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Investigación microbiológica 166 (2011) 99—110

www.elsevier.de/micres

Filogenia y diversidad microbiana: subunidad pequeña

análisis de secuencias de ARN ribosomal y más allá
J. Rajendhran, P. Gunasekaran

Departamento de Genética, Centro de Excelencia en Ciencias Genómicas, Facultad de Ciencias Biológicas, Madurai Kamaraj
Universidad, Madurai 625 021, India

Recibido el 10 de septiembre de 2009; recibido en forma revisada el 9 de febrero de 2010; aceptado el 13 de febrero de 2010

PALABRAS CLAVE Resumen

ARNr 16S;
El análisis de la secuencia del gen del ARN ribosómico de subunidades pequeñas (ARNr 16S) se utiliza para la
Filogenia;
identificación y clasificación de procariotas. Además, la secuenciación de 16S rRNA
Diversidad;
Los genes amplificados directamente del medio ambiente se utilizan para estimar microbios.
metagenómica;
diversidad. La presencia de mosaicismo, la heterogeneidad intragenómica y la ausencia de un
Secuencia multilocus
límite de valor de identidad de secuencia de umbral universal filogenético basado en rRNA 16S
análisis
análisis. El sesgo de amplificación por PCR y el sesgo de clonación también pueden dar como resultado un resultado inexacto.
representación de la diversidad microbiana. En esta revisión, recientemente informada
complejidades de los análisis de secuencias del gen 16S rRNA y el requisito de
Se discuten herramientas para filogenia microbiana y análisis de diversidad.
y 2010 Elsevier GmbH. Reservados todos los derechos.

Contenido

1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
2. Análisis de filogenia microbiana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
2.1. Mosaicismo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
2.2. Heterogeneidad intragenómica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
2.3. Análisis del operón de ARNr. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
2.4. Análisis de secuencias multilocus (MLSA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
2.5. Comparación del genoma completo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
3. Análisis de diversidad microbiana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.1. Estimación de la diversidad bacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.2. Sesgo de amplificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.3. Sesgo de clonación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

Autor correspondiente. Tel.: þ91 452 2458478; fax: þ91 452 245 9873.
Dirección de correo electrónico: gunagenomics@gmail.com (P. Gunasekaran).

0944-5013/$ - ver portada y 2010 Elsevier GmbH. Reservados todos los derechos.
doi:10.1016/j.micres.2010.02.003
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100
3.4. Sesgo de cuantificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
4. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Agradecimientos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
1. Introducción
Los animales y las plantas poseen diferencias morfológicas
complejas que pueden utilizarse para su filogenia.
y taxonomía. Del mismo modo, las características morfológicas,
como cápsulas, flagelos, tamaño y forma de las células, y
propiedades bioquímicas se han utilizado para la
identificación y clasificación de especies bacterianas. Sin
embargo, entendimientos recientes sobre la
eventos de transferencia horizontal de genes entre bacterias
han revelado que estas características no son
muy útil para su clasificación filogenética.
Por lo tanto, los análisis de secuencias de ADN de evolutivamente
Los genes marcadores estables se consideran un potencial
estrategia para estudiar la filogenia y la diversidad bacteriana
(Tringe y Hugenholtz, 2008).
En bacterias, los genes de ARNr se transcriben de
el operón ribosomal como precursor de rRNA 30S
moléculas y luego escindido por RNase III en 16S,
Moléculas de ARNr 23S y 5S. El operón ribosómico
tamaño, secuencias de nucleótidos y estructuras secundarias de
los tres genes de ARNr se conservan dentro de
una especie bacteriana (Maidak et al., 1997). Desde 16S
El rRNA es el más conservado de estos tres rRNA,
ha sido propuesto como un ''reloj evolutivo'',
que ha llevado a la reconstrucción del árbol de
vida (Woese, 1987). Durante las últimas dos décadas,
los microbiólogos se han basado principalmente en el ARNr 16S
secuencias de genes (en adelante, secuencias 16S) para la
Identificación y clasificación de bacterias. los
El análisis de secuencias 16S se utiliza en dos importantes
aplicaciones: (i) identificación y clasificación de
cultivos puros aislados y (ii) estimación de
diversidad bacteriana en muestras ambientales sin cultivo a
través de enfoques metagenómicos. En
este manuscrito, discutimos las limitaciones de 16S
secuencias en ambas aplicaciones y enfatizar la
necesidad de estrategias alternativas o complementarias.
2. Análisis de filogenia microbiana
Se identifican nuevos aislados bacterianos basados en la
Análisis de homología de secuencia 16S con
secuencias en las bases de datos. Informe de los investigadores
la identificación de la especie basada en la más cercana
coincidencia obtenida de herramientas comparativas como
BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y Seq Match (http://
rdp.cme.msu.edu). Sin embargo, hay
J. Rajendhran, P. Gunasekaran
no hay un "valor umbral" definido por encima del cual
acuerdo universal para la identificación de especies puede
Ser obtenido. En muchos casos, la diferencia entre la coincidencia
más cercana y la siguiente más cercana a la
cepa desconocida es 0,5%. Por ejemplo, el género
Bacillus es un grupo grande y heterogéneo de Gram--
bacterias positivas con amplia diversidad fenotípica.
Las cepas tipo de B. globisporus y B. psychro philus comparten
una identidad de secuencia del 99,8% con respecto a
sus genes 16S. Sin embargo, a nivel del genoma,
exhiben solo 23-50% de relación en reciprocidad
reacciones de hibridación (Fox et al., 1992). En estos
circunstancias, diferencias tan pequeñas no pueden justificar la
selección de la coincidencia más cercana como resultado definitivo.
identificación. En otros casos, diferentes especies de
bacterias con fisiologías considerablemente diferentes
se informó que contenían genes 16S casi idénticos
(Palys et al., 1997). Por ejemplo, el 16S
secuencias de ciertas especies de Rhizobium tales como
Se encontró que R. gallegae era más similar a
Secuencias de Agrobacterium que otras Rhizobium
especies. Con base en estas observaciones, se ha
propuso que el género Rhizobium puede corregirse como una
especie dentro del género Agrobacterium
(Young et al., 2001). Sin embargo, esta propuesta no fue
aceptado debido a las características ecológicas y genómicas
diferencias que existen entre estos dos géneros
(Farrand et al., 2003). In such circumstances,
identificación de especies basada únicamente en el 16S
secuencias pueden dar lugar a identificaciones erróneas.
2.1. Mosaicismo
La presencia de mosaicismo en los genes 16S es
otro tema relacionado con la clasificación filogenética. Eso
En general, se asumió que era poco probable que los genes 16S
tienen eventos de transferencia horizontal. Sin embargo, reciente
Los estudios sugirieron que algunas especies bacterianas podrían
tienen un historial de transferencia horizontal y recombinación
dentro del gen 16S. Transferencias horizontales de 16S
segmentos de genes y la presencia de mosaicos
Se han reportado estructuras en Rhizobium,
Aeromonas, Bradyrhizobium, Streptococcus y actinomicetos
(Eardly et al., 1996; Schouls et al., 2003).
Por lo tanto, la identificación de especies utilizando el gen 16S
sondas o análisis de homología de secuencias 16S parciales
puede dar lugar a una identificación errónea, ya que puede
representar sólo una parte de la estructura en forma de mosaico. Más
Curiosamente, hay informes sobre experimentos
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SSU rRNA y diversidad microbiana
transferencia de operones de ARNr completos, tanto dentro
como entre especies. Asai et al. (1999) eliminaron los siete
operones de ARNr cromosómicos de Escherichia coli e
introdujeron plásmidos que portaban los operones de ARNr
de Salmonella enterica o Proteus vulgaris. Las cepas de E.
coli resultantes con genes 16S heterólogos eran viables. Se
observó muy poca diferencia en la tasa de crecimiento o en
la relación ARNr/proteína entre las cepas de E. coli que
portan los genes 16S de tipo salvaje y S. enterica. También
se informó que la eficiencia de traducción y la fidelidad de los
ribosomas híbridos son similares a las de los ribosomas de
E. coli.
De manera similar, el ARNr de P. vulgaris podría funcionar
de manera eficaz con los componentes de traducción de E.
coli, aunque se observó una tasa de crecimiento ligeramente
más baja que sugiere una eficiencia de ribosoma algo más
baja. Por el contrario, un operón de ARNr de Pseudomonas
aeruginosa, que tiene una relación más lejana con E. coli que
con P. vulgaris, no logró reemplazar al operón de E. coli.
Estos resultados indicaron que se permiten variaciones en la
secuencia 16S hasta cierto punto sin afectar la aptitud de las bacterias.
2.2. Heterogeneidad intragenómica
La presencia de múltiples copias del operón rRNA y la
heterogeneidad intragenómica de los genes 16S se considera
otro factor limitante para el uso de este gen para la
identificación de especies. El número de copias de operones
de ARNr por genoma bacteriano varía de 1 a 15 (Klappenbach
et al., 2000). Las secuencias de genes de ARNr multicopia
son en su mayoría idénticas o casi idénticas. Sin embargo,
varios informes recientes han sugerido la existencia de
secuencias 16S divergentes dentro de un solo organismo.
La variabilidad intragenómica informada de 16S fue tan alta
como 6,4% en el caso del genoma de Thermobispora bispora
(Wang et al., 1997). Por lo tanto, la heterogeneidad de la
secuencia dentro de un genoma limita la resolución
filogenética de una especie particular basada en las
secuencias 16S. La complejidad con respecto a la
heterogeneidad 16S puede evitarse mediante el análisis de
un gen que existe en una sola copia. Por lo tanto, se han
sugerido varios otros genes de copia única, que se conservan
entre las bacterias, y cualquiera de ellos puede considerarse
como una alternativa a la filogenia basada en 16S. El gen de
la chaperonina GroEL, la subunidad beta de la ARN
polimerasa (rpoB), la subunidad beta de la girasa del ADN
(gyrB) y la proteína de choque térmico (dnaK) son los otros
genes marcadores estables universales que se utilizan
habitualmente (Viale et al., 1994; Case et al. , 2007; Eardly
et al., 2005; Watanabe et al., 2001). Estos genes se proponen
como herramientas complementarias para que el gen 16S
defina las relaciones evolutivas entre las especies de
eubacterias (Viale et al., 1994). En ciertos grupos de
101
organismos, se encontró que uno de estos genes marcadores
alternativos era más adecuado para el análisis filogenético.
Por ejemplo, Claesson et al. (2008) compararon la
filogenómica de Lactobacillus con la filogenia de un solo gen.
En este estudio, 12 genomas de cepas de Lactobacillus se
sometieron a enfoques filogenéticos basados en el genoma
completo y en un solo gen y se concluyó que GroEL es un
marcador filogenético de un solo gen más sólido para el
género Lactobacillus que el gen 16S.
2.3. análisis de operón de ARNr
Además del análisis de secuencias, el análisis de huellas
dactilares de ADN basado en genes 16S, como la
desnaturalización o la electroforesis en gel con gradiente de
temperatura (DGGE, TGGE), el polimorfismo de conformación
monocatenario (SSCP), el análisis de restricción de ADN
ribosomal amplificado (ARDRA) y el fragmento de restricción
terminal El análisis de polimorfismos (T-RFLP) se usa
ampliamente para diferenciar microorganismos (Bouchet et
al., 2008). Todos estos métodos se basan en la variación de
secuencias en los genes 16S (Tabla 1).
Las regiones espaciadoras transcritas internamente (ITS)
16S–23S del operón de ARNr pueden estar bajo una presión
selectiva mínima durante la evolución y, por lo tanto, tienen
más variación en las secuencias que las regiones codificantes
de los ARNr 16S y 23S. El tamaño del ITS varía
considerablemente para diferentes especies, e incluso entre
diferentes operones dentro de una sola célula que tiene
múltiples operones de ARNr. La variación en la longitud de
una región ITS amplificada se debe principalmente a la
presencia de diversos números y tipos de genes de ARNt.
Por ejemplo, hay dos tipos de ITS en E. coli. Entre los siete
operones de ARNr, cuatro de ellos contienen un solo gen
tRNAGlu y otros tres tienen dos genes de ARNt (tRNAIle y
tRNAAla) en la región ITS. Por lo tanto, los polimorfismos de
longitud y secuencia en el ITS se pueden usar para distinguir
diferentes especies de procariotas (Janssen et al., 2002). El
polimorfismo entre la longitud del propio producto amplificado
por PCR se puede utilizar para el reconocimiento de géneros
y especies. Se puede acceder a información adicional sobre
el producto amplificado mediante su patrón RFLP. Si el
producto de PCR contiene secuencias de reconocimiento de
endonucleasas de restricción en ubicaciones únicas, entonces
el patrón de tamaño de fragmento resultante puede ser
indicativo de una especie en particular. Finalmente, las
regiones ITS amplificadas se pueden secuenciar y utilizar
para la identificación y subtipificación de especies. De manera
similar, para mejorar la capacidad de diferenciación del
análisis del gen 16S, se ha informado de una larga PCR-
RFLP. Esta técnica se basa en la amplificación por PCR de la
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102 J. Rajendhran, P. Gunasekaran

Tabla 1. Métodos de tipificación microbiana basados en secuencias de ARNr.

Método Principio Referencia

ribotipado
Análisis de restricción de ADN
ribosomal amplificado
(ARDRA)
Polimorfismo de longitud
de fragmento de
restricción terminal (T-RFLP)
La escritura del espaciador
transcrito internamente (ITS)
16S-23S
Análisis automatizado de
espaciadores intergénicos ribosómicos
(ARISA)
PCR-RFLP largo
Polimorfismo en la hibridación con sondas basadas en el gen Grimont y Grimont (1986)
16S en ADN genómico total digerido con enzimas de restricción.
La ribotipificación representa la posición de los operones de ARN en
todo el genoma. Sin embargo, se basa en las variaciones asociadas
con la restricción.
sitios
solamente Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Gurtler et al. (1991)
(RFLP) de los genes 16S amplificados o clonados. Es más rápido y
representa únicamente variaciones asociadas con sitios de
restricción. Polimorfismo en la longitud del fragmento de restricción
terminal marcado con fluorescencia del gen 16S. Es un método de Liu et al. (1997)
alto rendimiento útil para estudios metagenómicos y la variación se
basa únicamente en el tamaño del fragmento de restricción terminal.
Polimorfismo en la longitud, patrón RFLP o secuencias de la región
ITS. Muestra una mayor variación que la secuencia del gen 16S y,
por lo tanto, es útil para la tipificación de organismos estrechamente Jensen et al. (1993)
relacionados. Polimorfismo en la longitud de las regiones ITS
marcadas con fluorescencia. Es un método de alto rendimiento útil
para estudios metagenómicos y la variación se basa en el tamaño de
los fragmentos amplificados Polimorfismo de longitud de fragmentos Fisher y Triplett (1999)
de restricción de todo el operón de ARNr. Tiene más poder de
discriminación que el análisis de la secuencia 16S solo. Sin embargo,
se basa en las variaciones asociadas con la restricción.
Smith-Vaughan et al. (1995)

solo sitios
DGGE Polimorfismo basado en la separación de 16S rDNA parcialmente Muyzer et al. (1993)
fundido en un gel de gradiente desnaturalizante lineal. Representa
también las variaciones de secuencia distintas de los sitios de
restricción. Sin embargo, cubre solo menos de 400 pb del polimorfismo
del gen 16S basado en la separación del ADNr 16S parcialmente
TGGE fundido en un gradiente de temperatura lineal. Representa también Nubel et al. (1996)
las variaciones de secuencia distintas de los sitios de restricción. Sin
embargo, cubre menos de menos de 400 pb del polimorfismo del gen
16S basado en el ADNr monocatenario 16S en gel de poliacrilamida.
Representa también las variaciones de secuencia distintas de los
SSCP sitios de restricción. Lee et al. (1996)

Sin embargo, cubre solo menos de 400 pb del gen 16S

piroetiquetas 16S
Secuenciación de ADNr 16S
Pirosecuenciación de 16S rDNA. Es un método de alto rendimiento Ronaghi y Elahi (2002)
útil para estudios metagenómicos. Sin embargo, proporciona solo
una pequeña etiqueta del gen 16S, aproximadamente 200 pb.
Secuenciación del gen 16S amplificado o clonado por PCR.
Woese (1987)
La secuencia completa del gen 16S (1500 pb) tiene más poder
discriminatorio

toda la región 16S–23S–5S del operón ribosómico (5,5 kb)
seguida de huellas dactilares de restricción (Smith-Vaughan
et al., 1995). Este método es más discriminatorio que la
secuenciación 16S ya que también cubre la variabilidad en
el ITS.
La ribotipificación es otro método ampliamente adoptado
para el análisis filogenético. La ribotipificación se basa en
la escisión de la endonucleasa de restricción del ADN
genómico total seguida de la separación electroforética, la
transferencia de Southern blot y la hibridación del ADN transferido.
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SSU rRNA y diversidad microbiana
fragmentos con una sonda de rRNA marcada. Después de la
autorradiografía, se visualizan aquellas bandas que contienen
una porción del operón ribosómico. El número de fragmentos
generados por el ribotipado es un reflejo de la multiplicidad de
operones de ARNr presentes en una especie bacteriana. El
nombre "ribotipado" se considera inapropiado, lo que lleva a la
idea errónea de que los polimorfismos observados surgen
directamente de las secuencias de genes de ARNr. Sin
embargo, la variabilidad de los ribotipos es un reflejo de los
polimorfismos no solo en los genes de ARNr, sino también del
patrón de restricción en los genes cromosómicos laterales.
Aquí, las secuencias del gen rRNA se explotan como "etiquetas
vinculadas" a las regiones adyacentes del genoma (Bouchet
et al., 2008).
2.4. Análisis de secuencia multilocus (MLSA)
Aunque se han propuesto diferentes genes marcadores
estables, el poder discriminatorio de una sola secuencia de
locus se considera de menor importancia ya que cubre solo
una región limitada del genoma. Por lo tanto, se ha propuesto
la secuenciación de varios genes conservados (análisis de
secuencia multilocus; MLSA) dentro del genoma bacteriano
para mejorar el poder discriminatorio (Gevers et al., 2005). En
MLSA, se secuencian fragmentos de aproximadamente 500
pb de longitud de generalmente siete genes marcadores y los
perfiles de secuencia combinados se utilizan para el análisis
de filogenia (Jolley y Chan, 2004). MLSA es más útil en la
identificación del nivel de cepa dentro de una especie.
Para MLSA, se considera un conjunto de genes domésticos
en función de la variabilidad de la secuencia entre las especies
particulares de bacterias. En ciertos casos, el enfoque MLSA
también usa genes altamente variables que tienen implicaciones
directas en sus características fenotípicas. Por ejemplo, el gen
de la citotoxina vacA se usa para identificar las cepas
patógenas de Helicobacter pylori (Maggi-Solca et al., 2001).
Por lo tanto, la secuencia 16S se puede utilizar para asignar
un organismo desconocido a un grupo (género o familia), lo
que dirige el conjunto de genes que se seleccionarán para
MLSA. Posteriormente, la MLSA se puede utilizar para asignar
el organismo a una especie o subespecie.
A pesar de los avances significativos en las herramientas
moleculares, la identificación de la unidad fundamental, la
especie, es cuestionable en la taxonomía bacteriana. Los
taxonomistas bacterianos aún no han llegado a un consenso
para definir la especie (Cohan, 2002). Dentro de una especie
bacteriana, los investigadores han identificado que existe una
variación considerable en los rasgos metabólicos. De manera
similar, la secuenciación de múltiples genomas dentro de una
especie ha mostrado una variación considerable en los genes
que están presentes. Por lo tanto, se ha propuesto que
103
Las especies bacterianas son taxones complejos de múltiples
poblaciones y las subpoblaciones dentro de las especies
nombradas pueden parecerse a las poblaciones de especies
adaptadas ecológicamente, llamadas ecotipos (Koeppel et al., 2008).
Se ha sugerido MLSA como el primer paso práctico hacia la
identificación de la diversidad ecotípica dentro de las especies.
Sobre la base de los ecotipos, se ha propuesto una
nomenclatura trinominal latina que da los nombres de género,
especie y ecotipo (Cohan, 2002).
2.5. Comparación del genoma completo
Se considera que la relación del ADN genómico completo
proporciona la resolución absoluta en la taxonomía bacteriana.
En general, se acepta que toda la información taxonómica
sobre una bacteria se incorpora en la secuencia de nucleótidos
completa de su genoma (Goris et al., 2007). El enfoque MLSA
representa el genoma bacteriano hasta cierto punto y tiene un
mayor poder discriminatorio que el análisis de locus único.
De manera similar, los métodos de huellas dactilares
genómicas como Rep-PCR (ERIC-, REP-, BOX-PCR), RAPD
y AFLP proporcionan más poder discriminatorio. Sin embargo,
la hibridación ADN-ADN genómico completo (DDH) se
considera el "estándar de oro" para la identificación de
especies bacterianas. Los organismos que muestran valores
de DDH superiores al 70 % y una diferencia de temperatura
de fusión (DTm) inferior al 5 % se consideran pertenecientes
a la misma especie (Wayne et al., 1987; Gevers et al., 2005).
La justificación para usar DDH como el estándar de oro para
la delineación de especies se origina a partir de los resultados
de numerosos estudios, en los que se encontró un alto grado
de correlación entre DDH y la similitud quimiotaxonómica,
serológica y fenética numérica. En general, las especies que
tienen una similitud de ADN del 70 % o más suelen tener más
del 97 % de identidad de secuencia del gen 16S, pero no al
revés.
Se han identificado varios grupos de organismos que
comparten secuencias de ARNr 16S casi idénticas pero en las
que la hibridación del ADN es significativamente inferior al
70%, lo que indica que representan especies diferentes
(Stackebrandt y Goebel, 1994). Sin embargo, aquellos
organismos que tienen menos del 97% de homología de
secuencia 16S no se reasociarán a más del 60%. Por lo tanto,
el análisis de la secuencia 16S es extremadamente útil para
decidir si es necesario realizar o no el laborioso proceso DDH.
Se reportan nuevas especies bacterianas basadas en el
enfoque polifásico, en el que DDH juega un papel dominante.
El enfoque polifásico utiliza datos fenotípicos, genotípicos y
filogenéticos de los microorganismos (Colwell, 1970;
Vandamme et al., 1996; Ghosh et al., 2007). Secuenciación
del genoma completo utilizando metodologías de segunda
generación (Shendure y Ji, 2008) y genoma-genoma
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104
la hibridación mediante micromatrices (Gresham et al.,
2006) también se puede utilizar para la identificación de
microorganismos y para la subtipificación.
Pocos estudios han evaluado la consistencia de los
rangos taxonómicos existentes de cepas bacterianas en
base a las secuencias de su genoma completo. Las
identidades de nucleótidos promedio (ANI) y las identidades
de aminoácidos promedio (AAI) se utilizaron para medir la
relación genética y evolutiva entre cepas (Konstantinidis y
Tiedje, 2005a, b). Las secuencias ANI y AAI mostraron una
mejor resolución que las secuencias 16S entre especies
estrechamente relacionadas. Se encontró que los valores
de DDH del 70%, que se utilizan para la delimitación de
especies, corresponden al 495% del AAI. Sin embargo, la
relación basada en AAI entre las cepas a menudo era
inconsistente con su relación taxonómica basada en
secuencias 16S. Konstantinidis y Tiedje (2005b) han
evaluado la correlación entre varios genes marcadores
estables y el AAI de 175 cepas bacterianas. Los valores de
R2 informados fueron los siguientes: 0,84 (16S), 0,84 (23S),
0,78 (rpoB), 0,77 (GyrB), 0,68 (RecA). Por lo tanto, en la
medida en que se considere un solo locus, el gen 16S es la
opción óptima para el análisis de filogenia microbiana. Los
métodos de comparación MLSA y del genoma completo
proporcionan más poder discriminatorio.
3. Análisis de diversidad microbiana
La estimación de la diversidad microbiana de muestras
ambientales es la segunda aplicación importante del análisis
de secuencias 16S. Desde el descubrimiento de las técnicas
de cultivo bacteriano puro por parte de Robert Koch, las
técnicas de cultivo microbiológico han mejorado
significativamente. Sin embargo, la mayoría de las especies
bacterianas en cualquier ambiente aún no son cultivables
en el laboratorio, debido a la falta de conocimiento de las
condiciones reales bajo las cuales estas bacterias crecen
en su ambiente natural. Los análisis de los genes 16S del
ADN extraído directamente del medio ambiente, el ADN
metagenómico, se están utilizando para estudiar la diversidad
de microorganismos sin cultivo (Gill et al., 2006; Gray y
Herwig, 1996; Lane et al., 1985; Rajendhran y Gunasekaran,
2008).
Durante las últimas dos décadas, se ha descrito la
diversidad filogenética de ambientes como superficies
oceánicas, respiraderos de aguas profundas, aguas termales,
suelo, rumen e intestinos animales, piel humana, cavidad
oral e intestino y se han identificado muchos linajes nuevos.
La clonación y secuenciación de genes 16S amplificados
directamente de estos entornos a través de enfoques
metanómicos demostraron que la diversidad microbiana es
mucho más extensa que nunca.
J. Rajendhran, P. Gunasekaran
imaginado a partir de estudios basados en la cultura
(Handelsman, 2004). Las comparaciones entre los métodos
clásicos dependientes de cultivo y metagenómicos han
revelado que solo alrededor del 1% del total de
microorganismos son susceptibles de cultivo. En algunos
casos, la comprensión de la diversidad filogenética ha
llevado al desarrollo de mejores métodos de cultivo (Janssen
et al., 2002). Sin embargo, estimar la diversidad microbiana
total en cualquier ambiente es un desafío persistente. A
pesar de los muchos miles de secuencias 16S que se están
acumulando en las bases de datos a través de enfoques
metagenómicos y basados en cultivos, ni siquiera es
predecible cuántas especies procarióticas hay en el mundo
(López-García y Moreira, 2008).
3.1. Estimación de la diversidad bacteriana
La diversidad microbiana se considera como una función
del número de clases diferentes (riqueza) y la distribución
relativa de elementos individuales entre estas clases
(uniformidad) (Nubel et al., 1999). La evaluación de la
diversidad generalmente se basa en (i) la amplificación por
PCR de los genes 16S del ADN metagenómico; (ii) hacer
bibliotecas de genes 16S; (iii) secuenciación de clones
seleccionados al azar; y (iv) análisis filogenético. La riqueza
y la uniformidad de una comunidad se estiman
cualitativamente en función del número de clones únicos y
sus frecuencias relativas (Rani et al., 2008). Sin embargo, la
validez del análisis de la diversidad microbiana basado en la
metagenómica depende de la obtención de ácidos nucleicos
representativos de toda la comunidad microbiana. La calidad
y cantidad del ADN metagenómico influye en la estructura
de la comunidad microbiana (Chandler et al., 1998). La lisis
celular incompleta, la sorción del ADN en matrices inertes,
la coextracción de inhibidores enzimáticos y la degradación
del ADN en varios pasos de los procedimientos de extracción
pueden influir en el patrón de diversidad microbiana (Stach
et al., 2001). Además, se pueden introducir sesgos durante
los pasos de amplificación y clonación por PCR.
3.2. Sesgo de amplificación
La selección de cebadores para la amplificación del gen
16S en sí misma es una importante fuente de sesgo. En
varias publicaciones, los cebadores de PCR se han
mencionado como "cebadores universales del gen 16S". Los
cebadores universales, por definición, deberían ser
complementarios a todas las secuencias del gen 16S. Sin
embargo, es obvio que muchas secuencias en las bases de
datos se desvían de las regiones conservadas a las que se
dirigen los cebadores universales. Los cebadores estándar
utilizados para amplificar los genes 16S no logran capturar
las secuencias 16S obtenidas a través de rutas independientes de PCR (Sc
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SSU rRNA y diversidad microbiana
Handelsman, 2004). Para adaptarse a las desviaciones de
las secuencias conservadas, los cebadores comúnmente
utilizados se han modificado con posiciones degeneradas
para permitir que los cebadores se dirijan a una gama más
amplia de secuencias 16S (Baker y Cowan, 2004).
Sin embargo, la degeneración en posiciones seleccionadas
no es suficiente para cubrir todos los genes 16S. El aumento
del número de posiciones degeneradas puede dar lugar a
amplificaciones falsas en la PCR. Además, los cebadores
utilizados actualmente para obtener secuencias del gen 16S
se basan todos en secuencias de organismos cultivados o
de organismos no cultivados que retuvieron las regiones
conservadas de organismos cultivados. Por lo tanto, los
genes 16S amplificados pueden estar sesgados hacia las
secuencias que son similares a las especies conocidas y
los genes 16S divergentes del medio ambiente pueden no
amplificarse.
Para superar las complejidades con la selección de
cebadores universales hasta cierto punto, Isenbarger et al.
(2008) han propuesto recientemente que se pueden usar
minicebadores de 10 nt para identificar secuencias del gen
16S más divergentes de muestras ambientales.
En este estudio, se ha utilizado una polimerasa S-Tbr
diseñada por ingeniería en lugar de la ADN polimerasa Taq.
En S-Tbr, el dominio de exonucleasa 50-30 N-terminal de la
ADN polimerasa I de Thermus brockianus se elimina y se
reemplaza con una proteína de unión a ADN de doble
cadena de 7 kDa Sso7d de Sulfolobus solfataricus (Wang
et al., 2004). La S-Tbr exhibió una mayor especificidad que
la ADN polimerasa Taq y no se observó amplificación no
específica aunque se usaron los minicebadores de 10 nt.
Debido a que los minicebadores son más cortos, pueden
apuntar a genes 16S más divergentes y, por lo tanto,
amplificaron una mayor proporción de secuencias nuevas
que no coincidían con las bases de datos de genes 16S
previamente conocidos.
Otro dilema en el uso de PCR para amplificar genes 16S
de ADN ambientales es la formación de moléculas
quiméricas (Payne et al., 2005). Se están utilizando
algoritmos informáticos, como CHECK_CHIMERA de RDP,
para predecir posibles moléculas quiméricas formadas
durante la PCR. Sin embargo, cuando se utiliza ADN
comunitario complejo como molde, no se puede predecir si
la quimera se forma durante la PCR o si los organismos
poseen genes 16S similares a mosaicos. Por lo tanto, las
estructuras similares a mosaicos naturales de los genes
16S pueden identificarse erróneamente como quimeras
experimentales, lo que eventualmente afecta la estimación
general de la estructura de la comunidad.
3.3. Sesgo de clonación
Después de la amplificación por PCR, también existe la
posibilidad de un sesgo en el paso de clonación. Aunque
los genes de varios grupos de organismos con GþC atípica
105
contenido no se pudo clonar en E. coli, es el huésped
estándar utilizado para clonar los genes 16S amplificados.
Como alternativa, se pueden usar diferentes células
huésped, como Bacillus y Streptomyces, para evitar el
sesgo de clonación. Sin embargo, las transformaciones de
estas células son tediosas y menos eficientes. De manera
similar, la extracción de plásmidos de células recombinantes
para la secuenciación también es engorrosa y, por lo tanto,
hasta la fecha, no se ha publicado ningún artículo sobre el
análisis de la diversidad microbiana utilizando diferentes
células huésped para la clonación y la secuenciación.
Recientemente, se han desarrollado estrategias de
clonación sin células. La estrategia de amplificación de
desplazamiento múltiple (MDA) que utiliza la polimerasa de
ADN F29 se puede utilizar para la clonación libre de células
(Hutchison et al., 2005). De manera similar, se ha introducido
el método de polonia in vitro (amplicones de PCR derivados
de una sola molécula de ADN amplificada in situ) para
reemplazar la clonación biológica (Mitra y Church, 1999). El
método de polonia se ha aplicado en varias metodologías
de secuenciación de segunda generación como 454 (Roche,
Branford, CT, EE. UU.), Solexa (Illimina, San Diego, CA,
EE. UU.) y SOLiD (ABI, Foster City, CA, EE. UU.) (Shendure
y Ji, 2008). Entre estos, el método de pirosecuenciación
454 se introdujo por primera vez en el mercado y se usó
ampliamente junto con el método de Sanger (Rothberg y
Leamon, 2008). En el método 454, no se necesita la
construcción de bibliotecas de clones (Figura 1). Debido a
que se evitan los sesgos de amplificación y clonación y a la
generación de grandes cantidades de secuencia en una
sola ejecución, este método se considera una estrategia
eficaz para los estudios de metagenómica. Sin embargo, la
principal limitación del 454 y otras tecnologías de segunda
generación es la longitud de lectura más corta y, por lo
tanto, el ensamblaje de estas secuencias y las búsquedas
de homología son un desafío. El kit de titanio desarrollado
recientemente por Roche puede proporcionar más de 400
lecturas de base, lo que ha mejorado drásticamente la
eficiencia del ensamblaje de secuencias. Además, Pacific
Biosciences, Menlo Park, CA (Korlach et al., 2008) ha
informado sobre la posibilidad de desarrollar instrumentos
que proporcionen más de 1000 lecturas básicas de una sola
molécula. Estos desarrollos mejorarán la precisión de los
métodos existentes para construir árboles filogenéticos y
clasificar nuevos organismos en estudios metagenómicos.
De manera similar, la disponibilidad de muchos métodos
computacionales mejorados para comparar grandes
cantidades de comunidades microbianas, incluidas UniFrac
(Lozupone et al., 2006), SONS (Schloss y Handelsman,
2006) y SCARF (Barker et al., 2009) mejoró la agrupación
de nova . y ensamblaje de secuencias. Así, con la llegada
de las tecnologías de secuenciación de segunda generación,
la rápida identificación y clasificación de microorganismos
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106 J. Rajendhran, P. Gunasekaran

Figura 1. Métodos convencionales (A) y de pirosecuenciación 454 (B) para la secuenciación del metagenoma. En el método de escopeta
convencional, el ADN metagenómico se corta mediante sonicación y se clona en un vector plásmido. La biblioteca de plásmidos clonados
se transforma en E. coli. Los plásmidos recombinantes de colonias individuales se aíslan y secuencian mediante el método de Sanger.
En la tecnología de pirosecuenciación 454, se obtienen fragmentos más pequeños de ADN metagenómico mediante nebulización y se
ligan con adaptadores. Uno de los adaptadores lleva una hebra de 50 biotinilada. La mezcla de ligación se desnaturaliza y se adhiere a
perlas de sefarosa que contienen estreptavidina. El ADN y las perlas se toman en proporción, donde cada perla recibe una sola molécula
de ADN. La molécula de ADN individual se amplifica in situ mediante PCR en emulsión y las hebras amplificadas se unen a la misma
perla dentro de la emulsión. Cada microesfera se considera una colonia de PCR (polonia) que contiene alrededor de 1000 copias
derivadas de una única molécula de ADN. A continuación, las polonias se secuencian en pocillos a escala de picolitros mediante química
de pirosecuenciación.

es posible, que tiene el potencial de reemplazar los enfoques
clásicos existentes de "clon métodos
y secuencia".
de secuenciación
Los avances de
en los
segunda generación con respecto a la mejora de las
longitudes de lectura y los desarrollos en las herramientas
computacionales fortalecerán su aplicación en los análisis de
diversidad microbiana y funcional.
3.4. Sesgo de cuantificación
Se ha propuesto la PCR en tiempo real basada en el gen
16S para la cuantificación de bacterias en el medio ambiente
( Nadkarni et al., 2002). Se han diseñado cebadores y sondas
de amplio rango en función de las regiones conservadas y se
ha demostrado que cuantifican los genes 16S de la mayoría
de las especies bacterianas. Sin embargo, como se discutió
anteriormente, el sesgo de amplificación puede resultar en
una cuantificación imprecisa. Es posible que los cebadores
de amplio rango no capturen todas las secuencias 16S del
ADN metagenómico, lo que subestima la carga bacteriana
real. Además, la presencia de múltiples copias del gen 16S
en muchos organismos limita la cuantificación precisa de los
organismos. Por lo tanto, la PCR en tiempo real que usa
otros genes marcadores de una sola copia, como rpoB,
puede proporcionar datos más confiables.
Sin embargo, el sesgo de amplificación asociado con
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SSU rRNA y diversidad microbiana
La PCR no se puede superar con este enfoque ya que las
secuencias rpoB son más divergentes que las secuencias 16S.
Las sondas específicas de grupo se utilizan a menudo en el
análisis cualitativo y cuantitativo de las poblaciones microbianas
(Brunk et al., 1996). El mayor avance en el análisis de diversidad
basado en el gen 16S es la aplicación de micromatrices de alta
densidad de sondas filogenéticamente específicas denominadas
PhyloChip (Loy et al., 2005). Sin embargo, su aplicación
depende de la disponibilidad de sondas de ácido nucleico
adecuadas, lo que requiere un conocimiento previo de las
secuencias a detectar. Dado que las secuencias del gen 16S
disponibles pueden no representar la diversidad bacteriana
completa, el análisis de hibridación basado en micromatrices
puede cuantificar solo los genes 16S con secuencias conocidas.
Además, las poblaciones microbianas que no son numéricamente
dominantes no están representadas porque los ADN molde de
estas poblaciones representan una pequeña fracción del ADN
total de la comunidad. En consecuencia, se subestima la
diversidad de especies de la comunidad microbiana. Las
diferencias en el número de copias de genes entre especies
también influyen en la estimación de la abundancia aparente de
diferentes poblaciones. La presencia de múltiples operones de
ARNr con una considerable heterogeneidad de secuencia en
ciertas bacterias podría conducir a una sobreestimación de la
diversidad bacteriana.
4. Conclusiones
Los genes 16S se consideran relojes moleculares y han sido
ampliamente utilizados en estudios filogenéticos, evolutivos y
taxonómicos. La presencia de mosaicismo, la heterogeneidad
intragenómica y la falta de un valor de identidad de secuencia
de umbral universal se consideran factores limitantes para la
identificación microbiana basada en la secuencia 16S.
De manera similar, la presencia de abundantes secuencias
parciales de genes 16S en las bases de datos da como resultado
una clasificación ambigua. De hecho, las secuencias del genoma
completo de las cepas bacterianas también se han anotado de
forma ambigua. Una de las principales funciones del ARNr 16S
es la unión con las secuencias de ARNm de Shine-Dalgarno
durante la traducción y, por lo tanto, la secuencia anti-SD es
una de las características más significativas y conservadas en
los genes del ARNr 16S. Recientemente, Lin et al. (2008) han
examinado las anotaciones del gen 16S en secuencias
completas del genoma completo para detectar la presencia de
secuencias anti-SD. Se informó que los genes 16S de 67 de
252 especies diferentes se anotaron incorrectamente sin cubrir
la secuencia anti-SD. La inexactitud se debió principalmente a
la prevalencia de secuencias parciales 16S en
107
las bases de datos Por lo tanto, en la medida de lo posible, se
deben usar secuencias del gen 16S de longitud completa de
aproximadamente 1500 pb para las búsquedas de homología y
también se debe considerar el % de cobertura en el mejor resultado.
Además del análisis de homología de secuencia 16S, se
recomiendan patrones de huellas dactilares genómicas, MLSA
y DDH para la identificación de especies de procariotas.
La amplificación y secuenciación directa de los genes 16S
proporciona una visión más representativa de la estructura de
una comunidad microbiana que las técnicas clásicas de cultivo
puro. Sin embargo, estimar la diversidad microbiana sigue
siendo un desafío persistente y no hay informes disponibles
sobre la estimación de la biodiversidad microbiana completa.
Los cebadores 16S universales, que se utilizan actualmente,
están diseñados en base a las secuencias 16S existentes en
las bases de datos y estos cebadores pueden tener como
objetivo solo una parte de la diversidad total de especies.
Además, la amplificación preferencial de algunas plantillas de
ADN junto con el sesgo de clonación puede dar lugar a una
visión sesgada de la estructura de la comunidad microbiana. La
MLSA ha revelado múltiples ecotipos dentro de las especies de
bacterias cultivadas. Por lo tanto, el análisis de la secuencia
16S puede no revelar los ecotipos entre los organismos no
cultivados, ya que los ecotipos suelen ser idénticos o casi
idénticos en sus secuencias 16S.
En conclusión, además del análisis de la secuencia 16S, se
han desarrollado y se encuentran actualmente en práctica un
número suficiente de enfoques alternativos para el análisis
filogenético microbiano.
Sin embargo, aún deben desarrollarse estrategias innovadoras
para el análisis de la diversidad microbiana total.
La estrategia de PCR con minicebador de 10 nt es un avance
reciente que ha revelado genes 16S más divergentes que la
PCR normal. Recientemente, se ha propuesto el método de
pirosecuenciación 454 para la secuenciación del genoma
ambiental de alto rendimiento sin sesgos de amplificación y
clonación. Por lo tanto, los avances en la clonación libre de
células, las tecnologías de secuenciación de segunda generación
con longitudes de lectura mejoradas y la secuenciación masiva
de ADN ambiental pueden finalmente revelar la diversidad total
del mundo microbiano.
Agradecimientos
JR agradece al Departamento de Ciencia y Tecnología de
Nueva Delhi por brindar apoyo financiero (No. 0070/2008). Los
autores agradecen a la Comisión de Becas Universitarias por el
apoyo a través del Centro para la Excelencia en Ciencias
Genómicas y el Centro de Recursos de Redes en Ciencias
Biológicas.
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108
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