Biotecnología de los Alimentos

Tema 4: Producción de enzimas industriales.

Enzimas: ventajas aplicadas a los alimentos

1.- Los enzimas son piezas esenciales del metabolismo, actuando
como catalizadores de las reacciones de anabolismo (síntesis )y
catabolismo (degradación ) que suceden en la célula.
2.- Su gran especificidad de catálisis sin generación
prácticamente de subproductos facilita que no se produzcan
reacciones laterales imprevistas. Asímismo se puede trabajar en
condiciones moderadas de temperatura, concentración de
solutos, pH, etc (condiciones fisiológicas), lo que evita
alteraciones de los componentes más lábiles del alimento.
3.- Las acciones enzimáticas son naturales desde el punto de vista
de la sanidad alimentaria.
4.- Los enzimas pueden inactivarse fácilmente tras cumplir su
cometido, quedando entonces asimilados al resto de las
proteínas presentes en el alimento.

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 Campos de aplicación de los enzimas

Relevancia de las aplicaciones al mundo alimentario

Industrias alimentarias que usan enzimas

1.- Industria láctea: Quimosina y pepsina. Degradan la caseína y
producen coagulación. Lactasa para degradar el azúcar lactosa.
2.- Panificadoras: Lipoxidasa. Blanqueante del harina. Facilita el
amasado. Amilasa para romper el almidón y favorecer la acción de las
levaduras. Proteasa para romper el gluten.
3.- Industria cervecera: Uso de amilasa para degradar el almidón y
generar azúcar libre con el que las levaduras producirán alcohol por
fermentación. Uso de papaína y bromelaina para degradar posibles
proteínas a aminoácidos (elimina la turbidez).
4.-Fabricación de zumos: Enzimas degradadoras de pectinas. Libera
azúcares, reducen la turbidez generada por la pulpa y fluidifican el
zumo.
5.- Fabricación de jarabes: alfa-amilasas y amiloglucosidasas. Liberan
azúcares (glucosa o fructosa). Fabricación de jarabes de glucosa o
fructosa (por acción glucoisomerasa sobre la glucosa) a partir de
almidón de maiz.

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Aprovechamiento industrial de microorganismos

Células como productos finales o como biorreactores para

obtención de metabolitos primarios y secundarios.
Obtención mediante el uso de cepas seleccionadas o bien
modificadas genéticamente.

Producción de metabolitos primarios y secundarios

Metabolitos primarios
Moléculas de bajo peso molecular que intervienen en las
distintas rutas anabólicas y catabólicas, bien como productos
finales o bien como intermediarios: aminoácidos, vitaminas,
nucleotidos, alcoholes, ácidos orgánicos.

1) Son necesarios para el crecimiento del microorganismo que

los produce.
2) Se producen como productos únicos.
3) Son producidos por todos los microorganismos: son
metabolitos universales.
4) La producción no puede perderse fácilmente por mutación
espontánea.

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Producción de metabolitos primarios y secundarios
Metabolitos secundarios
Moléculas de distinto peso molecular que se producen cuando la
velocidad de crecimiento es baja. No tienen una función esencial
en el crecimiento: antibióticos, antitumorales, inhibidores de
proteasas, inmunosupresores, toxinas, alcaloides, pigmentos,
enzimas.
1) No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que
los produce.
2) Generalmente se producen como mezclas de productos muy
relacionados químicamente entre sí.
3) La producción puede perderse fácilmente por mutación
espontánea.
4) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy
reducido de organismos.

Producción de metabolitos primarios y secundarios

Primarios

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Producción de metabolitos primarios y secundarios

Secundarios

Curva de crecimiento microbiano

1.-Fase de latencia. 2.- Fase exponencial.
3.- Fase estacionaria. 4.- Muerte celular.

Trofofase
(metabolismo
primario)
Idiofase
(metabolismo
secundario).
Solo observado en
algunos
microorganismos

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 Biotecnología de los Alimentos
Tema 4: Producción de enzimas industriales.

Fuentes naturales de microorganismos

Fuentes de microorganismos
1.- Fuentes naturales: aguas, suelos, plantas y deshechos. Muestreo
y selección (screening). Criterio de selección: el microorganismo
debe expresar en ese ambiente las propiedades de interés.
2.- Procedentes de colección: American Type Culture Collection
(ATCC; USA), Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes Nationale (France), National Collection of Type
Culture (France), etc.

Estrategias de aislamiento de microorganismos

1) Aislamiento directo: El medio debe permitir la máxima
capacidad de expresión del genoma del organismo de interés.
2) Enriquecimiento del cultivo, con o sin pre-tratamiento de la
muestra. Incremento en una población mixta del número de
organismos de interés respecto a los demás.

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 Conservación de microorganismos

1.- Preservar la pureza genética y propiedades bioquímicas.

2.- Preservación de los niveles iniciales de producción.
3.- Transporte y manipulación facilitados..
Para conservar adecuadamente es preciso conocer las características
genéticas y bioquímicas del organismo.

Métodos de preservación

1) Subcultivo: repique del cultivo original en medio fresco. Riesgo

de contaminación y de mutación.
2) Congelación: Descenso de la actividad metabólica de una célula
en estado estacionario. Uso de crioprotectores (10% DMSO).
Peligro de recristalización a temperaturas extremadamente bajas
(-50 ºC ó -60 ºC).
3) Liofilización: Método más adecuado para preservación de
microorganismos. Combina la congelación con la sublimación del
agua del medio y celular. Necesidad de tiempo de recuperación.
4) Otros: Preservación en celulosa, cultivos en tierra, capa de aceite.

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 Biotecnología de los Alimentos
Tema 4: Producción de enzimas industriales.

Desarrollo de microorganismos productores

Desarrollo de cepas
1.- Mutagénesis inducida utilizando rayos X, análogos de bases
nitrogenadas, rayos u.v., etc.

Tras la mutagénesis:
1.1- Se evalúa la actividad de interés en los mutantes
1.2- Se efectúa el proceso de preselección de mutantes como paso
previo a la evaluación de la producción.
1.2.1.- Por interacción con el propio producto.
1.2.2.- En la búsqueda de superproductores de precursores.
1.2.3.- Selección de mutantes resistentes a iones metálicos
pesados.
1.2.4. Destoxificación selectiva.

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 Desarrollo de cepas
2.- Recombinación genética: se utiliza para traspasar funciones
de una cepa a otra.
2.1.-Recombinación parasexual. Fusión de protoplastos.
2.2.-Mutagénesis dirigida.
2.3.- Aumento de la dosis génica de enzimas biosintéticas de
pasos limitantes.
3.- Selección natural: enriquecimiento en una mezcla de
organismos el microorganismo de interés.

El mejoramiento de cepas industriales permite incrementar el

rendimiento de los procesos de interés. La productividad potencial
de un organismo viene marcada por su genoma, las
modificaciones (naturales o no) que este reciba y la correcta
modulación de las características del medio de cultivo.

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 Biotecnología de los Alimentos
Tema 4: Producción de enzimas industriales.

Modificación de enzimas y mejora de la actividad catalítica

D-Glucosa

Enzimas: conceptos generales

Hexoquinasa

1.-Unidades funcionales del metabolismo celular. Catalizadores

de las reacciones biológicas que no alteran la constante de
equilibrio de las reacciones que catalizan.
2.-Proteínas compuestas sólo por aas, o también proteínas con
cofactores.
3.-Gran poder catalítico: reducen en órdenes de magnitud el
tiempo necesario para que tenga lugar la reacción.

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 D-Glucosa

Enzimas: conceptos generales

Hexoquinasa

4.-Presentan un alto grado de estereoespecificidad por el sustrato,

lo cual deriva en ausencia de subproductos (alta eficacia de
reacción).
5.-Actúan en soluciones acuosas en condiciones suaves de
temperatura y pH: entorno fisiológico.
6.-Su actividad puede regularse por varios mecanismos (nivel de
sustrato, pH, Temperatura, reguladores alostéricos, etc).

A nivel industrial, interesan las actividades degradativas

controlables por inducción, represión, Feed-Back, represión catabólica,
etc. Interesa alterar los mecanismos de control y producir esa actividad
en ausencia del inductor e incluso en presencia del represor.

1.- Mediante técnicas de ADN recombinante, modificamos la

capacidad catalítica de un enzima interviniendo sobre la
codificación de los aminoácidos clave del centro activo.
Modificamos su capacidad de regulación incidiendo sobre los
aminoácidos de los sitios reguladores.
2.- Mediante cultivo en concentraciones limitantes de inductor,
se pueden seleccionar mutantes constitutivos (expresan el enzima
tanto en ausencia como en presencia del inductor): presión
selectiva para enriquecimiento del cultivo en mutantes de interés.

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 Ejemplo de catálisis enzimática con cofactor
Activación por Zn2+ de la proteasa carboxipeptidasa A

Carboxipeptidasa A: Hidrólisis de aas con grupos carboxilo libres

Regulación feed-back de un proceso por inhibición de

un enzima que actúa dentro de una vía

Enzima

Primer paso limitante

Producto
final

feed-back negativo

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Regulación feed-back de un proceso por inhibición de
un enzima que actúa dentro de una vía

Feedback negativo Feedback positivo

(fast forward)

Regulación alostérica de la fosfofructokinasa

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 Modificación covalente reversible

Fosforilasa del Glucógeno

Regulación actividad enzimática por
modificación covalente reversible

Piruvato
Quinasa

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Activación de Zimógenos
Pancreáticos

Forma precursora
(inactiva)

Quimotripsina

Forma más corta

(activa)

Biotecnología de los Alimentos

Repaso de Bioquímica (2do curso).

Purificación de enzimas

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 Purificación de proteínas
Definiciones:

Purificación a homogeneidad:
Obtención de la proteína como especie molecular única en una solución.
Enriquecimiento ó purificación parcial:
Obtención de la proteína como especie molecular predominante en una solución.

Para purificar proteínas se precisa:

1.- Material biológico adecuado y en cantidad suficiente (paso limitante).

2.- Método de reconocimiento de proteínas (colorimetría/espectrometría).
3.- Elección de la ó las técnicas de purificación más adecuadas, en función de las
características fisicoquímicas de la proteína (solubilidad, carga eléctrica, tamaño
molecular, interacciones con otros compuestos, etc.).

Técnicas de purificación: Solubilidad (Salting-In y Salting-Out)

I = ½ E (Ci x Zi2)
I = Fuerza iónica de la sal.
Ci = Concentración de ión.
Zi = Carga del ión.

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 Purificación por tamaño molecular

Ultrafiltración (5-500 kDa)

Diálisis

Purificación por tamaño molecular Exclusión molecular

Animación en
Campus Virtual

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 Purificación por carga eléctrica
Intercambio iónico
Intercambio Catiónico Intercambio Aniónico

Animaciones
en Campus
Virtual

Separación por carga eléctrica

Electroforesis
Log10kDa

Distancia (cm)

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 Purificación por otros métodos
Cromatografía de afinidad

Animación en Campus Virtual

Purificación por otros métodos

Cromatografía en fase reversa (Basada en la hidrofilia de las proteínas)
Decantación

Columna

Animación en Campus
Virtual

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 Cuantificación por colorimetría
Ley de absorción de luz ó de Lambert-Beer

Espectrometría: medida de la concentración de proteínas de una muestra a 280 nm de

longitud de onda (luz UV). Medida directa.
Colorimetría: medida de la concentración de proteínas de una muestra longitud de onda
en el rango visible. Necesaria la interacción de un colorante con la proteina.

Cuantificación por colorimetría

Ley de absorción de luz ó de Lambert-Beer

En presencia de proteínas, el azul de Coomassie (principio activo del reactivo

de Bradford) cambia de una situación catiónica (protonada) a una situación
aniónica (desprotonada), variando así de color rojo a color azulado. A mayor
concentración de proteínas, mayor intensidad de color azul y mayor valor de
absorbancia en el colorímetro. Comparando con un patrón que relacione valores
de absorbancia con concentraciones conocidas de proteína, podemos conocer la
concentración de proteína de nuestra muestra problema midiendo su
absorbancia.

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