MICROBIOLOGÍA PRÁCTICO

TAREA N°05:
IV Ciclo de Estudios Semestre Académico 2020 – I

Grupo 7A
Alumnos:
- Amenero Delgado Joaquín 2018113936
- Arboleda Martínez Jazmín Karina 2017222167
- Burga Pecsen Sebastián Alexander 2018114998
- Capuñay Wan Luz Angie 2017222219
- Carrión Salas Magna Katerine 2019152762
- Casusol Guerrero Jose Luis 2018217943
- Chafloque Mendoza Alexa Mya 2017222230
- Chupillon Torres Esteban Samuel 2018219861
- Delgado Rojas Alexia Fernanda 2017222285
- Deza Guzman Angie Yomaira 2018115023

Docente:
Dr. Juan Chapoñan Mendoza

Pimentel – Perú

2020
 INTRODUCCION

Los medios de cultivo, tinciones, pruebas han sido muy importantes en el

desarrollo de la microbiología como ciencia, por esta razón es necesario que se
adquieran conocimientos y que se conozcan los métodos básicos para después
aplicarlos en el campo de la investigación experimental. En este caso, lo
principal que deberíamos tomar en cuenta para empezar a estudiar
microorganismos es el medio en el que estos viven, crecen, o se piensa
sembrar, llamado medio de cultivo, el cual es un conjunto de nutrientes,
factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de microorganismos. Estos medios pueden ser de
diferente composición, según las necesidades nutricionales del organismo que
se busca crecer o aislar. En todo caso, se pueden clasificar por su estado como
medios sólidos, y medios líquidos, según contengan o no agar
respectivamente. Dado que los microorganismos son ubicuos (se pueden
detectar casi en cualquier hábitat), los medios de cultivo y los instrumentos
deben ser esterilizados antes de su empleo. Esto con la finalidad de evitar
contaminaciones al trabajar con un cultivo de microorganismos puro. En
función de esto existen distintos métodos para llevar a cabo la esterilización,
entendiéndose esta como la destrucción completa de todos los
microorganismos, incluidas formas resistentes como esporas bacterianas, virus
sin envoltura y hongos.
 OBJETIVOS

1.- Conocer y realizar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento

bacteriano.

2.- Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.

 TÉCNICAS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO

CULTIVO POR SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra
(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano.
Para sembrar en microbiología es necesario mantener la habitación sin
corrientes de aire y estar al lado de la llama de un mechero (no más de 15 cm.
de distancia). También se puede trabajar bajo campana, o en flujo laminar,
previa esterilización con luz UV.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando
ansa, hilo, o bien hisopo o pipeta estéril. Se debe esterilizar en la llama (hasta
que todo el filamento se haya puesto al rojo vivo) el ansa o el hilo y enfriar,
antes y después de realizada la siembra. Para transferir los microorganismos,
se recomienda:
- Medio líquido a medio líquido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo.
- Medio líquido a medio sólido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo, e
hisopo.
- Medio sólido a medio sólido: utilizar ansa o hilo.
- Medio sólido a medio líquido: ansa o hilo.
Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada
para el crecimiento.

1. Cultivo en medio sólido

A. Tubos con agar inclinado

Antes y después de la siembra es importante pasar la boca del tubo (sin

la tapa) por la llama del mechero (flameado). Esto debido a que el
calentamiento puede matar los microorganismos que se encuentren en
la boca de los recipientes y prevenir la contaminación. Para realizar la
siembra se puede utilizar

 Ansa, se realiza un movimiento suave sobre la superficie del agar en

forma de zigzag, desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de
no dañar el agar.
 Hilo, se realiza la punción y luego se siembra en la superficie de
manera similar al anterior, pero extremando los cuidados para no
romper la superficie.

En este tipo de siembra se pueden cultivar microorganismos aerobios o

anaerobios facultativos y además se utiliza para almacenar cultivos
durante cortos períodos de tiempo a temperaturas de 4ºC, o para la
amplificación de un inóculo pequeño.

B. Siembra en placas

Puede ser en superficie (utilizando espátula de Drigalski, ansa o hisopo)

o por mezcla (el inóculo con el medio de cultivo agarizado aún fundido, a
temperatura de unos 45ºC, se mezclan y se vierte en la placa de Petri,
como se explica en detalle más adelante).
Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua
en el medio puede provocar condensación en la tapa de la misma
durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende
dando un crecimiento confluente. En medio sólido cada célula viable
dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede
utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar
y aislar.
 2. Cultivo en medio semisólido

Se utilizan tubos sin inclinar. Se siembra por picadura o punción

utilizando un hilo. Este tipo de medio contiene una proporción menor de
agar que los medios sólidos. El medio queda inoculado al introducir el
hilo en profundidad, pero sin tocar el fondo del tubo, retirándolo
posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura.
En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no
móvil, en el primer caso se observará turbidez, donde se hizo la
picadura. Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo
de la picadura.

3. Cultivo en medio líquido

En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto, no

sirven como técnica de aislamiento. La utilización de medios de cultivo líquidos
permite la obtención de una población microbiana grande, con un elevado
número de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. En estos
cultivos se examinará la existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la
formación de una película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento
en el fondo del tubo, etc.

CULTIVOS POR DILUCIONES

Consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inóculo, ésta se utiliza
cuando se tienen muestras líquidas (orina, agua), se realiza haciendo diluciones a las
muestras: 1:100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se siembra cada dilución en placas de
Petri con medios de cultivo. Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al
examen macroscópico, como la morfología de las colonias, actividades bioquímicas o
características inmunológicas de los microorganismos aislados.

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO
Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población
heterogénea de microorganismos. En hábitats naturales raramente
encontramos un solo tipo de microorganismo en una muestra, por lo tanto, es
necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar
los distintos tipos de microorganismos presentes. El objetivo del aislamiento es
obtener colonias bien separadas (las colonias se forman a partir de una sola
“unidad formadora de colonias”) de las que se conseguirá un cultivo puro. Una
vez obtenidos los cultivos puros se podrán estudiar las características
macroscópicas, microscópicas, fisiológicas, etc. de un microorganismo en
particular. Hay que tener en cuenta que siempre el aislamiento se da en un
medio sólido. El medio líquido sirve para enriquecer, pero no para aislar.

Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:

1. Métodos generales

A. Por diseminación en superficie (agotamiento de ansa, depósito y

posterior quemado y dilución)

Es la técnica más utilizada. Con un ansa de siembra, calentada al

rojo vivo en el mechero y enfriada cerca del mismo, se toma una
muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre la
superficie de la placa con el medio agarizado, pero sin hacer presión
para no dañar el agar. Se lleva la placa a incubar a la temperatura
adecuada, siempre en posición invertida lo que evitará que el agua
de condensación se deposite sobre la superficie del medio,
dificultando la obtención de colonias aisladas. Mediante estas
técnicas se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que
contenga un elevado número de bacterias

B. Por mezcla

Permite el cálculo del número de bacterias presentes en la muestra,

si se trabaja con exactitud. Se realizan diluciones seriadas de la
muestra y se coloca en tubos estériles, por separado, el mismo
volumen de cada una. Luego se vierte en el tubo, medio de cultivo
fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. El contenido se
homogeneiza por rotación, y luego se lo vierte sobre la superficie de
una placa de Petri. Tras la homogeneización, se dejan enfriar las
placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban
a la temperatura adecuada (siempre en posición invertida).

2. Métodos especiales

Se basan en las características del germen que se quiere aislar.

A. Calentamiento: se utiliza para el aislamiento de gérmenes

esporulados de los no esporulados. Consiste en calentar la
suspensión a 100ºC durante 10 min. y 85ºC durante 15 o 30 min.
Luego se siembra en medios sólidos.

B. Agregado de álcali o ácido: tratamiento de la muestra con algunos

de estos agentes ya que existen microorganismos que los resisten y
otros que no.

C. Variaciones de la temperatura de incubación: incubando a dos

temperaturas distintas
D. Cambios en el pH: existen unos pocos gérmenes que pueden crecer
en medios con pHs extremos.

E. Presencia de sales o colorantes: debido a la capacidad de distintos

microorganismos de crecer o no en medios con sales, sustratos,
colorantes o antibióticos, se utilizan distintos medios de cultivo con el
fin de lograr su aislamiento.
 MÉTODO DE
SIEMBRA Y
AISLAMIENTO
BACTERIANO

Método de Metodo de
siembra aislamiento
bacteriano bacteriano

Cultivo en Cultivo en
Cultivo en Metodos Metodos
medio solido medio
medio líquido generales especiales
semisólido

Por
Tubos con agar diseminación en Calentamiento
inclinado superficie

Agregado de
Por mezcla álcal o ácido

Cambios en el
Siembra en PH
placas

Presencia de
sales o
colorantes

Variaciones de
la temperatura
de incubación
 MÉTODOS DE SIEMBRA
BACTERIANO

Transferir
Cultivos
microorganismos

Cultivo en medio Cultivo en medio

Medio líquido a líquido Medio líquido a sólido Medio sólido a líquido Medio sólido a sólido Cultivo en medio sólido
semisólido líquido

Pipeta Pasteur o Pipeta Pasteur o Tubos con agar Se utilizan tubos sin No es técnica de
Ansa o hilo Ansa o hilo Siembra en placas
graduada, ansa o hilo graduada, ansa o hilo inclinado inclinar aislamiento

Pasar la boca del tubo Permite la obtención

Incubación de las Se siembra por
por la llama del de una población
placas invertidas picadura o punción
mechero microbiana grande

Alta concentración de
Antes y después de la agua provoca
siembra condensación en la
tapa
 MÉTODOS DE
AISLAMIENTO
BACTERIANO

Métodos generales Métodos especiales

Variaciones de la
Presencia de sales o Agregado de álcali o
Por mezcla Por diseminación en la Calentamiento temperatura de Cambios en el PH
colorantes ácido
superficie de un medio incubación
sólido en placa de Petri

Permite calcular el
Se utilizan distintos Aislamiento de
número de bacterias Tratamiento de la Incubando a dos
medios de cultivo con gérmenes esporulados Extremófilos
presentes en la muestra temperaturas distintas
Extensión se superficie el fin de lograr su de los no esporulados
muestra
con espátula de aislamiento
Drigalski

Organismos resistentes

Agotamiento de ansa Debido a la capacidad

de los microorganismos
de crecer o no en
medio de sales

Dilución previa en
solución fisiológica

Depósito y posterior
quemado
CUESTIONARIO

1. ¿Qué método de siembra usaría en cada uno de los casos siguientes?

• Cultivo de heces:

Los medios de cultivo utilizados son medios selectivos y de enriquecimiento

que permiten el crecimiento de las bacterias que se desea aislar inhibiendo el
resto de la flora. Se realiza una siembra por estría en los agares macconkey,
Eosina y azul de metileno y Salmonella Shigella, cada uno con su respectivo
hisopo.

• Cultivo de líquido cefalorraquídeo:

El LCR debe ser sembrado en agar chocolate en tubo inclinado o en placa de

Petri. El agar chocolate debe ser preparado usando como base medio Agar
Mueller-Hinton (MH) suplementado con 5% sangre desfibrinada de conejo,
carnero o caballo. Como alternativa se pueden utilizar los medios Agar
Columbia, Agar Tripticasa Soya (TSA) o Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI).

• Contaje de colonias en urocultivo:

Se realiza una siembra por estría en toda la superficie de la placa, se utilizan

medios de cultivo para Gram. positivos (agar Sangre, agar Chocolate, agar
S110) y para Gram. negativos (EMB, Mac Conkey). En estas placas, la orina
debe sembrarse e incubarse a 37ºC de 24 a 48 horas.

2. ¿Por qué el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo

bacteriano? ¿Qué sustancias se le pueden agregar para hacerlo
enriquecido para bacterias Gram positivas?

El agar nutritivo es un medio de cultivo sólido no selectivo y no diferencial. En

este medio crecen todo tipo de bacterias no exigentes desde el punto de vista
nutricional. Su utilidad en el laboratorio es muy variada. Principalmente sirve
para el subcultivo de especies, mantenimiento de cepas, contaje de colonias,
como base para preparar agar sangre, entre otras.

3. ¿Cuál es la importancia de un cultivo puro?

Se denomina cultivo puro al que contiene solo un tipo de microorganismos. Los

cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los
individuos del mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros
son importantes para llevar a cabo el estudio de las características de los
microorganismos y para poder identificarlos con seguridad.
RESULTADOS
CONCLUSIONES

1. La siembra es la técnica que se utiliza para introducir artificialmente una

muestra a un medio adecuado para su cultivo. Estos métodos de siembra
pueden realizarse: en medio líquido, sólido o semisólido; se puede utilizar
ansa, hilo o un hisopo o pipeta para el procedimiento de la siembra. El
aislamiento se pone en práctica, para asi obtener colonias bien separadas (las
colonias se forman a partir de una sola “unidad formadora de colonias”) de las
que se conseguirá un cultivo puro.

2. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismos.

La obtención de un cultivo puro se hace mediante una técnica de aislamiento.
La técnica de aislamiento más utilizada consiste en sembrar en un medio de
cultivo sólido en placa de tal manera que los microorganismos generen
colonias separadas. El objetivo es obtener, a partir de un elevado número de
bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la
superficie de la placa. Sólo después de haber obtenido un cultivo puro se
puede identificar un microorganismo y/o estudiar sus características
bioquímicas o de otro tipo.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Organización Panamericana de la Salud. Diagnóstico de laboratorio.

Washington: OPS; 2011. Disponible en:
https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2012/PAHO-Manual-Meningo-Esp-
2011.pdf

2. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.MICROBIOLOGIA

GENERAL. 28.[Internet].2020 [citado 18 julio de 2020] : Disponible en:
https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/202403/mod_resource/conte
nt/1/2020%20TP2%20BIOQ%20Y%20LCTA.pdf

3. Microbiología cultivos puros y aislamiento - CAZEM980410 [Internet]. StuDocu.

[citado 18 de julio de 2020]. Disponible en: https://www.studocu.com/es-
mx/document/universidad-autonoma-del-estado-de-
mexico/microbiologia/practicas/microbiologia-cultivos-puros-y-
aislamiento/2966964/view