5
8 2,5 - 7,5 4,0 3,0 1,0 0,1
9 1,0 3,0 9,0 4,0 - 3,9 0,5 0,5 5,0
10 1,0 - 9,0 4,0 3,0 0,3 0,0

50.0
45.0
40.0
35.0
ncat (µmol)

30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
[H2O2] (mmol/L)

Grá fica 2. Efecto de la concentració n del sustrato sobre la descomposició n del H2O2.

A concentración fija de la enzima y concentraciones crecientes del sustrato, se

obtiene una curva en la que, al principio, la velocidad de la reacción aumenta
proporcionalmente a la concentración del sustrato y luego decrece progresivamente
hasta que permanece constante porque la enzima se ha "saturado" con el sustrato. En
la gráfica 2 se puede observar una relación más o menos lineal. Es posible que las
medidas realizadas se encuentren dentro del rango de concentraciones en los que el
crecimiento de la velocidad es lineal.

El tercer factor es el del pH, mostrá ndose los datos y resultados a

continuació n:

Tabla 4. Datos del efecto del pH.

Volumen de reactivo (ml)
(3)
VolKMnO4 nsol,H2O2 ncat,H2O2
(1) (2) (4)
N° 0,05 mol/L pH
H2O2 H2SO4 Catalasa H2SO4 3 (µmol) (µmol)
(ml)
0,05 mol/L 3 mol/L 3 mol/L
1 5,0 3,0 4,0 - 2,8 350,0 -87,5 3
2 5,0 - 4,0 3,0 3,5 437,5
3 5,0 3,0 4,0 - 3,4 425,0 -112,5 5
4 5,0 - 4,0 3,0 4,3 537,5
5 5,0 3,0 4,0 - 4,8 600,0 -87,5 7
6 5,0 - 4,0 3,0 5,5 687,5
7 5,0 3,0 4,0 - 6,1 762,5 62,5 9
8 5,0 - 4,0 3,0 5,6 700,0
 60.0
40.0
20.0
0.0
ncat (µmol)

-20.0
-40.0
-60.0
-80.0
-100.0
-120.0
3 4 5 6 7 8 9
pH

Grá fica 3. Efecto del pH sobre la descomposició n catalizada de H2O2.

Los cambios de pH afectan profundamente el carácter iónico de los grupos

funcionales de la enzima y, por lo tanto, alteran la conformación de la proteína y con
ello, el sitio catalítico. Además de los efectos puramente iónicos, los valores altos o
bajos de pH provocan la desnaturalización de la enzima. El pH óptimo, aquel donde
la actividad es mayor, para la catalasa es de 7,6, que debería ser el punto máximo de
una gráfica acampanada. Sin embargo, la gráfica 3 no tiene esta forma, sino una curva
creciente que, incluso, posee valores negativos. Es posible que el pH ácido aumente
enormemente la velocidad de reacción no catalizada frente a la enzimática o, bien,
que sea consecuencia de errores experimentales. Asimismo, se puede considerar que
la enzima se desnaturalizó desde el inicio del experimento como consecuencia del
bajo pH.
 El cuarto y último factor considerado es el de la temperatura. En seguida se
muestran los datos y resultados obtenidos en la práctica:

Tabla 3. Datos del efecto de la temperatura.

Volumen de reactivo (ml)
VolKMnO4 nsol,H2O2 ncat,H2O2
(1) (2) (3) (4) T
N° 0,05 mol/L
H2O2 H2SO4 Catalasa H2SO4 3 (µmol) (µmol) (°C)
(ml)
0,05 mol/L 3 mol/L 3 mol/L
1 5,0 3,0 4,0 - 1,9 237,5 87,5 8
2 5,0 - 4,0 3,0 1,2 150,0
3 5,0 3,0 4,0 - 0,4 50,0 25,0 24
4 5,0 - 4,0 3,0 0,2 25,0
5 5,0 3,0 4,0 - 0,2 25,0 12,5 52
6 5,0 - 4,0 3,0 0,1 12,5
7 5,0 3,0 4,0 - 0,2 25,0 12,5 90
8 5,0 - 4,0 3,0 0,1 12,5

90.0

80.0

70.0

60.0
ncat (µmol)

50.0

40.0

30.0

20.0

10.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
T (°C)

Grá fica 3. Efecto de la temperatura sobre la descomposició n catalizada de H2O2.

 Las enzimas, a temperaturas bajas, muestran un aumento de su actividad
al incrementar la temperatura, pero a altas temperaturas sufre
desnaturalizació n térmica y la velocidad de la reacció n disminuye. La grá fica de
la velocidad frente a la temperatura debería ser una curva en forma de campana.
El incremento de la velocidad al acercarse la temperatura ó ptima se debe a una
mayor energía cinética del sustrato. Por encima de ésta, la velocidad de reacció n
decrece por desnaturalizació n de la enzima.

La forma de la grá fica 4 no corresponde con la esperada, sino que se

observa un decrecimiento progresivo y, luego, un comportamiento lineal
constante. Esto puede ser como consecuencia de la competencia catalizadora
entre la enzima y el incremento de la temperatura, es bien sabido que este
ú ltimo aumenta la velocidad de reacció n. Asimismo, también podría ser causado
por errores experimentales.

Otro error a considerar en esta prá ctica, es la dificultad de mantener la

temperatura constante durante la reacció n, puesto que las condiciones del
laboratorio no está n dadas para esto.

En general, los resultados serían má s exactos si se hiciera un estudio

cinético má s amplio, con mayor nú mero de muestras. Ademá s, serían má s
precisos con el uso de instrumentos de mayor precisió n, en especial la bureta
empleada para la valoració n redox; la dilució n del patró n de permanganato de
potasio sería, también, una buena opció n.
 CONCLUSIONES

 Para la ureasa, la prueba de biuret resultó negativa, esperá ndose que

fuera positiva por la naturaleza proteica de esta enzima. El color azul no,
necesariamente, indica la ausencia de proteínas, es posible que haya
interferencias o que su concentració n sea muy baja. Sin embargo, en la
siguiente prueba se comprobó la catalizació n de la hidró lisis de la urea,
mediante la detecció n del amoníaco producido, con rojo de fenol.

 Se comprobó , con la prueba de biuret, que el extracto de papa posee

alguna proteína y en el ensayo posterior se observó que, al añ adir
peró xido de hidró geno, se formaron burbujas, posiblemente como
consecuencia de la descomposició n catalizada de éste. Con estas pruebas,
se observó , entonces, que el extracto de la papa contenía la enzima
catalasa.

 En ú ltima prueba realizada, para identificació n de la amilasa en la saliva,

no se observó ningú n cambio, concluyéndose que, tal vez, alguno de los
reactivos usados estaba dañ ado.

 Finalmente, en el estudio cinético de la catalasa, las grá ficas obtenidas

para las variaciones de concentració n de la enzima y el sustrato, se
aproximan a las esperadas, no así para las grá ficas en funció n del pH y la
temperatura.
 RECOMENDACIONES

 En general, se recomienda manejar con cuidado cada una de las muestras

analizadas y los reactivos empleados, ademá s de comprobar que estos
ú ltimos no se encuentran dañ ados.

 Para el estudio cinético de la reacció n enzimá tica, se recomienda analizar

un nú mero considerable de muestras, a fin de aumentar la exactitud de
los resultados. Asimismo, para aumentar su precisió n, se deberían usar
buretas de menor apreciació n en la valoració n redox o, bien, disminuir la
concentració n del patró n.
 BIBLIOGRAFÍA

Blanco, A. 2007. Química Biológica. 8 ª ed. El Ateneo. Buenos Aires.

McMurry, J. 2008. Química Orgánica. 7ª ed. CENGAGE Learning. D.F.

McKee, T. y McKee, J. 2003. Bioquímica: La Base Molecular de la Vida. The

McGraw – Hill. Madrid.

Mostue, M. 1999. Guía para la Asignatura Teórico – Práctica Bioquímica (010-

4614) de la Licenciatura en Química. Departamento de Química, Nú cleo
Sucre, Universidad de Oriente. Cumaná .

Pachecho, D. 2001. Bioquímica Estructural y Aplicada a la Medicina. Instituto

Politécnico Nacional IPN. D.F.