PCR

PREVIA SECUENCIACIÓN PARA SABER QUE SE VA A AMPLIFICAR

REACTIVOS NECESARIOS

 ADN molde
 Oligonucleotidos (primers)
 DNA polimerasa (amplifica y elonga la secuencia)
 dNTP´S ( desoxi-trifosfatados)
 Mg+
 Agua ultrapura
 Otros

ETAPAS

 DESNATURALIZACIÓN

“porque el ADN pierde su estructura bicatenaria” (cuando el ADN es sometido a temperaturas

muy altas) 1min 94°C

30-40 CICLOS (FUNCIÓN AL TAMAÑO DEL AMPLICON) 95°/5’

 HIBRIDACIÓN (cebadores sentido y antisentido) 45sg a 54° C

Unión de los cebadores (oligos) por COMPLEMENTARIEDAD (indispensable para el

reconocimiento de la secuencia) si la complementariedad no se da no se amplifica la secuencia
que no se quiere.

Diseño de cebadores es importante (se sacan de la base de datos, por info referenciada de
muchos artículos)

T° de Melking (T° a la cual el ADN se desnaturaliza o rehibrida en un 50%) la da la composición

de las bases nitrogenadas de los cebadores, por lo gral si le sumas 5° (temperatura de
hibridación)

 EXTENSION 2min a 72°C (T° estable, óptima a la t en la que actúa la DNA polimerasa)
mayor posesividad

Depende de la naturaleza de la polimerasa

Solo dNTP´S

 DNA a amplificar (diana)

 Primers (18-25 nts) afectados por el porcentaje de GC (mayor a 50%)
1. Reconocimiento de cebadores (sustentado en una T° de elongación, a medida que sube la
T° se vuelve más específica y da la característica HOT START)
 ESPECIFICIDAD: nace en la capacidad de polimerizar de la polimerasa.
Reduce: amplificaciones inespecíficas, aumenta rendimiento, PCR de alto rendimiento.
 HOT START: arranque caliente, una forma de inhibir su sitio activo y que asegura
que la ADN polimerasa polimerice en la T° optima a mayor rendimiento y mayor
capacidad.
T° estándar (72) en HOT START. Evita amplificaciones que no son deseadas y hace
específica la amplificación

2. Dependerá de la especie en que se obtenga.

m.o modelos (E. coli) que producen por biología molecular estas enzimas, sin tener el m.o
silvestre.
3. Actividad correctora en función de la concentración del ADN de plantilla que se pone
4. Velocidad de copia de la enzima, (rango de amplificación)
Capacidad de ampliar una amplificación (de soportar más tiempos sobre las secuencias
para amplificar secuencias más largas)
Se mide en tiempo (cuanto tiempo demora unida al molde)
Capacidad de amplificar secuencias de diferentes tamaños lo da la posesividad, porque si
es alta puede correr más tiempo en la misma hebra
5. Evitar y producir errores (equivocar base nitrogenada)
6. Función de la longitud de extensión del amplicon (tamaño de amplicon a obtener)
7. Ciertas enzimas características de estas
8. Enzimas capaces de tomar las bases y ampliarlas (aisladas de m.o que dentro de su
genoma son ricos en GC)
 Las bajas concentraciones de los dNTP´S es que afecta la capacidad elongativa de la
polimerasa, es una reacción que ocurre en un orden exponencial (por ende la baja
concentración agotaría en menor número de ciclos la cantidad de dNTP’S disponible)
haciendo que la polimerasa pierda eficiencia (no amplifique y cometa errores), la
concentración de los dNTP’S juega un papel importante en conjunto con la concentración del
MgCl puesto que la solución en la que se preparan los dNTP’S tiene MgCl (falta de
catalizador o inductor para las polimerasas).

OPTIMIZACIÓN DE LAS PCR

MUESTRA DE ADN

 INTEGRIDAD DEL ADN: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo

que queremos amplificar. (podemos incurrir en anillamientos inespecíficos,
romper secuencia diana y no obtener un amplicon)
 Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra no debe llevar agentes
quelantes (EDTA) que reducen la concentración de iones de Mg en la disolución,
tampoco debe haber determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes… que
inhibirían la actividad de la polimerasa. (Elementos que inhiben la polimerasa)
 Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificación
de ADN genómico de copia única, se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de
zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng. El mínimo oscila entre
10-100 ng y el máximo entre 400-500 ng.
DISEÑO DE LOS INICIADORES (CEBADORES, OLIGOS)

 COMPLEMENTARIEDAD
 Ser secuencia diana (estudio informático de la secuencia para reconocerla) siempre de 5’ a
3’
 Normalmente de un tamaño de 15-30 nucleótidos. Óptimo de 18 a 22nucleotidos
 El contenido en GC 40-60% con una distribución uniforme. La relación máxima de
purinas/pirimidinas será 60%/40%
(EL TAMAÑO Y EL GC% ESTABLECEN UNA CONDICION QUE ES LA TEMPERATURA DE
MELKING (MAYOR TAMAÑO MÁS DIFICIL EL ANILLAMIENTO Y POR ENDE SE DIFICULTA
TENER UN AMPLICON QUE PUEDA SER OBTENIDO EN CANTIDADES SUFICIENTES)
El %GC se debe a la secuencia que buscas
 Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base o repeticiones palindrómicas
porque harían que el cebador se auto complemente.
 No seleccionar cebadores que en su extremo 3’ tenga una importante estructura
secundaria, que se autoanille.
 Se recomiendo que el extremo 3’ no tenga riqueza GC, pero se requiere una G o C para
favorecer la extensión.
 Se debe evitar la complementariedad (self-dimer) entre la pareja de iniciadores. Si esta
existe entre los extremos 3´, existe la posibilidad de que se formen dímeros.
 La Tm de los cebadores con una secuencia máxima de 5 ° entre ellos. Generalmente oscila
entre los 55 y 65° C
Tm= 4 (G+C)+2 (A+T) O Tm = ( G+C) + 2 (A+T)

Se debe poner a punto los dNTP’S de tal forma que eviten modificar las concentraciones del MgCl
o no disponer de la cantidad de los mismos.

DEOXINUCLEOTIDOS TRIFOSFATO (dNTP’S)

 La concentración de los deoxinucleotidos (dNTP’S) debe ser igual para los 4 y debe ser la
más baja posible para que nos permita conseguir la cantidad de ADN necesaria.
 Son cuatro: d ATP, d GTP, d CTP y d TTP, 20-200 uM.
 Los dNTP’S pueden captar Mg++, por tanto sus concentraciones, deben guardar siempre la
misma relación. Se aconseja que la concentración de Mg++ sea mayor en 0,5 a 1,0 mM.

Los dNTP’S pueden captar el MgCl, vienen listos para ser usados. Ayudan al desplazamiento de
la polimerasa.

AMORTIGUADOR DE LA REACCIÓN

Usados para mejorar el desplazamiento de la polimerasa en el molde.

 MgCl2 aumenta la temperatura de hibridación de ADN.
 Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de reacción bajando la
fidelidad y a bajas concentraciones aumenta la fidelidad.

 Por lo gral está formado por: 100mM tris-HCl (pH = 8,3), 500 mM KCl, 0,1% w/v
gelatina y 1,5 mM MgCl2.
 Adyuvantes: aumentar la especificidad y fidelidad de la polimerasa
 El dimetilsulfóxido (DMSO) 2-10% contribuye a la disminución de la estructura
secundaria del ADN y amplificar regiones ricas en GC.
 Tween 20, Laireth 12 (0,1%) o Tritón X-100 (a,1-1%), estabilizan la enzima
 Formamida: estabiliza estructura DNAss 1 al 5%
 Seroalbúmina bovina (BSA) a 0.8 ug/ul secuestra iones
 Polietilenglicol (PEG), glicerol.

Aunque son prescindibles.

CONTAMINACIÓN EN LA PCR

 En el caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben

extremar al máximo:
 Lugar físico exclusivo para realizar PCR
 Uso de instrumental exclusivo para la PCR
 Utilización de reactivos y tubos estériles
 Uso de guantes por el manipulador
 Realización de controles de blanco (se añade agua en lugar de ADN, no debe
existir amplificación)