Manuscrito aceptado

Percepciones estructurales sobre el papel de la difthamida en el

factor de alargamiento 2 en el mantenimiento del marco de
lectura de ARN mensajero

Simone Pellegrino, Natalia Demeshkina, Eder Mancera-

Martinez, Serguéi Melnikov, Angelita Simonetti, Alexander
Myasnikov, Marat Yusupov, Gulnara Yusupova, Yaser
Hashem

PII: S0022-2836(18)30582-5
DOI: doi:10.1016/j.jmb.2018.06.006
Referencia: YJMBI 65758
Para aparecer en: Journal of Molecular Biology
Fecha de recepción: 29 de enero de 2018
Fecha revisada: 11 de mayo de 2018
Fecha aceptada: 4 de junio de 2018

Por favor, cite este artículo como: Simone Pellegrino, Natalia Demeshkina, Eder
Mancera- Martínez, Serguéi Melnikov, Angelita Simonetti, Alexander Myasnikov,
Marat Yusupov, Gulnara Yusupova, Yaser Hashem , Perspectivas estructurales sobre
el papel de la difthamida en elfactor deción de alargamiento 2 en el mantenimiento del
marco de lectura de ARN mensajero. Yjmbi (2018), doi:10.1016/j.jmb.2018.06.006

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 MANUSCRIPT ACEPTADO

PÁGINA DE TÍTULO

Structural insights into the role of diphthamide on elongation

factor 2 in messenger RNA reading frame maintenance

Simone Pellegrinoa, Natalia Demeshkinaa,d, Eder Mancera-Martinezb, Serguéi Melnikova,e,

ACCEPTED MANUSCRIPT
Angelita Simonettib, Alexander Myasnikova, Marat Yusupova,c,1,Gulnara Yusupovaa,1, Yaser

Hashemf,1

un
Departamento de Biología Estructural Integrada, Instituto de Genética y Biología Molecular y Celular, CNRS

UMR710, INSERM U964, Universidad de Estrasburgo, Estrasburgo 67000, Francia.

b
Arquitectura y Reactividad del ARN, Universidad de Estrasburgo, Instituto ofBiología Molecular y Celular de

el CNRS UPR9002, Estrasburgo 67084, Francia.

c
Instituto de Medicina Fundamental y Biología, Universidad Federal de Kazán, Kazán 420008, Rusia.
d
Discurso actual: Centro de Bioquímica y Biofísica, Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre,

Bethesda, Maryland, Estados Unidos.

e
Dirección actual: Departamento deBiofísica y Bioquímica molecu lar, Universidad de Yale, New Haven, CT

06520, Estados Unidos.

f
ARN ARNA, Universidad U1212 Université de Burdeos, Instituto Europeo de Química y Biología (IECB)

Inserm,Pessac 33600, Francia.

1
A quién debe dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: marat@igbmc.fr o gula@igbmc.fr o
yaser.hashem@u- bordeaux.fr

 Autores correspondientes:
Marat Yusupov E-mail: marat@igbmc.fr

Instituto de Genética y Biología Molecular y Celular (IGBMC)

1
1 Rue Laurent Fries / BP 10142 / 67404 Illkirch
CEDEX Teléfono: '33 (0)3 88 65 33 01

Gulnara Yusupova E-mail: gula@igbmc.fr

Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC)

1 rue Laurent Fries / BP 10142 / 67404 Illkirch CEDEX

Teléfono: +33 (0)3 88 65 35 45

ACCEPTED MANUSCRIPT
Correo electrónico de Yaser Hashem:
yaser.hashem@u-bordeaux.fr Instituto Europeo de Química y
Biología (IECB)
2 Robert EscarpitStreet, 33600 Pessac
Teléfono: +33 (0) 5 40 00 88 22
Abstracto

One of the most critical steps of protein biosynthesis is the coupled movement of messenger

RNA (mRNA), that encodes genetic information, with transfer RNAs (tRNAs) on the

ribosome. In eukaryotes this process is catalyzed by a conserved G-protein, the elongation

factor 2 (eEF2), which carries a unique post-translational modification, called diphthamide,

found in all eukaryotic species. Here we present near-atomic resolution cryo-EM structures of

ACCEPTED MANUSCRIPT
yeast 80S ribosome complexes containing mRNA, tRNA and eEF2 trapped in different GTP-

hydrolysis states which provide further structural insights on the role of diphthamide in the

mechanism of translation fidelity in eukaryotes.

resúmenes

 Estructuras de resolución casi atómicas de 80S/tRNA/mRNA/eEF2 en diferentes

estados hidrolyticos

 eEF2 regula el paso de translocación y asegura la fidelidad de la traducción

 La modificación de la difthamida podría desempeñar un papel fundamental

en el mantenimiento del marco de lectura del ARNm

Palabras clave

Translocación ribosoma, crio-EM, eEF2, difthamida, maintenance de marco de lectura

Introducción

Durante la síntesis de proteínas, el ARNm y el ARN se mueven de manera coordinada y

precisa a lo largo del ribosoma. En eucariotas, este complejo proceso de translocación está

garantizado por un GTPase traslacional, factor de alargamiento eEF2, que es homólogo al

factor de alargamiento bacteriano EF-G 1.

According to structural and biochemical experiments, after peptidyl transfer reaction the

small ribosomal subunit (SSU) spontaneously rotates relative to the large ribosomal subunit

(LSU). This rotation results in the movement of acceptor ends of tRNAs on LSU to P and E

site while leaving main bodies of tRNAs bound to the A and P sites of SSU (A/P and P/E

hybrid states, respectively) (see review 2). In addition to this intersubunit ratcheting-like

motion, large conformational changes occur inside SSU by itself. Thus, swivelling of the

ACCEPTED MANUSCRIPT
head domain and rearrangement of the shoulder promote further movement of tRNAs on

SSU from their A and P sites to the P and E sites. These rearrangements are coordinated and

catalyzed by eEF2, which hydrolyzes GTP and controls the precise movement of mRNA with

tRNA through multiple intermediate states .

Los principales conocimientos estructurales sobre la dinámica del ciclo de

alargamiento eucariota, en presencia de ARNm y ARNm, han sido proporcionados

porreconstrucciones crio-EM de baja y intermas de resolución de diatismo que permitieron

comprender los principales reordenamientos conformacionales responsables de guiar el

3; 4; 5
proceso de translocación . Estas instantáneas fueron capturadas en diferentes estados de

hidrólisis GTP y sugirieron que that eEF2 se une a un ribosoma trinquete como se descubrió

originalmente en las bacterias (ver revisión 2). No obstante, debido a las limitadas

resoluciones obtenidas por estas reconstrucciones, una comprensión estructural detallada del
6; 7
mecanismo por el cual eEF2 cataliza laansaubicación en eucariotas seguía sin estar clara. .

La difthamida está dirigida por al menos dos toxinas virulentas – toxina de la difteria y

Pseudomonas aeruginosa exotoxina A – que transfieren la ribosa ADP a la modificación e

inactivan eEF2 que conducen a la muerte celular 7. La biosíntesis de la difitema se

logramediante un conjunto de proteínas altamente conservadas: las cepas de levadura que

carecen de estas enzimas muestran un aumento del cambio de trama del ARNm, lo que

apunta a un papel crucial de la modificación en

protein synthesis fidelity 6. Furthermore, in mammals, defects in the diphthamide synthesis

can lead to certain neurodegenerative diseases 8. Consequently, in order to better understand

how diphthamide regulates ribosomal translocation, there is an evident need for structures at

higher resolution.

Aquí presentamos reconstrucciones de resolución casi atómicas, obtenidas por crio-EM, de

ribosomas eucariotas 80S, que contienen eEF2 en diferentes estados hidrolíticos, ARN y

ACCEPTED MANUSCRIPT
ARNm, proporcionando nuevas perspectivas sobre el papel que la modificación única de

eucariotas post-traduccionalde la difthamida podría tener para asegurar el marco correcto de

lectura del ARNm. Este estudio nos ha permitido visualizar en detalle la implicación directa

de la difthamida con el ARNm en el contexto de un ribosomas translocantes.

Resultados y discusiones

Estructuras de resolución casi atómica de ribosomas en un paso intermedio de

translocación Para comprender más profundamente el papel de la difthamida en la

translocación ribosomal, resolvimos tres estructuras crio-EM de resolución casi atómica de

levadura 80S/tRNA/mRNA/eEF2 componelexes atrapadas en diferentes estados de hidrólisis

GTP. "Complejo GMPPCP" se formó utilizando ribosomas 80S de Saccharomyces

cerevisiae, 24 nucleótidos de ARNm largo que contienen 3 codones de fenilalanina

consecutivos, levadura cognate tRNAPhe GAA, eEF-2 nativo de S. cerevisiae y GMPPCP,

unanálogo nohidrolizable de GTP. El "complejo GMPPCP" fue reconstruido a 3,8o (Fig. 1,

2a-e, 3a-b, Suplemento Fig. 1 y 2a). El segundo complejo 80S, "AlF4-/sordarin complex", se

formó por la adición de PIB y fluoruro de aluminio (AlF4-) en lugar de GMPPCP. Además,

añadimos el fármaco sordarina,que se dirige específicamente a los hongos eEF2 impidiendo

9.
su liberación del ribosoma Anteriormente, se demostró que AlF4imita el fosfato de GTP 10

durante la hidrólisis en GTPases. Por lo tanto, GDP-AlF4- presumiblemente atrapa el eEF-2

ribosoma 80S en un estado de transición de hidrólisis GTP en

the present complex. The "AlF4-/sordarin complex” was reconstructed at 3.7Å (Fig. 2f-i, 3c-d

and Supplement Fig. 1 and 2b). The third 80S ribosome complex, “GMPPCP/sordarin

complex”, was formed as it was described above for “GMPPCP complex”, but in the

presence of sordarin. This complex was designed to provide understanding of the drug when

eEF2 is bound to the ribosome in a GTP-like state. The “GMPPCP/sordarin complex” was

reconstructed at 4.30Å average resolution (Fig. 2j-m, 3e-f, Supplement Fig. 1 and 2c).

ACCEPTED MANUSCRIPT
Con el fin de obtener la población más homogénea para cada complejo, realizamos varias

rondas de clasificación 3D. trabajos de refinamiento 3D en RELION 11,

con o sin máscaras

definidas por el usuario (Procedimientos experimentales, Suplemento Fig. 1), cubriendo así

todo el 80S (junto con eEF2, tRNA y ARNm), la SSU (junto con eEF2, tRNA y ARNm), o el

LSU (junto con las regiones más estables de la SSU en su lado entre subunidad, eEF2,

TRNA y ARNm), respectivamente. Estos refinamientos locales se realizaron para permitir

una mejor alineación de las partículas alrededorde las regiones de interés, lo que llevó a

reconstrucciones de mayor resolución con un núcleo ribosomal mejor resuelto (Fig. 1 y

Suplemento Fig. 1). A pesar de nuestros esfuerzos en mejorar la resolución de nuestras

reconstrucciones, la resolución local de eEF2, especially para el dominio IV, representa un

verdadero cuello de botella y persiste en un rango entre 4 y 4,5o (Suplemento Fig. 1). Se

informó previamente de un alto nivel de flexibilidad del dominio IV de eEF2 vinculado al

3; 4; 5
ribosoma . En términos más generales, en comparación con laresolución ocal de 60Sl,

parece que eEF2 mantiene un cierto nivel de flexibilidad en torno a las conformaciones

globales observadas. Esto se debe al hecho de que la SSU adopta un continuo de sutiles

conformaciones en torno a su estado rotado observado, lo que a su vez afecta a laestabilidad

de eEF2, limitando así las resoluciones de nuestros complejos para este último. Tal continuo

de los movimientos de la SSU alrededor de una posición óptima promedio es un problema

habitual y persistente en la mayoría de los estudios crio-EM reportados de varios complejos

ribosomales. La clasificación de partículas 3D más extensa no resolvió el problema de

flexibilidad de SSU, probablemente debido a la naturaleza continua de
the subtle moments around the observed conformation. However, as it is described and

supported by our figures herein, the quality of our maps is sufficient to resolve the different

conformations of the diphthamide modification and provide insightful structural

understanding of its engagement in ribosomal translocation (Fig. 1, 2, 3, 4, Supplement Fig. 3

and 4). Because of the consistent limited resolution of eEF2 (comprised between 4 and 4.5 Å)

among our three complexes in spite of their different global resolutions, which is due to their

ACCEPTED MANUSCRIPT
inherent flexibility, we didn’t attempt improving the resolution by collecting more data.

Nuestras reconstrucciones revelan que el ARNR se une en el estado híbrido P/E, por

superposición con la estructura de un ribosoma 12 girado 80S•tRNA (PDB: 3j77) (Fig. 1, 2a,

3 y Suplemento Fig. 5a). Sin embargo, observamos un más extendido en sentido antihorario

quead swivelling de 9,5o

13
(http://rna.ucsc.edu/rnacenter/erodaxis.pyhttp://rna.ucsc.edu/rnacenter/erodaxis.py)

(Suplemento Fig. 5b),

similar al complejo de levadura 80S/eEF2 en presencia del virus del síndrome de Taura

(TSV) IRES (PDB: 5juu; Suplemento 5b), donde se propone que la SSU se gire

completamente 14. Para obtener los complejos in vitro más cercanos a fisiológicamente

relevantes, no utilizamos ningún fármaco estabilizador de TRNA en el sitio A (ver revisión

2),
como aminoglucósidos o tuberactinomicinas. El alojamiento de tRNA en el estado híbrido

P/E es impulsado principalmente por la rotación de subunidades similares a trinquetes (RSR)

que nosotros y otros observamos 3. Aunque nuestro sur de ardorse diseñó para acomodar un

ARN en el sitio A, no observamos ninguna densidad para ello en nuestras reconstrucciones.

Esto es probablemente debido a la baja afinidad que el TRNA desatilado tiene para el sitio A,

y al hecho de que la unión simultánea de A-tRNA y eEF2 en estado similar a GTP al

15
ribosoma dan como resultado un estado altamente dinámico y transitorio . La comparación

estructural con los complejos bacterianos 70S/tRNA/mRNA/EF-G en presencia de GMPPCP

(PDB: 4v90 y 4v9H) también confirmó que nuestras estructuras son representatives de
 16; 17
estados intermedios de translocación (Suplemento Fig. 6). También encontramos que

en nuestros complejos se produce un desplazamiento adicional de 7o del codo tRNA, junto

con un movimiento de la L1-

acecho hacia la LSU (Suplemento Fig. 6a). Este estado probablemente corresponde a uno
14
de los primeros intermedios del ribosoma "desbloqueado" inducido por eEF2 .

The binding of diphthamide to mRNA at position +4 appears to be crucial for

translation fidelity

El mecanismo molecular por el cualla difamida participa en la translocación ribosomal es

14; 18
ACCEPTED MANUSCRIPT
altamente complejo y las estructuras recientes representan sólo un estado hidrolítico de eEF2

. El análisis del "complejo GMPPCP" muestra que la difthamida de eEF2 apunta hacia la

trayectoria del ARNm ("estado exterior") e interactúa con su mitad de la columna vertebral

del azúcar en la posición +4 (Fig. 2b, 3b, 4 y Supplement Fig. 3a-c y 4a). La posición de la

punta del dominio IV, y en consecuencia de la difthamida, en relación con el ARNm sugiere

que, cuando eEF2 está ligado al 80S ribosome en el estado similar ala GTP, la difthamida

podría funcionar como un 'pawl' que impide el deslizamiento o el cambio de trama del

ARNm, asegurando así la fidelidad de la translocación como se propuso anteriormente, así

3; 19; 20
como en la bacteria .

Puente intersubunidad B2a, compuesto principalmente por la parte superior de la

3; 21
hélice 44 (h44) en la SSU y el bucle apical de hélice 69 (H69) en la LSU , desempeña un

papel fundamental en la translocación ribosomal 3. A pesar del hecho de que la

conformación general de la región B2a no cambia significativamente en comparación con las

bacterias (Suplemento Fig. 6b), la visión de primer plano de los nucleótidos decodificación

A1755/56 (A1492/93 en E. coli) deRRNA 18S y A2256 (A1913 en

E. coli) de RRNA 25S revela varios reordenamientos notables (Fig. 3). En el "complejo

GMPPCP", por ejemplo, A1755 y A1756 residen dentro de la ranura menor de h44 (flip-

in) con A2256 de H69 situado fuera de la ranura y estabilizado por interacciones con

A1756 (Fig. 2b y 3b).

En la reconstrucción crio-EM del "complejo AlF4-/sordarin", en el que eEF2 está

atrapado en un estado de transición después de la hidrólisis GTP (Fig. 2f, 3d, Supplement

Fig. 2b y
4b), diphthamide points towards the DC and interacts with the sugar-phosphate backbone of

decoding nucleotides A1755/56. In this complex A1756 is in a flipped-in intermediate

conformation as compared to the “GMPPCP complex” (Fig. 3b, 3d and Supplement Fig. 2a-b

and 3d-f), while A1755 adopts a different conformation. Both residues of the decoding center

(DC) create a network of interactions with the tip of H69, precisely residue A2256. The

conformational change of A1755 likely impedes A1756 to flip-in completely as seen for the

ACCEPTED MANUSCRIPT
“GMPPCP complex” (Fig. 3).

La sordarina induce una conformación diferente de la difthamida en el estado similar

al GTP Sordarin se sabe que se une al dominio III de fúngica eEF2 (Fig. 2h y 2l) y sugiere

evitar la liberación de eEF2 del ribosoma 9. En el "complejo GMPPCP/sordarina" la

difthamida se voltea 180o hacia eEF2, adoptando una conformación alternativa, que

denominamos

"inward" (Fig. 2j, 3e-f, Supplement Fig. 2c y 3g-i), con A1756 que se voltea, que se asemeja
16; 22
al estado desocupado "preformado" de la DC en la bacteria . Particularmente, la punta

de los puntos H69 dentro del DC, induciendo el reordenamiento de A1756 y muy

probablemente promoviendo el apilamiento de A2256 y A1755 (Fig. 2j y 3f). Sin embargo, a

22
diferencia de (i) prokaryotic 70S/mRNA/2tRNAs complejo con A-site desocupado y ii)
16; 17
pre-translocación 70S/mRNA/tRNA/EFG/GMMPCP complejo , observamos una

interacción adicional entre A1756 y la columna vertebral del ARNm en la posición +5 (Fig.

3f). Nuestros datos sugieren que la sordarina afecta la conformación de la punta del dominio

IV de eEF2, y a su vez la posición de la difthamida, conservando así la modificación de

interactuar estrechamente con h44 y el ARNm. La unión de las restricciones de la sordarina

más eEF2 dominio III, que a su vez influye en la posición de la difthamida (Fig. 2, 3 y

Suplemento Fig. 2c). Esto está de acuerdo con estudios anteriores, donde se demostró que la

sordarina impide que el dominio III se aleje del centro de activación GTPase del bucle
desarcina-ricina, evitando así la disociación de eEF2 de sarcin
 5; 14; 23
el ribosome y la rotación inversa de SSU . Como se indicó anteriormente, la

sordarina puede estabilizar uno de los estados intermedios de eEF2 antes y después de la

hidrólisis de GTP sin interferir con su hidrólisis 9. Estos hallazgos respaldan nuestra

interpretación del "AlF4-

/sordarin complex” structure, which most likely reflects post-hydrolysis events of

translocation.

ACCEPTED MANUSCRIPT
Papel estructural de la difthamida en la translocación ribosomal en eucariotas

Nuestras reconstrucciones proporcionan evidencia estructural de cómo la difthamida podría

ser responsable de la regulación del cambio molecular entre los principales nucleótidos de la

DC, desempeñando así un papel activo en el control del movimiento del ARNm en el

ribosoma. Además,nuestras econstrucciones revelan que la proteína conservada uS12, que

14
también pertenece a la DC y se une al dominio III de eEF2 , entra en contacto con la

columna vertebral de A1755 y A1756 (Supplement Fig. 7a-c), probablemente estabilizando

16.
su conformación, de forma similar a la de las bacterias .

Elconocimiento de la implicación estructural de la difthamida en la translocación del

ARNm es muy limitado, y las reconstrucciones, obtenidas en el mismo rango de resolución

que la nuestra, sólo están disponibles para 80S/eEF2/viral-IRESs, ya sea en presencia de

18
GMPPCP o GDP+sordarin 14. En la estructura de la levadura 80S/eEF2/GMPPCP/CrPV

IRES (código PDB: 5it7)

18
la difthamida está interactuando con la mitad de PKI similar al codón-anticodon de una manera que

evita que los residuos de decodificación adhicionen al IRES. Esto es una reminiscencia de lo

que observamos en el "complejo GMPPCP", donde el A1755/56 conservado de la CC se

colocan dentro de la ranura menor de h44. Sin embargo, en la estructura totalmente rotada de
14
80S/eEF2/GDP/sordarina/TSV IRES complejo (código PDB: 5juu )diphthamida está

apuntando a la hélice codon-anticodon-like de PKI, ocupando la posición híbrida ap/P, e

interactúa con el residuo de decodificación A1756, de manera similar a lo que observamos en

el caso del "complejo AlF4-/sordarin". Por lo tanto, podemos deducir que la posición de la

difthamida que observamose en presencia de GDP+AlF4- puede ser

como estado post-hidrolítico. Por último, la difthamida en el complejo

"GMPPCP/sordarin"adopta una conformación muy inusual, ya que su posición no se

14; 18
observa en ninguna de las estructuras de 80S/eEF2/IRESs .

Conclusions

En el presente estudio, proporcionamos nuevas evidencias estructurales del papel de la

ACCEPTED MANUSCRIPT
difthamida en la translocación ribosomal en presencia de ARNm y ARNm (Fig. 3 y 4).

Sugerimos que esta modificación post-traduccional altamente conservada de eEF2 mejore el

fidelity de la traducción al asegurar el marco de lectura correcto del ARNm a través de la

interacción directa con él y con el ARN en el DC (Fig. 2, 3 y Suplemento Fig. 4). Estas

interacciones podrían ser necesarias para evitar una posible rotación hacia atrás de la SSU y/o

el deslizamiento del ARNm, siich puede dar lugar a cambios en el marco del ARNm y dar
24
lugar a errores en la biosíntesis de la cadena de polipéptidos (Fig. 4) . La red de interacción

establecida entre la difthamida y la DC parece depender de la posición del dominio IV de

eEF2 que a su vez dependedel estado denucleótidos y otros ligandos como la sordarina. La

aparición de la difthamida en el curso de la evolución podría haber sido dictada por el nivel
20
de regulación más complejo del ribosoma eucariota en comparación con las bacterias , que

requerían herramientas moleculares adicionales para garantizar la precisión de la

24
translocación, con el fin de evitar el cambio espontáneo de marco . Aunque los

conocimientos adquiridos sobre el papel estructural de la difthamida apuntan hacia su

implicación directa en el mantenimiento del marco de lectura, todavía require investigaciones

estructurales y funcionales exhaustivas de otros intermedios para entender por completo el

mecanismo de translocación y el alcance total del papel desempeñado por la difthamida en

este proceso.
Materiales y métodos

Purificación ribosoma y eEF2.

The 80S ribosome were purified accordingly to the previous protocol 21 with minor changes.

One of the modifications of the published protocol was the addition of spermidine (2.5 mM)

to sucrose density gradients at the moment of gradients formation. To overcome the problem

of having stress protein factor Stm1 21, which binds to major actives sites of the 80S ribosome

ACCEPTED MANUSCRIPT
upon stress condition employed during ribosomes purification, we generated a new strain

lacking the gene encoding for Stm1. S. cerevisiae strain JD1370-ΔStm1 was obtained from

strain JD1370 (MATa, ura3, leu2, pep4::HIS3, nuc1::LEU2, stm1::TRP1, L_A 21) by

replacing stm1 gene with a TRP1 marker. The TRP1 marker was PCR generated using

pBS2438 plasmid as a template, and

TTTAGAGGTGAAGTAGAAATAAACCAAGAAAGCATACACATTTTATTCTCAtccatg

gaaaagagaag y

GTAGAACACTGTTATTGGATTCTTTCAGTTGGAATTCATATAATATATAAGGCtacg

actc

actataggg como imprimaciones (los segmentos capitalizados son complementarios al

locus del gen stm1). El procedimiento de aislamiento de eEF2 nativo se basó

7
principalmente en el protocolo descrito anteriormente , donde se cambiaron varios

pasos. En primer lugar, utilizamos el cultivo fresco de la cepa de levadura JD1370-

Stm1 crecido a un A600 de 2-3 y las células fueron lesidas en un microfluidizador. En

segundo lugar, en lugar de las columnas S-Sepharose, source-Q y uno-Q ion-exchange

utilizamos columnas SP-Sepharose, Q- sepharose y mono-Q e introducimosed una filtración

de gel con Superdex 200 como paso final de purificación.

El "complejo GMPPCP" se formó en el buffer G (10 mM Hepes-KOH, 5 mM

Mg(OAc)2,40 mM KOAc,10 mM NH4Cl, pH 7.5). La mezcla eEF2/GMPPCP se incuba

durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadirse a la mezcla de ribosomas 80S

(5 mg/ml, 1.125 m)con ARNm y tRNA añadidos a 3 y 5 veces los excesos molares,

respectivamente, en dos en dos

consecutive steps of 15 min each at 30°C. The mRNA sequence used was

(CAA)5UUUUUUUUU, while the tRNA we employ was yeast tRNAPhe. The factor mix was

then incubated with the ribosomes, mRNA and tRNA for 30 min at 30°C. The eEF2 factor

was used at 3-fold excess over the ribosomes and concentrations of GMPPCP was 0.25 mM.

Following the last incubation step the mixture was sized on Superdex 200 column

equilibrated in buffer G 21. The ribosome complex was collected from the void volume,

ACCEPTED MANUSCRIPT
concentrated to 70 nM and used for preparation of the cryo-EM grids.

Los complejos "AlF4-/sordarin"y"GMPPCP/sordarin"” se prepararon de la manera similar,

excepto que en este último, 0,1mM de sordarina se preincuentaba con la mezcla

eEF2/GMPPCP a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la adición a la mezcla

ribosoma. En el caso del "complejo AlF4-/sordarin", el PIB se añadió a la mezcla de eEF2 en

lugar de GMPPCP a una concentración final de 0,2 mM con sordarina mantenida en 0,1

mM. Para crear elgrupo AlF4-- , Se añadieron AlCl3 y NaF a concentraciones finales de 0,2

mM y 5 mM, respectivamente, a la mezcla de eEF2/GDP/sordarin.sordarin Ambos

complexes fueron dimensionados en Superdex 200 y concentrados a 70 nM como se

describió anteriormente.

Parámetros de preparación y recopilación de datos de cuadrículas.

Las rejillas se prepararon aplicando 4 sl de cada complejo a 70 nM a 400 rejillas de carbono

holey de malla Quantifoil 2/2 (Quantifoil Micro Tools). Las rejillas se borraron durante 1,5 s

a 4oC, 100% de humedad, utilizando un tiempo de espera de 30 s, y la fuerza de la mancha

4(Vitrobot Mark IV). Las adquisiciones de datos se realizaron en un instrumento Titan Krios

S-FEG (FEI) operado a 300 kV de voltajede aceleración y una t un subfondo nominal de

3012 a 20 12 4,5 m utilizando el detector de electrones directos CMOS (Falcon II) de

segunda generación y la recopilación automatizada de datos con el software EPU (FEI). La

cámara Falcon II fue calibrada con un aumento nominal de 59.000 x. El aumento calibrado en
la cámara de píxeles de 14 m camera
es de 127.272 x, lo que resulta en un tamaño de píxel de 1,1o a nivel de la muestra. La

cámara fue configurada para recoger 8 fotogramas y los fotogramas 2 a 8 fueron alineados.

La exposición total fue de 1,5 s, con una dosis de 60 e-/o2. (o 3,5 e -/-22 por fotograma).

Image processing.

ESCIPIÓN 25; 26; Seutilizó2 7 paquetes para el procesamiento de imágenes y la reconstrucción

ACCEPTED MANUSCRIPT
3D. El algoritmo de flujo óptico integrado en Xmipp3 28
se utilizó para la alineación de

películas de imágenes de 1196 del complejo GMPPCP, imágenes de 2030 de las imágenes

"AlF4-/sordarin"y 3184 imágenes para el complejo GMPP/sordarin.sordarin CTFFIND4 29

se utilizó para la estimación de la función de transferencia de contraste de una imagen media

de toda la pila. El movimiento de la imagen de fotograma para los tres datasets de imagen se
27).
corrigió mediante Flujo óptico (OF, En el caso delconjunto de datos "AlF4-/sordarin
27
complex", además de OF ,corregimos todo el movimiento de la imagen del marco
30
utilizando Motion_Corr antes de la selección/extracción de partículas y la clasificación 3D,

sin ninguna mejora significativa en la resolución y el nivel de interpretación eEF2. Las

31
partículas fueron seleccionadas en SCIPION . Se seleccionaron aproximadamente 150.000

partículas para el "complejo GMPPCP", 156.000 partículas para el "complejo AlF4-/sordarin"

11
y 320.000 partículas para el "complejo GMCP/sordarina". RELION se utilizó para

laclasificación parcial a través de laclasificación 3D a través de SCIPION, (consulte la Fig. 1

del suplemento para los detalles de clasificación de partículas para los tres complejos). Las

clases seleccionadas se perfeccionaron utilizando la autofirina 3D de RELION y las clases

finales refinadas se postprocesaron utilizando el procedimiento implementado en RELION

aplicado a los mapas finales para el enmascaramiento apropiado, Afilado del factor B, y
11
validación de la resolución para evitar el sobreacondicionamiento , lo que indica una

resolución media de 4,0o para el "complejo GMPPCP", 3,9o para el "AlF4-/sordarin

complex" y 4,4o para el "complejo GMPPCP/sordarin" (Prueba de suplemento 1 y Tabla de

suplementos 1). Después creamos dos máscaras diferentes; primera máscara centrada en la

SSU (incluyendo el TRNA, el ARNm y

eEF2) and a second mask focused on the LSU with the most stable regions of the SSU at the

intersubunit side (including h44 and the P-site, tRNA, mRNA and eEF2). These masks were

used for 3D auto-refine jobs in RELION 11. The resulting reconstructions were then post-

processed for automatic B-factor sharpening. The FSC curves corresponding to all the

reconstructions performed in this work are shown in Supplement Fig. 1. The best resolutions

obtained for the LSU-focused maps are 3.8Å, 3.7Å and 4.3Å for the “GMPPCP”, “AlF4-

ACCEPTED MANUSCRIPT
/sordarin" y "GMPPCP /sordarin" complejos respectivamente.

Segmentación y visualización de mapas de densidad.

Los mapas crio-EM fueron segmentados por UCSF Chimera 32 utilizando el módulo
33
SEGGER . Todos los segmentos contados menos de 1.000 vóxeles fueron descartados.

Medición de resolución localo el mapa crio-EM.

RESMAP 34 se utilizó para estimar la resolución local de la reconstrucción crio-EM. La

32
resolución se representó como una escala de color variable utilizando UCSF Quimera .

Creación y validación de modelos.

La estructura cristalina de levadura 80S (PDB: 4V88), la estructura de eEF2 en estado

similar a GTP ligada al ribosoma (PDB: 2P8W) y la estructura cristalina de tRNAPhe (PDB:

1EHZ) fueron inicialmente acoplados como cuerpos rígidos en los mapas crio-EM usando
32 35
Quimera . Se realizaron ciclos iterativos de construcción manual utilizando Coot y

36
refinamiento (global y local) por phenix.real_space_refine de las coordenadas atómicas

para mejorar la calidad del modelo y el ajuste

en la densidad de electrones. La geometría del ARN se fijó localmente using Erraser 37,
38
desde la suite Rosetta. Las estructuras fueron finalmente validadas usando Molprobity y
la correlación
coeficientes se calcularon utilizando phenix.map_model_cc 36. Todas las figuras del

manuscrito fueron preparadas usando Pymol (The PyMOL Molecular Graphics System,

Versión

1.7 Schrodinger, LLC.).

Accession numbers

ACCEPTED MANUSCRIPT
Los mapas crio-EM y las coordenadas atómicas se han depositado en el BANCO DE

DATOS EMDB y Protein Data Bank bajo códigos de adhesión ..., ..., ... Y......... para

"GMPCPC complex", "AlF4-

/complejo de sordarina" y "COMPLEJO GMPPCP/sordarin" respectivamente.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Agencia Nacional de Investigación francesa ANR-15-CE11-

0021-01 (a G.Y.),"Fondation ARC pour la recherche sur le cancer" (a G.Y), La Fondation

pour la Recherche Médicale DBF20160635745, Francia (a S.P. y G.Y.), European Research

Council avanzó 294312 (a M.Y.), el Programa del Gobierno ruso de Crecimiento

Competitivo de la Universidad Federal de Kazán (a M.Y.). Un agradecimiento especial al Dr.

Carlos Oscar Sorzano y al Dr. Pablo Conesa por el apoyo y uso de los recursos de Instruct,

unproyectoESFRI de marca de tierra. También queremos dar las gracias al Centro de

Informática de Alto Rendimiento de la Universidad de Estrasburgo (financiado por el

proyecto Equipex Equip@Meso) por el apoyo de TI. Este trabajo fue apoyado por la

subvención ANR-14-ACHN-0024 @RAction programa ''ANR CryoEM80S'' y se beneficia

de la financiación del estado administrado por la Agencia Nacional de Investigación de

Francia como parte del programa Investments for the Future (a Y.H.).
Notas

1
A quién debe dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: marat@igbmc.fr o
gula@igbmc.fr o yaser.hashem@u-bordeaux.fr

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ACCEPTED MANUSCRIPT
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Figures y leyendas de figuras

Fig. 1. Reconstruction maps allowed to interpret features at high resolution. (a) Top view of

the “GMPPCP complex” taken from the GTPase reaction center with eEF2, P/E tRNA and

mRNA indicated. (b) View of the small ribosomal subunit from the 18S rRNA intersubunit

interface. eEF2, mRNA and tRNA are shown. In the zoomed-in square details of rRNA, α-

ACCEPTED MANUSCRIPT
helices and β-strands (shown in cartoon for proteins) are shown. (c) View of the large

ribosomal subunit from the 25S rRNA intersubunit interface, with details of the structure

fitted (shown as cartoon for proteins) into the density map. CP: central protuberance. (d,e,f)

Zoom-in of rRNA, β-strands and α-helices of the “AlF4-/sordarin complex” fitted into

density. The overall quality of the map displays high resolution features, as single nucleotide

bases (rRNA) and side-chains (proteins). Residues are shown as sticks for a better

representation.

2. Análisis estructural de los tres complejos que representan un estado intermedio

detranslocación catalizada eE F2. (a) Vista superior de Saccharomyces cerevisiae 80S

ribosoma en complejo con eEF2 (rojo), P/E sitio tRNA (verde) y ARNm (magenta).

(b,d,j)Vistas de primer plano de la región de decodificación para los tres complejos

analizados en este estudio. Lamodificación de la amida difth de eEF2 en el "complejo

GMPPCP" interactúa con el ARNm en la posición +4 ("inward" conformación) (b), mientras

que en presencia de la droga sordarina,señala lejos de la CC ("hacia fuera") (j). Para el

complejo estatal de transición (GDP+AlF4-),diphthamide estáadoptando una conformación

alternativa y apunta de nuevo hacia h44 en la SSU (f). Paraesta representación se ha

utilizado el mapa centrado en la SSU "AlF4-/complejo desordarina", ya que permitió una

mejor interpretación de la densidad correspondiente a eEF2 y diphthamida. tRNA y parte del

dominio IV de eEF2 también se muestran en densidad para todos los complejos. En j), el
ARNm fue
represented in ribbons to highlight the relatively modest interpretability of the mRNA density

compared to the other two complexes, probably as a consequence of the weak interaction

with the diphthamide because of its very different conformation. (c,g,k) A section through the

elongation factor 2 (eEF2) fitted into its density maps. The three analyzed complexes in this

study are colored consistently but with different tones in order to differentiate them from

each other. tRNAs and mRNAs are shown as fitted into density. (d,e) Zoom on the sordarin

ACCEPTED MANUSCRIPT
and the nucleotide-binding pockets respectively for the “GMPPCP complex”. (h,i) Same as

(d,e) but for the “AlF4-/sordarin complex”. (l,m) Same as (d,e) but for the “GMPPCP/sordarin

complex”. Diphthamide: DPH.

3. Interacciones de difthamida dentro de los complejos 80S translocantes reportados en

diferentes estados hidrolíticos GTP. (a,c,e)Seccionestransversales T de los mapas crio-EM de

los complejos ribosomales"GMPPCP" (a), "AlF4-/sordarin"(c) y "GMPPCP/sordarin"(e).

(b,d,f) Modeloatómico del DC de los diferentes complejos de translocación notificados,

destacando la red de interacción de la difuamida.thamide. En el "complejo GMPPCP" (b), la

difthamida interactúa con la mitad del azúcar del ARNm en la posición +4, mientras que los

residuos conservados de la CC (A1755 y A1756) se voltean en la ranura menor de h44. La

presencia de sordarina induce a la diphthamide a adoptar la conformación "hacia adentro"

("complejo GMPPCP/sordarin", (f)). Esto a su vez induce a A1756 a flip-out como para

interactuar con el ARNm, de manera similar a lo observado para bacteria

70S/mRNA/2tRNAs (Jenner et al., 2010). Cuando el GTP está hidrolizado, peroaún no se ha

liberado el fosfato, la punta del dominio eEF2 IV y los residuos de CC se reorganizan en una

conformación intermedia (d). En este caso la difthamida interactúa con la columna vertebral

del azúcar de A1755/56 y se enfrenta al ARNm en la posición +4. Tél mRNA (tonos de

magenta), tRNA (tonos de verde), el bucle que contiene difthamida de eEF2 (tonos de rojo),

la decodificación de los nucleótidos SSU rRNA (tonos de amarillo) y la punta de H69

(tonos de cian). Difitema: DPH.

Fig. 4. Proposed mechanism of action of diphthamide during ribosomal translocation in

eukaryotes. Ribosomal translocation involves the concerted movement of mRNA and tRNA

along the ribosome. The SSU plays a major role in this mechanism through overall rotation

(ratcheting) and movement of the head domain (swivelling). eEF2 is the main actor in

ACCEPTED MANUSCRIPT
catalysis of these steps. Our data suggest that eEF2 is not only doing so. We observe that a

complex network of interactions involving the mRNA, the DC residues and the diphthamide,

depending on the hydrolytic state and the presence or absence of the inhibitor sordarin, is

formed upon eEF2 binding (Fig. 3). The “GMPPCP” and “AlF4-/sordarin” complexes are

para comprender, en más detalles, el papel estructural de la modificación única

difthamida (I.). Incluso en presencia de eEF2, el dominio principal de la SSU es una entidad flexible

que pueden sufrir fluctuaciones espontáneas, que a su vez podrían conduciral deslizamiento

del ARNm (eEF2 se representa en la sombra para mayor claridad) (a). La estructura que

obtenemos revela que eEF2 podría impedir que el dominio de la cabeza gire hacia atrás

mediante la unión directa al ARNm a través de la difthamida, y más específicamente en el

residuo en +4 position (b). A su vez, esta interacción podría mantener el marco de lectura

correcto del ARNm y permitir la carga del -tRNA aminoaciladocorrecto una vez que

latranslocación haya terminado (c). Sin embargo, cuando no se expresa la difitema o la punta

del dominio IV no está adecuadamenteplegada (II.), se ha demostrado bioquímicamente que

-1 eventos de cambio de marco ocurren con mayor frecuencia 6. Por lo tanto, muy

probablemente, el deficiente eEF2 no es capaz de prevenir la rotación posterior de la cabeza

de la SSU (d), lo que a su vez podría causar mRNA cambio de trama unacarga d el-tRNA

aminoaciladonocorrecto o introducir codones de parada prematura(e,f).

Gráficos
abstractos
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4