Manual Bioquimica para Reimpresos

Manual del Laboratorio de Bioquímica
Jaime Andrés Pereañez Jiménez

Andrés Felipe Zapata Betancur
Francisco Peña Rivera
Maritza Fernández Culma
Rafael Salamanca Flórez
Docentes Departamento de Farmacia
Universidad de Antioquia
Facultad de Química Farmacéutica
Departamento de Farmacia
Primera edición
Medellín, 2014
CONTENIDO
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y TOXICOLOGÍA
5-324
Pág.
INTRODUCCIÓN 4
OBSERVACIONES GENERALES 5
Normas de bioseguridad en el laboratorio 5
Reglamento interno del laboratorio 5
Normas para el trabajo en el laboratorio 5
Manejo y disposición de los residuos 6
Equipo de protección personal (EPP) 7
Primeros auxilios 8
EQUIPOS DE LABORATORIO 10
PRÁCTICA # 1 Bases de datos y herramientas estadísticas 14
PRÁCTICA # 2 Espectrofotometría y curva de calibración 17
PRÁCTICA # 3 Cuantificación de proteínas: método de Bradford 21
PRÁCTICA # 4 Actividad enzimática: Tirosinasa 23
PRÁCTICA # 5 Fosfatasa alcalina I 29
PRÁCTICA # 6 Fosfatasa alcalina II 32
PRÁCTICA # 7 Actividad enzimática: Fosfolipasa A 2 35
PRÁCTICA # 8 Fermentación alcohólica: Glucólisis anaerobia 38
PRÁCTICA # 9 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida 42
INTRODUCCIÓN
5-324
La Bioquímica es el estudio de la estructura, composición y las reacciones químicas de

las moléculas en los organismos vivos. La Bioquímica emergió como una disciplina
separada cuando científicos combinaron la biología con la química orgánica, inorgánica
o la fisicoquímica, y comenzaron a estudiar como los organismos obtenían la energía a
partir de los alimentos, las bases químicas de la herencia y los cambios fundamentales
que ocurren en la en los procesos de salud-enfermedad.
Este manual pretende brindar un acercamiento a diferentes técnicas usadas para el

estudio de diversos procesos bioquímicos. En esta recopilación, se hace especial
énfasis en los fundamentos prácticos relacionados con la enzimología: actividad
enzimática, influencia de diferentes factores fisicoquímicos sobre la misma, extracción
de enzimas y productos de reacción, cinética enzimática e inhibición enzimática. Lo
anterior con el fin de brindar a los estudiantes de Química Farmacéutica una visión
global sobre una de las disciplinas de la bioquímica más usada para el desarrollo de
nuevos fármacos.
Asimismo, en este manual se presentan conceptos teórico-prácticos sobre la

cuantificación de proteínas, metabolismo (glucólisis) y electroforesis como parte del
conjunto de técnicas usadas para visualizar y separar proteínas desde muestras
complejas.
OBSERVACIONES GENERALES
5-324
Normas de bioseguridad en el laboratorio
Las normas de seguridad en el laboratorio pretenden crear en los estudiantes una

conciencia de autocuidado y de cumplimientos a las normas internacionales y
nacionales frente al tema, velando por la integridad física de las personas en el
laboratorio y el correcto desarrollo de las prácticas académicas obteniendo un
resultado confiable y acorde a los procedimientos realizados.
Reglamento interno del laboratorio
El laboratorio es un sitio exclusivo de trabajo experimental, en él se aprende

observando y ensayando, y por tanto, se requiere un comportamiento responsable y
acorde a las normas para evitar perjuicios personales a sí mismos, a los compañeros o
a la institución, porque su omisión o incumplimiento, puede ocasionarlos.
Normas para el trabajo en el laboratorio:
 Los estudiantes deben ser puntuales y disponer adecuadamente de su tiempo,

para no trastornar las prácticas de los grupos siguientes. Es indispensable leer,
analizar y aclarar las dudas antes de comenzar su trabajo en el laboratorio.
 Siempre deben usar bata blanca preferiblemente de manga larga con cierre y
con bolsillos internos, las gafas de seguridad, el respirador, los guantes y gorro
(estos tres últimos para casos específicos y si se hace necesario). La bata debe
permanecer cerrada durante toda la práctica.
 Los celulares se deben apagar o poner en modo silencioso o vibración, con el
fin de no perturbar el desarrollo normal del laboratorio y las llamadas, si el
profesor lo permite, se deben contestar afuera del laboratorio.
 El uso de audífonos al interior del laboratorio no está permitido, ya que
generan distracción y pueden desencadenar accidentes.
 Las gorras, cachuchas o vísceras se deben guardar en el morral o bolso.
 El cabello, si es largo, se debe llevar recogido para evitar accidentes.
 Se recomienda no portar reloj, anillos, cadenas, aretes o pulseras, los cuales
pueden generar accidentes o deteriorarse por acción de los reactivos o equipos
de trabajo.
 Nunca colocar sobre las mesas de trabajo morrales, sacos y demás objetos
personales. No utilizar las mesas de trabajo como asientos.
 Revisar el material asignado antes de iniciar la práctica, verificar si está
completo y en buen estado. Informar al tecnólogo o monitor cualquier
anomalía.
 TODO EL GRUPO ES RESPONSABLE DEL MATERIAL DE USO GENERAL.
 Identificar y hacer uso correcto, si es necesario, del extintor de incendios y el
botiquín de primeros auxilios.
 Se prohíbe fumar e ingerir cualquier tipo de alimento dentro del laboratorio y
durante la práctica.
 El laboratorio es un sitio de trabajo serio, donde las bromas y los juegos pueden
ocasionar graves accidentes. Se debe mantener el buen comportamiento y la
disciplina, y se debe manejar un tono de voz adecuado.
 Durante la práctica mantener ORDEN Y LIMPIEZA en las mesas de trabajo, así
como en el sitio asignado para materiales y reactivos de uso general.
 Al iniciar y finalizar una práctica, se deben lavar las manos con agua y jabón.
 Antes de usar un reactivo o solución leer las etiquetas e interpretar los
símbolos de seguridad. Evitar el contacto con los ojos, la piel y la ropa.
 Utilizar adecuadamente pipetas, pipeteadores o espátulas asignadas para cada
uno de los reactivos o soluciones preparadas para evitar contaminaciones y por
ende la pérdida total de los reactivos. LOS REACTIVOS Y/O SOLUCIONES NO SE
DEBEN RETIRAR DE LOS SITIOS ASIGNADOS, taparlos después de su uso.
 Manejar cuidadosamente los equipos siguiendo las instrucciones dadas por el
profesor, el tecnólogo o el monitor. No descuidar los equipos que se
encuentren en funcionamiento.
 Rotular adecuadamente con nombre, código del curso y fecha, los ensayos
realizados que requieren un seguimiento por varios días. Ubicarlos en el sitio
asignado dentro del laboratorio.
 El laboratorio es un espacio para el aprendizaje, por lo cual no se permiten
visitas durante el tiempo de clase, los encuentros con los compañeros de
estudio se deben realizar en sitios y horas diferentes a los del laboratorio.
 Por seguridad y cuidado personal se debe evitar al máximo trabajar solo en el
laboratorio, siempre se debe estar acompañado de otra persona.
Manejo y disposición de los residuos
No se deben arrojar residuos sólidos, papeles, servilletas por las pocetas, al piso o a
las mesas de trabajo, desecharlos en forma adecuada y en los recipientes asignados
para tal fin:
Color Caneca Tipo de Residuo Clasificación
Gris Papel, Cartón Reciclable
Blanca Vidrio limpio Reciclable
Muestras y material
Roja Riesgo Químico y Biológico
contaminado
Basura, servilletas, guantes

Verde No Reciclable
no contaminados
Al finalizar la práctica y después de disponer correctamente de los residuos, lavar el

material con precaución, limpiar el sitio de trabajo y ubicar las butacas en el sitio
correspondiente, informar a la persona encargada para recibir el visto bueno de
entrega. LOS ESTUDIANTES NO SE DEBEN RETIRAR DEL LABORATORIO SIN HABER
REALIZADO CORRECTAMENTE LA ENTREGA.
En caso de pérdida, ruptura de materiales o contaminación de algún reactivo, los

estudiantes deberán reportarlo en el formato especificado y retornarlo al laboratorio
en los 15 días siguientes. El material debe tener las mismas condiciones o
especificaciones del perdido y debe presentarse la factura correspondiente. La no
reposición a tiempo de los elementos genera impedimentos para la próxima matricula.
Equipo de protección personal (EPP)
 Protección ocular
Las gafas de seguridad deben ofrecer una buena protección frontal y lateral.
Son de uso permanente durante toda la práctica.
 Protección de las manos

Para cada práctica se debe portar guantes protectores de laboratorio, los
cuales se utilizaran cuando sea necesario, ya sean de latex o de nitrilo
 Protección de los pies

La protección de los pies está diseñada para prevenir heridas producidas por
sustancias corrosivas, objetos pesados, descargas eléctricas, así como para
evitar deslizamientos en suelos mojados, motivo por el cual debe ser un zapato
que cubra todo el pie. No se permiten chanclas, sandalias, etc. Además se debe
utilizar ropa que cubra en su totalidad las piernas y que sea resistente, como lo
son jeans o pantalones, no se permiten minifaldas, shorts, etc.
 Protección pulmonar
Las mascarillas individuales, deben contener el adsorbente adecuado al tipo de
sustancia que se va a manipular y se deben portar cuando sea necesario.
 Ropa de protección
La bata de laboratorio está diseñada para proteger la ropa y la piel de las
sustancias químicas que pueden derramarse o producir salpicaduras. Es de
obligatorio uso.
Primeros auxilios
 Quemaduras
Para la atención de pequeñas quemaduras producidas por material caliente,
como lo son los baños maría, las placas o mantas de calentamiento , etc. Se
debe efectuar primero un lavado con abundante agua fría en la zona afectada
durante 10-15 minutos. Luego del lavado se debe aplicar una crema o pomada
indicada para estas lesiones, como lo es la Sulfadiazina de Plata (Sulfaplata ®) la
cual se encuentra en el botiquín de primeros auxilios del laboratorio.
Las quemaduras más graves y que comprometan mucho tejido epitelial se debe
proceder con el lavado con agua fría sobre el tejido afectado y remitir
inmediatamente al servicio medico para recibir atención especializada.
 Cortes
Si durante el desarrollo de las practicas se presenta algún corte, este se debe
lavar inmediatamente con agua y jabón desinfectante y se debe cubrir con un
apósito indicado, si la hemorragia persiste se debe acudir inmediatamente al
servicio medico.
 Derrame de productos químicos sobre la piel

Los productos químicos que se hallan vertido sobre la piel han de ser lavados
inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimo durante 15
minutos. Las duchas de seguridad son usadas en aquellos casos en que la zona
afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado con un grifo. Se
debe retirar toda la ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible
mientras esté bajo la ducha. Recuerda que la rapidez en el lavado es muy
importante para reducir la gravedad y la extensión de la herida. No intentar
neutralizar y proporcionar asistencia médica a la persona afectada.
 Salpicaduras en ojos
En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se
lave los ojos, menos grande será el daño producido. Lava los ojos con agua
corriente abundante durante 15 minutos como mínimo. Para esto se debe
utilizar el lavaojos ubicado en la ducha de seguridad. Es necesario mantener los
ojos bien abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de
los parpados y siempre se debe recibir asistencia médica por pequeña que sea
la lesión.
 Incendios
Evacuar inmediatamente el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, para
esto utilizar la salida principal o por la salida de emergencia si la principal está
bloqueada. Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se cree pánico y
conservando siempre la calma.
o Fuego leve
Si el fuego es pequeño y localizado, apagar utilizando extintor adecuado,
arena, o cubriendo el fuego con recipientes de tamaño adecuado que lo
ahogue. Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del
fuego. No utilice nunca agua para extinguir fuego provocado por
inflamación con un disolvente.
o Fuegos alto
Aislar el fuego. Utilizar los extintores adecuados: el de CO2 para
incendios de gases (tipo A) y el de agua a presión con CO2 en solución,
para sólidos y líquidos.
 Fuego corporal
Si se genera fuego sobre ti en tu ropa, pide ayuda inmediatamente, estírate
sobre el suelo y comienza a rodar sobre ti mismo, si el fuego continua la
persona que te este auxiliando te debe cubrir con una manta o cobija con el fin
de ahogar el fuego o trasladarte a la ducha de seguridad para extinguirlo con
agua y si se requiere se debe retirar su ropa, siempre y cuando no se encuentre
adherida a su piel, si es así utilizar una tijera y cortar la no adherida. No se debe
utilizar el extintor directamente sobre la persona y se debe acudir
inmediatamente al servicio medico.
EQUIPOS DE LABORATORIO
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Baño María
Equipo utilizado para hacer calentamientos

indirectos de diferentes líquidos o solidos mediante la
transferencia de calor a través de la convección térmica
del medio. El calentamiento se realiza de una forma
lenta y constante.
Para realizar el calentamiento en el baño maría el líquido o el solido se dispone en

un recipiente resistente al calor y se ubica al interior del equipo, de esta forma el agua
se calienta y poco a poco va transfiriendo el calor a la sustancia de interés. Antes de
comenzar a usar se debe verificar el nivel del agua.
Estufa de Secado
Se utiliza para secar el material utilizado en el

laboratorio ya sea de vidrio, plástico o acero inoxidable
entre otros. También se puede utilizar para la
esterilización del vidrio o el metal de acuerdo con el
tiempo y el calor programado.
Existen diferentes tipos de estufas de secado (hornos de secado) de acuerdo con el

tipo de convección del calor, ya sea natural o forzada.
El calor utilizado por la estufa para realizar el secado y la esterilización se denomina

calor seco.
Tabla de temperatura / tiempo de esterilización por calor seco

TEMPERATURA °C TIEMPO (Minutos) TEMPERATURA °C TIEMPO (Minutos)
180 30 140 150
170 60 150 180
160 120 121 360
http://www.medifesas.com/mdf/images/stories/documentos/metodos_de_esterilizar_el_instrumental.pdf
Espectrofotómetro
Consiste en un instrumento que nos permite

determinar la cantidad de radiación absorbida o
trasmitida por un compuesto.
El espectrofotómetro nos permite realizar lecturas de la radiación absorbida o

transmitida en la región visible del espectro, la cual se encuentra entre 400 y 750 nm
de longitud de onda.
Cada compuesto posee una longitud de onda de máxima de absorbancia en la cual

se realiza la lectura para posterior determinación de la concentración.
Balanza Analítica
La balanza analítica es uno de los equipos más

utilizados e importantes al interior de un laboratorio
tanto de análisis como de investigación. De esta
depende la correcta medida de muchas de las
sustancias a trabajar lo cual permite tener resultados
más exactos y confiables.
Estas balanzas poseen características de precisión y

exactitud, por lo cual su manipulación requiere mucho
cuidado y limpieza, garantizando así la conservación de sus partes un buen estado y
mejor funcionamiento.
El correcto funcionamiento de las balanzas también depende de los factores

ambientales y ubicación al interior del laboratorio, motivo por el cual deben estar en
un lugar exclusivo de pesado donde incidan en lo menos posibles factores como
corrientes de aire, rayos del sol o demás perturbaciones.
pH-Metro
Equipo que permite realizar la determinación del

diferencial del potencial eléctrico en una disolución, el
método se basa en la corriente eléctrica generada
entre dos disoluciones con diferente potencial.
Para realizar la lectura de este diferencial se utiliza un electrodo, el cual al ser

sumergido en una disolución establece un potencial eléctrico a través de la membrana
de vidrio, el cual es comparado con el potencial invariable del electrodo de referencia y
puede estar al interior del electrodo o estar ubicado externamente.
El electrodo al ser un elemento de vidrio y tan delicado, requiere que sea

manipulado con mucho cuidado y cada vez que se usa debe de ser enjuagado con
abundante agua destilada o desionizada, además debe de conservarse de manera
permanente y mientras no este en uso en una solución de KCl.
Plancha de agitación con calentamiento
Este equipo posee un imán central fijo el cual es el

encargado de hacer girar un barra magnética que
depositamos en las disoluciones, al producirse la
repulsión de cargas el magneto gira brindando así una
agitación constante a la disolución.
Este equipo es de gran ayuda el momento de preparar disoluciones con sustancias

poco solubles en el solvente utilizado y además nos brinda la posibilidad de
calentamiento con lo podemos acelerar el proceso de disolución en muchos casos.
También se puede utilizar sin agitación y solamente utilizando el calentamiento,

pues posee controles independientes para estas funciones.
Cabina de Extracción de gases
La cabina de extracción de gases nos permite

trabajar al interior del laboratorio de forma segura al
momento de manipular sustancias toxicas volátiles,
minimizando el contacto del personal del laboratorio
con estos vapores y una menor contaminación al
medio. Además de la protección contra los vapores y humo, la cabina también ofrece
protección frente a derrames y posibles explosiones.
El funcionamiento de esta se basa en la extracción de los vapores generados en el

área de trabajo, los cuales van por conductos hacia el exterior luego de pasar por un
filtro que minimiza la contaminación del medio ambiente.
Centrifuga
La centrifuga es un equipo que nos permite separar

líquidos o solidos de líquidos, mediante la diferencia de
densidades. La mezcla es introducida a la centrifuga en tubos de ensayo y es sometido
a una fuerza rotativa, la cual genera que el liquido de mayor densidad o el solido se
precipite hacia el fondo del tubo de ensayo.
Agitador tipo vórtex
Se usa para agitar líquidos dispuestos en tubos de

ensayo o frascos pequeños. Mediante un motor se
genera un movimiento circular de una pieza de goma
que posteriormente trasmite el movimiento al
recipiente que contiene el líquido y finalmente se forma un vórtice. La mayoría de
agitadores tipo vórtex tienen la posibilidad de considerar diferentes configuraciones,
entre ellas la de funcionar solo cuando una débil presión se aplica sobre la pieza de
goma.
PRÁCTICA # 1 BASES DE DATOS Y HERRAMIENTAS
ESTADÍSTICAS

5-324
El uso de las bases de datos en el mundo académico es más común día a día, sin
embargo muchos estudiantes no tienen éxito en sus búsquedas, ya sea por
desconocimiento de los buscadores o por imprecisión en las palabras claves utilizadas.
En esta práctica se darán conceptos básicos sobre el uso de las bases datos a las que
nuestra biblioteca tiene acceso.
 Science Direct
 Springer
 Pubmed
 EBSCO
Y otras más.
Como ingresar a las bases de datos de la Universidad de Antioquia
 Ingresar al sistema de bibliotecas y solicitar contraseña

 Ingresar a las diferentes bases de datos
 Seleccionar la base de datos requerida y realizar la búsqueda
La estadística es una herramienta valiosa que debe ser aprovechada por personas que
trabajan en diferentes aéreas. En ciencias biológicas la estadística nos ayuda a
establecer diferencias entre tratamientos, concentraciones, tiempos, ensayos,
estándar y muestras, entre otras. Adicionalmente ésta ciencia es de gran apoyo al
momento de discutir los resultados obtenidos experimentalmente, sin embargo
muchas personas no conocen los análisis que deben ser realizados a sus datos y mucho
menos la interpretación de los mismos. Por esta razón en esta práctica se darán
nociones del uso de Excel en algunos análisis estadísticos simples, así como la
interpretación de los mismos.
PRÁCTICA # 2 ESPECTROFOTOMETRÍA Y CURVA DE
CALIBRACIÓN

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Objetivos
 Conocer los aspectos básicos de la técnica instrumental espectrofotometría.

 Elaborar una curva de calibración de un compuesto coloreado (Paranitrofenol
(PNP) o Azul de metileno).
 Determinar la concentración de una muestra problema a partir de la curva de
calibración.
Aspectos Teóricos
La espectrofotometría es una técnica útil para hallar concentraciones de diferentes

muestras y para seguir el curso de una reacción. El método se basa en la medición de
la intensidad de la luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solución coloreada, que
puede ser de uno o varios compuestos. La absorción máxima de energía ocurre a una
longitud de onda () específica para cada molécula. La intensidad de la energía
absorbida (absorbancia) es directamente proporcional a la concentración del
compuesto en una solución.
Radiación electromagnética y absorbancia de la luz
La radiación electromagnética es una clase de energía que se transmite por el

espacio a enormes velocidades. Adopta muchas formas, siendo la más fácilmente
reconocible la luz. Otras manifestaciones menos evidentes son la radiación gamma, los
rayos X, el ultravioleta (UV), el microondas y la radiofrecuencia. La radiación
electromagnética viaja en forma de ondas, con una longitud de onda específica ()
(distancia entre puntos consecutivos de una onda). Otra propiedad importante de las
ondas es la frecuencia (), definida como número de oscilaciones por unidad de
tiempo. La frecuencia también es importante para definir la energía de la onda, ya que
como se muestra en la ecuación E= h, siendo h la constante de Plank (= 6.62 · 10 -34
Joule x segundo), la frecuencia es directamente proporcional a la energía de la onda. El
espectro electromagnético entonces, está constituido por ondas electromagnéticas de
diferente frecuencia. Una región del espectro electromagnético es la visible, entre
~400~800 nm. Cualquier energía producida en esta estrecha banda producirá la
sensación de visión cuando estimula el ojo humano normal. Así, radiaciones entre
~400~420 producirán color violeta y radiaciones entre ~570~585 producirán color
amarillo.
Absorbancia y ley de Beer
Cuando una molécula absorbe radiación visible, sus electrones se excitan y pasan a
un nivel de energía mayor, sin embargo los electrones también pueden caer a niveles
de menor energía y pueden emitir radiación electromagnética. Cuando un haz de luz
incide sobre un cuerpo traslúcido (ej. una solución), una parte de esta luz es absorbida
por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. La absorbancia es la
cantidad de luz absorbida, mientras que la transmitancia es la cantidad de luz que
logra pasar el cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia
del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida por dicho cuerpo.
Por su parte, la ley de Beer, establece que la absorbancia está relacionada

linealmente con la concentración de la especie absorbente y con la longitud de la
trayectoria de la radiación en el medio absorbente. Adicionalmente, esta ley involucra
la absortividad molar (ε), la cual es una constante para cada especie que absorba
energía en la región visible. Finalmente la ecuación de la ley de Beer es: A = εbc,
donde (ε) es el coeficiente de extinción molar, b es la longitud de paso del haz de luz
por la muestra y c es la concentración. Se puede notar en la ecuación que la
absorbancia esta directamente relacionada con la concentración de la especie
problema.
Materiales:
 Espectrofotómetro
 Celdas para el Espectrofotómetro
 Tubos de ensayo
 Vaso de precipitados
 Frasco lavador
Reactivos:
 Solución de Paranitrofenol (139.1088 g/mol) 1 x10-4 Molar o Azul de metileno

319.85 g/mol) 4.01 x 10-5 Molar
 Solución acuosa NaCl 0.9% (Si se trabaja con PNP)
 Agua destilada o desionizada
Sección Experimental
 Manejo del Espectrofotómetro.

Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo
las siguientes indicaciones o remitirse al manual del equipo:
o Seleccione la longitud de onda deseada (PNP 410 nm – Azul de Metileno
665 nm)
o Introducir la celda que contiene la solución blanco, la cual se prepara
mezclando 3ml de solución salina o agua.
o Calibrar el 0 de Absorbancia / 100% de transmitancia.
o Retirar la celda que contiene la solución blanco.
o Realizar las lecturas correspondientes.
 Curva de calibración para soluciones coloreadas.
o Rotule 7 tubos de ensayo y prepare las soluciones indicadas en la siguiente

tabla mediante diluciones dobles sucesivas.
TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7
Dilución 0 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
Solución
0 4 0 0 0 0 0 0
Patrón (ml)
Cantidad de
solución 0 0 2 2 2 2 2 2
anterior (ml)
Solución salina
4 0 2 2 2 2 2 2
(ml)
Concentración
(mol/l)
Absorbancia
obtenida
o Grafique los resultados de absorbancia y concentración tabulados y

obtenga la ecuación de la línea recta mediante el uso de los conceptos
básicos de estadística que le fueron ensañados en la práctica anterior.
o Obtenga el valor de concentración de su muestra problema, utilizando la
ecuación antes encontrada.
Residuos
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos NO clorados.

Preguntas
 ¿Qué es una curva de calibración?

 ¿Qué características debe cumplir?
 ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloreadas?
 ¿Por qué razón se eligió una sola longitud de onda para hacer todas las
mediciones de la curva de absorción?
 ¿Qué significado tiene la pendiente de la gráfica?
 ¿Que son las desviaciones de la ley de Beer y cuáles son sus principales causas?
Bibliografía
 Schmid, F.-X. Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry.

Encyclopedia of Life Sciences. Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing
Group. 2001.
PRÁCTICA # 3 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO
DE BRADFORD

5-324
Objetivo
 Determinar la concentración de proteínas de una muestra desconocida a partir de

una curva de calibración de albúmina, usando el método de Bradford.
Aspectos Teóricos
El método de Bradford está basado en la unión del colorante Azul de Coomassie

G250 a las proteínas. Estudios han indicado que el colorante puede existir en cuatro
formas iónicas pKa 1.15, 1.82, y 12.4. La forma más aniónica es la azul, la cual se une a
la proteína y tiene un máximo de absorbancia a 590nm. Por lo tanto, la cantidad de
proteína puede ser estimada al determinar la cantidad de colorante en la forma azul.
Esto usualmente se obtiene al medir la absorbancia de la solución a 595 nm.
Materiales
 Espectrofotómetro.
 Celdas para espectrofotómetro.
 Agitador.
 Micropipeta 100–1000 µl.
Reactivos
 Solución acuosa de buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.

 Solución de Albumina 1 mg/ml.
 Suero Fetal Bovino 1/20.
 Reactivo de Bradford.
o Azul de Coomasie.
o Etanol.
o Ácido Ortofosfórico.
Sección experimental
 Realice la siguiente curva de calibración mediante diluciones dobles sucesivas:

Patrón: Albúmina (BSA) 1mg/ml = 1µg/1µL.
Diluyente: Solución buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Dilución (v/v) 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
Concentración (µg/100µL) 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56
 Prepare una serie tubos en los cuales depositará 200 µL de cada una de las
diluciones preparadas, posteriormente adicione 3 ml del reactivo Azul de
Coomasie, deje en reposo por 5 min en la oscuridad y lea Absorbancia a 595
nm contra un blanco correctamente preparado.
 Utilizar análisis de regresión lineal simple para el análisis de los datos.
 Para determinar la concentración de una muestra problema, adicionar a 100 µL

de ésta 3 ml de Azul de Coomasie, y proceda interpolando en la recta de
calibración y haciendo los ajustes a que hubiere lugar.
Preguntas
 Cuál es la base del método?

 Cuáles son las interferencias del método?
 Investigue otros métodos de cuantificación de proteínas?
Bibliografía
 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt.
Biochem. 1976; 72: 248-254.
 Spector, T. Refinement of the Coomassie Blue method of protein quantitation.
A simple and linear spectrophotometric assay for <0.5 to 50 μg of protein.
Analyt. Biochem. 1978; 86: 142-146.
PRÁCTICA # 4 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: TIROSINASA

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Objetivo
 Determinar la actividad enzimática de la tirosinasa y la influencia de diferentes

factores fisicoquímicos sobre la misma.
Aspectos Teóricos
Actividad enzimática e influencia de factores fisicoquímicos sobre esta
Las enzimas son los catalizadores de los sistemas biológicos, son altamente
específicas y se recuperan al final de cada ciclo de reacción. En general son de carácter
proteico pero también se conocen algunos RNAs con propiedades catalíticas. Estos
catalizadores tienen parámetros enzimáticos como Km y Vmax, sin embargo estos
varían de acuerdo al sustrato y la concentración de enzima. La forma más adecuada de
cuantificar la actividad enzimática es medir la cantidad de producto que se forma por
unidad de tiempo. Sin embargo, tal actividad se ve influenciada por el pH y la
temperatura del microambiente donde ocurre la reacción, la concentración de
sustrato y coenzimas o cofactores, entre otras.
Todas las enzimas tienen condiciones óptimas de catálisis, es decir un pH, temperatura
y fuerza iónica del medio a las cuales la enzima cataliza la reacción de la forma más
eficiente posible. Sin embargo, los cambios de pH en el ambiente donde ocurre la
reacción pueden provocar que las cadenas laterales de los aminoácidos del sitio activo
se protonen o desprotonen lo que provocaría una perdida en la capacidad de la enzima
para llevar a cabo la reacción.
De igual forma cambios en la temperatura y la fuerza iónica del medio, provocan

cambios conformacionales en la enzima que finalmente conducen a disminución en la
eficiencia catalítica.
Tirosinasa y pardeamiento enzimático
El oscurecimiento de algunas frutas y verduras (banano, pera, manzana, papa),

después de que son expuestas al medio ambiente, se conoce como pardeamiento
enzimático. Este proceso es llevado a cabo por la Tirosinasa, (o-difenol O2
oxidorreductasa E.C. 1.14.18.1.). Esta metal-enzima es la que está en el interior de las
frutas antes mencionadas y como la reacción requiere de oxígeno molecular, la
pigmentación, no ocurre si la parte interior de estas frutas no está expuesta al aire. La
reacción catalizada por la enzima se muestra en la figura 1, esta reacción conduce a la
formación de un pigmento color café, conocido como melanina, el cual se produce tras
oxidación de la tirosina y posterior polimerización de los productos de reacción.
Figura 1. Reacción catalizada por la Tirosinasa
COOH HO COOH O COOH

O2 O2
NH2 Enz NH2 NH2
Enz
HO O
HO
Tirosina DOPA Dopa quinona
HO
O HO
COOH
COOH
HO NH
CO2 NH NH
O HO
Dopa crome, 420 nm
O
O
N
NH
O
O
O
N
O
M elanina
En el desarrollo de esta práctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de la papa

y hacerla reaccionar con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el compuesto L-
metildopacromo, que es de color café; la aparición de este se puede seguir
espectrofotométricamente a una λ de 420nm, que es donde se presenta su máxima
absorción.
Reactivos y Equipos
 Solución buffer glicina 0.05 M pH 10.4.

 Solución buffer fosfato 0.1 M pH 7.2.
 Solución buffer fosfato 0.1 M pH 6.0.
 Solución buffer citrato pH 3.
 Solución DOPA 0.03 M (en buffer fosfato de pH 6.0).
 Papas.
 Arena de mar.
 Lienzo o pañuelo limpio.
 Mortero.
 Espectrofotómetro.
 Hielo picado.
Extracción de la enzima.
 Coloque 10 g de la papa en el mortero pre-enfriado y adicione 10 ml de buffer

de fosfato 0.1M (pH=7.2).
 Adicione unos pocos gramos de arena de mar a la mezcla anterior y triture
hasta que no haya fruta solida.
 Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 10 minutos a 3500
RPM.
 La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un baño de hielo.
 Diluya la solución sobrenadante 1/10 con buffer pH=7.2 hasta completar 20 ml.
 Rotule esta solución como extracto enzimático.
Medida de la actividad enzimática.
 Mezcle en un tubo de ensayo:

o 1ml de extracto enzimático.
o 3 ml de buffer pH=7.2.
o 1 ml de solución de L-metildopa.
 Prepare un blanco de reactivos.
 Calibrar el espectrofotómetro a λ = 420 nm.
 Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo
en el espectrofotómetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo
cero.
 Registre las Absorbancias registradas en el espectrofotómetro cada 20
segundos durante 3 minutos.
 Calcule la actividad enzimática de la pendiente de la gráfica Absorbancia vs
tiempo.
Influencia de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática.

o 2 ml de extracto enzimático (otros grupos pueden hacerlo con 1.5, 2.5
ml de extracto enzimático).
o 2 ml de buffer pH=7.2.
 Prepare un blanco de reactivos de acuerdo a la cantidad de extracto enzimático
utilizado.
 Calibrar el espectrofotómetro a λ =420 nm.
cero.
segundos durante 3 minutos. (Tabla 1)
tiempo.
 Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto anterior.
Tabla 1: Influencia de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática
Mililitros de extracto enzimático

Absorbancia
1.0 1.5 2.0 2.5
Tiempo (seg) tubo
0.0
20
40
60
80
100
120
150
180
Nota: Los datos de 1.0 ml debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad
enzimática.
Influencia del pH sobre la actividad enzimática.
 Mezcle en un tubo de ensayo}:

o 3 ml de buffer pH 3 (otros grupos lo pueden hacer con buffer pH 10)
cero.
segundos durante 3 minutos (Tabla 2).
tiempo.
 Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto de
Tabla 2: Influencia del pH sobre la actividad enzimática
pH
Absorbancia
3.0 7.2 10.0
Tiempo(seg)tubo
0.0
20
40
60
80
100
120
150
180
Nota: Los datos de pH 7.2 debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad
enzimática.
Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática.

o 3 ml de buffer pH= 7.2.
 Introduzca el tubo en un baño maría a 37 0C durante 5 minutos. Otros grupos lo
pueden hacer incubando a 2°C en un baño de hielo.
 Sin dejar enfriar el tubo de reacción, agregar el sustrato (L-metildopa), agite,
colóquelo en el espectrofotómetro y lea la absorbancia; tome esta lectura
como tiempo cero.
segundos durante 3 minutos (Tabla 3).
tiempo.
 Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto de
Tabla 3: Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática
Absorbancia
2°C 25°C 37°C
Tiempo(seg)tubo
0.0
20
40
60
80
100
120
150
180
Nota: Los datos de 25°C debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad
enzimática.
Se recomienda a los docentes que todos los estudiantes realicen la extracción de la

enzima, pero que los ensayos de influencia de concentración de enzima, pH y
temperatura sean realizados por diferentes grupos. Al final de la práctica los datos
deben ser compartidos.
Preguntas
 La enzima actúa mejor a pH ácido, básico o neutro?

 Explique cómo afecta la concentración de enzima la actividad enzimática.
 La enzima actúa mejor a temperaturas bajas, ambiente o fisiológicas?
 Documéntese sobre el mecanismo catalítico de la tirosinasa y responda lo
siguiente: Como pueden los pH ácidos y básicos influenciar sobre la actividad
enzimática?
Bibliografía
 Decker H, Dillinger R, Tuczek F. How Does Tyrosinase Work? Recent Insights

from Model Chemistry and Structural Biology . Angew. Chem. Int. Ed. 2000;
39: 1591-1595.
PRÁCTICA # 5 FOSFATASA ALCALINA I

5-324
Objetivo
 Comprender la reacción básica de las fosfatasas.

 Construir una curva de calibración con el producto de la reacción, la cual será
usada para calcular la cantidad de producto liberado después de la catálisis.
Aspectos Teóricos
Generalidades y principio del método
La fosfatasa alcalina (E.C. 3.1.3.1.) hidroliza los fosfoésteres, liberando el fosfato

inorgánico.
RCOOP + H2O RCOO- + Pi
Ejerce su acción a pH elevado, del orden de 10. La presencia de iones Zn 2+ es

necesaria para su actividad, mientras que el fosfato la inhibe.
La especificidad de la enzima por R es débil (estructuralmente es posible variar R

conservando la actividad enzimática) y R puede ser un radical alquílico o fenílico. R-OH
puede ser un alcohol primario o secundario, un fenol o un alcohol cíclico. El sustrato
que usaremos en este ensayo será el p-Nitrofenilfosfato. (PNPP).
OPO3-- OH
H2O
Enz
--
HPO3 NO2
NO2
PNPP PNP
Este sustrato es incoloro pero por hidrólisis se libera el p-Nitrofenol (PNP), que es
amarillo y absorbe a  = 410 nm, lo cual posibilita “seguirlo”
espectrofotometricamente. Este es el principio fundamental de esta práctica.
En resumen:
Si por acción de la enzima se produce el p-nitrofenol, precisamos de un método que

nos permita cuantificar ésta sustancia, para así calcular la velocidad de la reacción
medida por la enzima. Para ello debemos hacer una curva de calibración.
Reactivos
 Buffer de glicina 0.05 M, pH 10.4.

 Solución fosfato disódico 0.5 M.
 Solución de p-Nitrofenol (PNP) 10-4M. (Para esta solución y las disoluciones
sucesivas, utilice el buffer de Glicina como solvente).
 Solución acuosa de ZnCl2 610-4M.
 Solución enzimática: Suero sanguíneo diluido 1/2 con buffer de glicina.
 Solución acuosa de p-Nitrofenilfosfato (PNPP) 510-3M.
 Solución acuosa de Na2HPO4 5.010-3M.
Construcción de la curva de calibración con el producto de la reacción.
 Prepare una serie de tubos con las diluciones indicadas de PNP.

 Utilicen como solución diluyente el buffer de Glicina.
 Luego de haber realizado las diluciones adicione 1 ml de la solución de Fosfato
0.5 M y 0.5 ml de la solución de ZnCl 2 610-4 M a cada uno de los tubos.
 Prepare un blanco para este experimento.
 Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotómetro y realice
las lecturas.
 Registre las absorbancias obtenidas.
Tubo 1 2 3 4 5 Blanco
Dilución PNP 10-4M 2 ml
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16
Volumen final 2 ml Glicina
Fosfato de sodio 0.5M 1 1 1 1 1 1
-4
Sln de ZnCl2 610 M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Absorbancia
Concentración PNP
 Calcule la concentración de PNP en cada una de las diluciones.

 Realice el gráfico de Absorbancia en función de la concentración de PNP.
 Exprese la concentración en mol/l.
Nota:
 En todos los ensayos enzimáticos, es fundamental que el material de vidrio este

limpio.
 Donde se dice agua, debe usarse destilada y/o desionizada.
 Todas las mediciones de volúmenes deben ser exactas.
Bibliografía
 Bessey O, Lowry O, Brock MJ. A method for the rapid determination of alkaline
phosphatase with five cubic millimeters of serum. J. Biol. Chem. 1946; 164: 321-
329.
PRÁCTICA # 6 FOSFATASA ALCALINA II

5-324
Objetivo
 Calcular los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina mediante el uso de un

sustrato sintético y el seguimiento espectrofotométrico de la aparición del
producto de la reacción.
 Determinar el tipo de inhibición del fosfato sobre la actividad enzimática de la
fosfatasa alcalina.
Influencia de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción

enzimática: Determinación de parámetros cinéticos Km y Vm.
 Prepare una serie de tubos con las diluciones indicadas de PNPP.

 Utilicen como solución diluyente el buffer de Glicina.
 Luego de haber realizado las diluciones adicione 0.5 ml de la solución de ZnCl 2
610-4 M a cada uno de los tubos.
PNPP Volumen 2 ml
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16
final 2 ml Glicina
Sln. ZnCl2 610-4M
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(ml)
Absorbancia
 Prepare un blanco para este experimento.

 Deje en reposo durante 5 minutos.
 Incubar los tubos a 37ºC por 5 minutos, el suero fetal 1/2 también de de
calentarse bajo las mismas condiciones.
 Adicionar 0.5 mL de la solución enzimática (Suero Fetal Bovino) a cada tubo de
ensayo.
 Garantizar que cada tubo reaccione con la solución enzimática exactamente 15
minutos a 37 °C.
 Luego de los 15 minutos detener la reacción con 1 mL Na 2HPO4 0.5 M.
 Registrar las absorbancias a 410 nm.
 Determine la cantidad de PNP producido interpolando las absorbancias en la
curva de calibración obtenida en la práctica anterior.
 Construya y complete la siguiente tabla
[PNPP] Absorbancia [PNP] V0 = [PNP]/min 1/[PNPP] 1/V0
 Grafique los inversos 1/[PNPP] y 1/V0 determine Km y Vm
Determinación del tipo de inhibición.
 Preparar en 5 tubos numerados del 1 al 5 y un blanco, las siguientes mezclas:
PNPP Volumen 2 ml
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16
final 2 ml glicina
Inhib.0.510-2M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sln. ZnCl2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
 Dejar en reposo durante 15 minutos.

 Incubar los tubos a 37ºC por 5 minutos, el suero fetal también de de calentarse
bajo las mismas condiciones.
 Luego adicionar 0.5 ml de la solución enzimática.
 Garantizar que cada tubo reaccione exactamente 15 minutos a 37 °C.
 Luego de los 15 minutos detener la reacción adicionando 1 ml de a cada tubo
Na2HPO4 0.5 M.
 Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotómetro y realice
las lecturas.
 Determine la cantidad de PNP producido interpolando las absorbancias en la
curva de calibración obtenida en la práctica anterior.
 Construir la misma tabla que utilizó para determinar los parámetros
enzimáticos, Km y Vm, y ahora calcúlelos en presencia del inhibidor.
 Determinar el tipo de inhibición.
Preguntas
 Cuál es la importancia clínica de la fosfatasa alcalina?

 En este caso, se puede considerar el fosfato como un inhibidor por producto?
 Sería posible revertir la inhibición provocada por el fosfato aumentando la
concentración de PNPP?
Nota:
 En todos los ensayos enzimáticos, es fundamental que el material de vidrio este

limpio.
 Donde se dice agua, debe usarse destilada y/o desionizada.
 Todas las mediciones de volúmenes deben ser exactas.
Bibliografía
 Trentham DR, Gutfreund H. The kinetics of the reaction of nitrophenyl phosphates

with alkaline phosphatase from Escherichia coli. Biochem J. 1968; 106: 455-460.
PRÁCTICA # 7 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: FOSFOLIPASA A2

5-324
Objetivos
 Cuantificar la actividad de una enzima que actua en una interfase lípido:agua.
 Utilizar la técnica de extracción líquido:líquido para separar uno de los
productos de la reacción.
Aspectos Teóricos
Las fosfolipasas A2 (Phospholipase A2, PLA2) forman una superfamilia que

actualmente cuenta con 15 grupos a su vez divididos en numerosos subgrupos. Estas
enzimas se caracterizan por su capacidad para hidrolizar el enlace ester de la posición
sn-2 de un glicerofosfolípido (Figura 1). Su clasificación está basada en su secuencia,
masa molecular, procedencia, posición de sus puentes disulfuro, requerimiento de
calcio, entre otras características. Los productos de la hidrólisis del enlace ester de la
posición sn-2 del fosfolípido son un ácido graso y un lisofosfolípido. Ambos
representan el primer paso en la formación de segundos mensajeros que juegan
papeles fisiológicos de gran importancia. Cuando el ácido araquidónico es liberado
puede ser convertido en eicosanoides, por medio de la acción de diferentes enzimas.
Estas moléculas pueden ejercer una gran variedad de efectos fisiopatológicos,
principalmente los relacionados con la respuesta inflamatoria. Por su parte, los
lisofosfolípidos pueden ser convertidos en ácido lisofosfatídico o ser acetilado hacia el
factor activador de plaquetas, productos que también exhiben una variedad de efectos
fisiológicos.
Figura 1. Reacción catalizada por las PLA2. Liberación de un ácido graso desde la posición sn-2 de un
glicerofosfolípido.
Las PLA2s de venenos de serpiente pertenecen a los grupos IA, IIA y IIB. Estas
proteínas inducen diversos efectos, entre los cuales se incluyen neurotoxicidad pre y/o
posináptica, miotoxicidad local y/o sistémica, anticoagulación, cardiotoxicidad,
modulación de la agregación plaquetaria, actividades hemolítica, edematizante e
hipotensora y daño directo en órganos como el riñón, pulmón e hígado (2). Aunque es
claro que no todas las PLA 2s de venenos de serpiente tienen la capacidad de inducir
todos los efectos mencionados.
Estas enzimas tienen la particularidad de no actuar eficientemente sobre un

sustrato en solución, lo hacen mejor un sustrato agregado (fosfolípidos de membrana),
por esta razón éstas proteínas se conocen como enzimas interfaciales (actúan sobre su
sustrato en la interfase lipido:agua que se encuentra sobre la membrana celular).
Adicionalmente, estas enzimas son dependientes de Ca 2+ para su actividad enzimática.
En esta práctica utilizaremos yema de huevo como fuente de fosfolípidos agregados

y como fuente de enzima usaremos veneno de serpiente. Para cuantificar la actividad
enzimática se extraerán los ácidos grasos liberados después de acción de la enzima y
se titularán con NaOH usando azul de timol como indicador.
Materiales
 Baño María.
 Micropipetas (10-100, 100-1000) l.
 Pipetas volumétricas 2 ml, 5 ml.
 Plancha de agitación y calentamiento.
Reactivos
 Buffer (Tris-HCl 0.1M, CaCl2 0.01M pH 8.5).

 Yema de huevo.
 Mezcla de extracción (Isopropanol:Heptano 8:2).
 Hidróxido de sodio (0.01 N).
 Mezcla de titulación (Azul de Timol 0.1% en agua y posterior dilución 1:10 en
Etanol 96%).
 Solución acuosa de buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.
 Triton 100 X.
 En un tubo de ensayo adicionar 1 ml del sustrato de yema de huevo.

 Luego agregar 0.1 ml de la solución de muestra problema.
 Llevar al baño maría e incubar a 37°C por 15 min
 Retirar del baño maría y agregar 5 ml de mezcla de extracción y agitar
fuertemente.
 Agregar 2 ml de hexano a cada tubo.
 Adicionar 3 ml de agua a cada tubo e invertir la mezcla unas 3 veces.
 Tomar 2 ml de la fase superior y pasarlos a un tubo de ensayo limpio.
 Agregar 1 ml de la mezcla de titulación.
 Titular con el NaOH 0.01 N adicionando con micropipeta de a 10 µl, hasta viraje
a un color amarillo verdoso.
Calcular los Eq-g de ácidos grasos generados con base en los µl de NaOH gastados,
por unidad de tiempo y de masa de enzima. Expresar los resultados en actividad
enzimática Eq/min/mg Enzima.
Resultados
 µ NaOH x Normalidad de NaOH = Eq NaOH = Eq ácidos grasos

 Eq /15 min /Miligramos toxina
Preguntas
 Además de buscar inhibidores de PLA 2 que se unan al sitio activo de la enzima

(competitivos), podemos investigar inhibidores que bloqueen la enzima en
otros aspectos, cuales?
 Estas enzimas tienen en su superficie aminoácidos básicos, si usamos
fosfatidilcolina (Zwiterion) o fosfatidilserina (anión) para cuantificar su
actividad enzimática, sobre cual sustrato obtendremos el resultado mayor?
 Podemos medir la actividad enzimática de la enzima sobre fosfolípidos no
agregados?
Bibliografía
 Dole VP. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the
metabolism of glucose. J. Clin. Invest 2000; 35, 150-154.
 Kini RM. Excitement ahead: structure, function and mechanism of snake venom
phospholipase A2 enzymes. Toxicon. 2003.42: 827-840.
 Schaloske RH, Dennis EA. The phospholipase A2 superfamily and its group
numbering system. Biochim Biophys Acta. 2006; 1761: 1246-1259.
PRÁCTICA # 8 GLUCÓLISIS ANAEROBIA: FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA

5-324
Objetivos
 Determinar las diferentes velocidades en la fermentación de mono, di y
polisacáridos.
 Determinar el efecto de la concentración del azúcar en el proceso de
fermentación.
 Comprobar la inhibición de la ruta metabólica ocasionada por el NaF.
Aspectos Teóricos
El metabolismo es el conjunto de reacciones y procesos físicoquímicos que ocurren

en una célula. Estos procesos complejos interrelacionados son la base de la vida a nivel
molecular, y permiten las diversas actividades de las células: crecer, reproducirse,
mantener sus estructuras, responder a estímulos, entre otras.
El metabolismo se divide en dos procesos acoplados: catabolismo y anabolismo. En

el primero se llevan a cabo reacciones de degradación de compuestos
macromoleculares que conduce a la liberación de energía. Mientras que las reacciones
anabólicas usan la energía liberada en el catabolismo para sintetizar nuevos
compuestos químicos que resultan ser vitales para la célula.
Una de los procesos catabólicos más importantes es la glucolisis. Esta ruta

metabólica es una de las principales fuentes de energía en la gran mayoría de
organismos, ya que los carbohidratos son usados como un alimento fundamental. La
glucolisis consta de 10 reacciones y esta dividida en dos fases, la primera se conoce
como la fase de preparación y la segunda como la fase de ganancia. La glucólisis
conduce a piruvato, no obstante, el destino final de este varia dependiendo del
organismo y la presencia y/o ausencia de oxigeno en el medio. En el ser humano,
cuando se realiza glucólisis en condiciones anaeróbicas (ausencia de O 2), el piruvato es
convertido a lactato (fermentación láctica), sin embargo si la célula humana realiza
este proceso en condiciones aeróbicas (Presencia de O 2), el piruvato es oxidado a acetil
coenzima A, la cual posteriormente entra al ciclo de Krebs para producir equivalentes
reductores que finalmente serán usados en la cadena transportadora de electrones
para generar energía química en forma de ATP. Por otro lado, en algunas bacterias y
levaduras, cuando la glucolisis es llevada a cabo en ausencia de oxígeno, el piruvato es
oxidado a etanol, proceso que se conoce como fermentación alcohólica (Figura 1).
Glucosa
2Piruvato
Sin O2 Sin O2
O2
2 Etanol 2 CO2 2Lactato

2 CO2
2Acetil CoA
El etanol resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas tales

como vino, la cerveza, la sidra, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar
etanol mediante la fermentación a nivel industrial a gran escala para ser empleado
como biocombustible.
En la práctica de laboratorio se pretende observar y cuantificar la velocidad a la cual

cierto tipo de levadura es capaz de fermentar diferentes sustratos (mono, di y
polisacáridos), midiendo la cantidad de CO 2 que se va generando en el tiempo.
Materiales
 Tubos de ensayos.
 Beakers.
 Baño María.
 Manguera.
 Agujas de jeringa.
 Probeta 25ml.
 Tapones para tubos de ensayo.
 Soporte universal.
Reactivos
 Levadura fresca al 10%.
 Glucosa al 10% y 30%.
 Fructosa al 30%.
 Sacarosa al 30%.
 Almidón al 1%.
 NaF 0.1M.
 Agua destilada.
 Adicione a un tubo de ensayo 2ml de solución de glucosa al 10% colóquelo en

un baño de agua a 35-37 °C durante 2 minutos y luego añada 5ml de la
suspensión de levadura.
 Tape el tubo de ensayo con un tapón de caucho, agite y atraviese el tapón con
la aguja de jeringa desechable.
 Monte el sistema mostrado en la siguiente figura:
Nota: La probeta se llena con agua, se tapa con el dedo pulgar, se invierte y se
sumerge en el beaker con agua. La probeta debe contener agua, hasta donde termine
la marcación.
 Apenas comience a burbujear cronometre 15 minutos y lea en la probeta el

volumen desplazado. Tenga en cuenta el volumen inicial y résteselo al volumen
final.
 Repita los pasos anteriores con: glucosa, fructosa, sacarosa y almidón y en
diferentes porcentajes P/V.
 Adicione a un tubo de ensayo 5ml de suspensión de levadura, 2 ml de solución

glucosa al 10% y 1ml de agua destilada y repita los pasos desde el segundo
hasta el cuarto.
 Por ultimo, coloque en un tubo de ensayo 5ml de suspensión de levadura, 2ml

de solución de glucosa al 10% y 1ml de la solución de NaF y repita los pasos
desde el segundo hasta el cuarto.
 Anote los datos en la siguiente tabla.
Glucosa Glucosa
Glucosa Glucosa Fructosa Sacarosa Almidón
10% con 10%con
Carbohidrato 1% 10% 10% 10% 1%
agua NaF
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
Tubo 6 Tubo 7
Volumen
Residuos
Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos, dispóngalos por el desagüe.
Resultados
 Compare los volúmenes obtenidos en los tubos 1 y 2 ¿A que se debe el

resultado?
 Escriba la reacción neta balanceada de la fermentación de cada uno de los
carbohidratos.
 Según las ecuaciones del numeral anterior, ¿Dónde ocurrirá la mayor
producción de CO2? ¿Esta ello de acuerdo con los datos obtenidos
experimentalmente? Explique (Compare los volúmenes de los tubos 2, 3, 4 y 5)
y ordene los carbohidratos según la rapidez en la fermentación.
 ¿Cómo interpretaría el efecto del fluoruro de sodio (NaF) sobre la
fermentación? (compare los tubos 6 y 7).
Preguntas
 ¿En que consiste la fermentación láctica y glicérica? ¿En que diferencian de la

fermentación etanólica?
 El arsenato (AsO4-3) es químicamente similar al fosfato inorgánico (PO4-3) y
algunas enzimas que utilizan fosfato inorgánico pueden utilizar también
arsenato. La producción de ATP en la glucolisis es inhibida por el arsenato
identifique las enzimas que pueden ser afectadas.
 Además de ATP, se forman otros dos productos importantes en la glicolisis
¿Cuáles son?
 Enumere algunos inhibidores de la glicolisis.
Bibliografía
 Movak M, Strehaiano, P, Moreno M, Goma G. Alcoholic fermentation: On the
inhibitory effect of ethanol. Biotechnol. Bioeng. 1981; 23: 201-211.
 David Nelson, Michael Cox. Lehninger Principios de Bioquímica. Quinta Edición.
Ediciones Omega S.A. Barcelona, España. 2009. Traducción de: David Nelson,
Michael Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. Fifth edition. W.H. Freeman
Company. New York, United States. 2009.
PRÁCTICA # 9 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA

5-324
Objetivo
 Comprender e identificar los conceptos básicos, teóricos y prácticos, relacionados
con la separación de proteínas a través del método de electroforesis
Aspectos Teóricos
El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas

cargadas eléctricamente a través de un gel u otro tipo de matriz en un campo
eléctrico. A un pH determinado, muchas moléculas biológicas poseen carga eléctrica,
cuya magnitud depende del pH y composición del medio en que se encuentren. Con
técnicas electroforéticas, es posible separar de acuerdo a su tamaño o masa molecular
los diferentes componentes de una mezcla de aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos y otras biomoléculas cargadas.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que
tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de
desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es
proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor
carga por unidad de masa más rápida será la migración.
La electroforesis de proteínas se realiza en geles, la más común es la poliacrilamida

(PAGE, del inglés Polyacrylamide gel electrophoresis). La PAGE se desarrolla en
condiciones en las que no se altera la conformación nativa de las proteínas separadas,
por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse estudios de funcionalidad de
dichas proteínas separadas (actividad enzimática, capacidad de unión de anticuerpos,
unión a receptores, etc.). Otra modalidad de electroforesis, es la desnaturalizante,
más común, donde se somete a las proteínas a migración asegurando la completa
desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En esta situación la
migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. El
agente desnaturalizante más empleado es el dodecilsulfato de sodio o SDS, un
detergente, el cual otorga una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar
a través del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de
cargas negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo
una relación carga/masa similar. Una tercera forma de realizar la electroforesis de
proteínas, es desnaturalizarlas y posteriormente ponerlas en contacto con un agente
reductor, que provoca la ruptura de los puentes disulfuro. Esta metodología permite
evidenciar si la proteína problema esta formada por de una cadena polipeptídica y se
conoce como electroforesis en condiciones reducidas.
En esta práctica se pretende separar las proteínas del suero fetal bovino tanto en
condiciones desnaturalizantes como reducidas.
Materiales
 Cámara de electroforesis vertical y accesorios.
 Micropipetas de 20, 200 y 1000 µL.
 Gradillas de plástico.
Reactivos
 Solución de poliacrilamida al 12% .
 Buffer Tris-HCL 1,5 M pH= 8,8 .
 Buffer Tris-HCL 0,5M pH= 6,8.
 Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% .
 Persulfato de amonio (APS) al 10% recién preparado.
 N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED solución stock).
 Agua destilada.
 Buffer de muestra.
 Azul de coomasie R-250.
 Agente Fijador.
 Agente decolorante.
Nota: Precaución, la acrilamida y bisacrilamida como monómeros son potentes

neurotoxicos acumulativos que se absorben rápidamente por la piel, no pipetear con la
boca ni manipular las soluciones sin usar guantes.
 Armar la cámara de electroforesis ensamblando el molde para el gel utilizando

vidrios de 0.75 mm de espesor, según las especificaciones del profesor.
 Mezclar en dos tubos los reactivos para la preparación del gel separador y
espaciador en las cantidades descritas con excepción del persulfato de amonio,
que se agrega en el momento antes de adicionar los geles.
 Primero preparar el gel INFERIOR o de separación.
COMPONENTES CONCENTRACIÓN FINAL

CANTIDADES 20% 15% 12% 10%
EN µl
Agua 367 1167 1683 2000
desionizada
Amortiguador 1250 1250 1250 1250
inferior
SDS 50 50 50 50
Acrilamida/ 3333 2500 2000 1667
bisacrilamida
TEMED 6 6 6 6
Persulfato de 30 30 30 30
amonio
El volumen que se adiciona a cada uno de los tubos es de 3600 µl
Ésta mezcla gelifica aproximadamente en 30 a 45 minutos.
 Preparar el Gel superior o de apilamiento.
COMPONENTE CANTIDAD
Agua desionizada 1500 µl
Buffer superior 630 µl
SDS 33 µl
Acrilamida/ bisacrilamida 330 µl
TEMED 5 µl
Persulfato de amonio 20 µl
 Se coloca inmediatamente el peine para formar los pozos donde

posteriormente será sembrada la muestra. Esta mezcla gelifica
aproximadamente en 30-40 minutos. Una vez gelificado se procede a quitar el
peine deslizándolo suavemente y se lava delicadamente con agua destilada
para eliminar algunos residuos no gelificados.
o Ensamblar la cámara según las instrucciones del profesor.

o Sembrar 20 µl de la muestra a evaluar y 10 µl de marcador de peso
molecular.
o Llenar la cámara con el amortiguador de corrida 1x: 180 ml en el tanque

interior y 120 ml en el exterior. Colocar el gel en la cámara y correr las
muestras a 120 V (voltaje constante) hasta que el azul de bromofenol llegue
casi al borde inferior del gel (aproximadamente 60 min).
o Separar los vidrios que contienen el gel con cuidado. Sacar el gel y eliminar
la parte del gel espaciador.
o Colocar los geles en una solución fijadora por media hora.
o Teñir el gel con colorante Coomassie, sumergiéndolo durante 1 hora con

agitación constante. Luego se elimina el exceso del colorante con varios
cambios de decolorante.
o Registrar los resultados fotografiando el gel.
Preguntas
 Cuál es la influencia de:
o El pH del gel de apilamiento sobre la calidad de las bandas.
o La concentración de monómero en el gel de separación sobre la
capacidad para diferenciar dos proteínas con pI muy parecidos.
Bibliografía
 Lomonte B, Rojas L. Inmunología manual de laboratorio. Universidad de Costa

rica. Facultad de Microbiología, 1996.

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