ESTUDIOS SOBRE LA NATURALEZA QUÍMICA DE LA SUSTANCIA QUE INDICA LA

TRANSFORMACIÓN DE TIPOS NEUMOCÓCICOS

INDUCCIÓN DE LA TRANSFORMACIÓN POR UNA FRACCIÓN DE ÁCIDO DESOXIRIBONÚCLEO
AISLADA DE PNEUMOCOCCUS TIPO III

Los biólogos han intentado durante mucho tiempo, por medios químicos, inducir en los
organismos superiores cambios predecibles y específicos que posteriormente podrían
transmitirse en serie como caracteres hereditarios. Entre los microorganismos, el ejemplo más
notable de alteraciones heredables y específicas en la estructura y función celular que pueden
inducirse experimentalmente y son reproducibles en condiciones bien definidas y
adecuadamente controladas es la transformación de tipos específicos de neumococo. Este
fenómeno fue descrito por primera vez por Grifth que tuvo éxito en la transformación de una
variante atenuada y no encapsulada (R) derivada de un tipo específico en células (S) totalmente
encapsuladas y virulentas de un tipo heterólogo específico. Una instancia típica será suficiente
para ilustrar las técnicas originalmente utilizadas y servir para indicar la gran variedad de
transformaciones que son posibles dentro de los límites de esta especie bacteriana.
Griffth descubrió que los ratones inyectados subcutáneamente con una pequeña cantidad de
un cultivo R vivo derivado de Pneumococcus Tipo 2 junto con un inóculo grande de células tipo
III (S) muertas por calor sucumbían frecuentemente a la infección, y que la sangre del corazón
de estos animales producía Tipo 3 neumococos en cultivo puro. El hecho de que la cepa R era
avirulenta e incapaz de causar bacteriemia mortal y el hecho adicional de que la suspensión
calentada de las células Tipo 3 no contenía organismos viables aportó pruebas convincentes de
que las formas R que crecían bajo estas condiciones habían adquirido recientemente la
estructura capsular y especificidad biológica de los neumococos tipo III.
Las observaciones originales de Griffith fueron confirmadas posteriormente por Neufeld y
Levinthal, y por Banrherm en el extranjero, y por Dawson en este laboratorio. Posteriormente,
Dawson y Sia lograron inducir la transformación invitro. Esto lo lograron cultivando células R en
un medio fluido que contiene suero anti-R y células S encapsuladas muertas por calor.
Mostraron que en el tubo de ensayo como en la transformación corporal del animal se puede
inducir selectivamente, dependiendo de la especificidad de tipo de las células S utilizadas en el
sistema de reacción. Más tarde, Alloway fue capaz de causar una transformación específica in
vitro utilizando extractos estériles de células S a partir de los cuales todos los elementos
formados y restos celulares se habían eliminado mediante filtración de Berkefeld. De este modo,
mostró que los extractos crudos que contienen material transformante activo en forma soluble
son tan efectivos en inducir una transformación específica como lo son las células intactas a
partir de las cuales se prepararon los extractos.
Otro ejemplo de transformación que es análogo a la interconversión de los tipos de neumococos
se encuentra en el campo de los virus. Berry y Dedrick lograron cambiar el virus del fibroma de
conejo (Shope) por el del mixoma infeccioso (Sanarelli).
Estos investigadores inocularon conejos con una mezcla de fibroma activo junto con una
suspensión de virus de mixoma inactivado por calor y produjeron en los animales los síntomas
y las lesiones patológicas características de la mixomatosis infecciosa.
En el paso posterior de los animales, el virus transformado era transmisible e indujo una
infección mixomatosa típica de la enfermedad que se produce de forma natural.
Más tarde, Berry tuvo éxito en inducir la misma transformación usando una suspensión
inactivada por calor de cuerpos elementales lavados de virus del mixoma. En el caso de estos
virus, los métodos empleados fueron similares en principio a los utilizados por Griffith en la
transformación de los tipos de neumococos. Estas observaciones han sido posteriormente
confirmadas por otros investigadores.
El presente trabajo se refiere a un análisis más detallado del fenómeno de transformación de
tipos específicos de neumococo. El principal interés se ha centrado en los intentos de aislar el
principio activo de extractos bacterianos crudos y para identificar si es posible su naturaleza
química o, al menos, para caracterizarlo lo suficiente como para colocarlo en un grupo general
de sustancias químicas conocidas.
Para fines de estudio, el ejemplo típico de transformación elegido como modelo de trabajo fue
el que más experiencia tuvimos y que, en consecuencia, pareció el más adecuado para el análisis.
Este ejemplo particular representa la transformación de una variante R no encapsulada de
Pneumococcus Tipo II a Pneumococcus Tipo III.

EXPERIMENTAL
La transformación de los tipos de neumococos in vitro requiere que se cumplan ciertas
condiciones culturales antes de que sea posible demostrar la reacción incluso en presencia de
un extracto potente. El medio de caldo no solo debe ser óptimo para el crecimiento, sino que
debe complementarse con la adición de suero o fluido seroso que se sabe que posee ciertas
propiedades especiales. Además, la variante R, como se mostrará más adelante, debe estar en
la fase reactiva en la que tiene la capacidad de responder al estímulo transformador. Por motivos
de conveniencia, estos diversos componentes, combinados en la prueba de transformación, se
denominarán sistema de reacción. Cada componente de este sistema presentaba problemas
que requerían aclaración antes de que fuera posible obtener resultados consistentes y
reproducibles. Los diversos componentes del sistema se describirán en el siguiente orden: caldo
nutritivo, suero o fluido seroso, cepa de R neumococo y extracción, purificación y naturaleza
química del principio de transformación.
1. Caldo de nutrientes: se utiliza como medio básico el caldo de infusión de carne de res que
contiene 1% de neopeptona sin dextrosa añadida y ajustado a un pH inicial de 7.6 - 7.8. Los lotes
individuales de caldo muestran variaciones marcadas e impredecibles en la propiedad de apoyar
la transformación. Se ha encontrado, sin embargo, que la adsorción de carbón, de acuerdo con
el método descrito por MacLeod y Mirick para la eliminación de inhibidores de sulfonamida,
elimina en gran medida estas variaciones; en consecuencia, este procedimiento se usa como
rutina en la preparación de caldo eficaz de forma consistente para valorar la actividad de
transformación de los extractos.
2. Suero o fluido sérico. En los primeros experimentos exitosos sobre la inducción de la
transformación in vitro, Dawson y Sia descubrieron que era esencial agregar suero al medio. Se
utilizó suero de conejo anti-R neumocócico debido a la observación de que la reversión de un
neumococo R a la forma S homóloga puede ser inducida por crecimiento en un medio que
contiene suero anti-R. Más tarde, Alloway descubrió que el líquido ascítico o de tórax y el suero
de cerdo normal, todos los cuales contienen anticuerpos R, son capaces de reemplazar el suero
de conejo antineumocócico en el sistema de reacción. Alguna forma de suero es esencial, y para
nuestro conocimiento la transformación in vitro nunca se ha efectuado en ausencia de suero o
fluido seroso.
En el presente estudio, el líquido pleural o ascítico humano se ha usado casi exclusivamente. Se
hizo evidente, sin embargo, que la eficacia de diferentes lotes de suero variaba y que las
diferencias observadas no dependían necesariamente del contenido de anticuerpos R, ya que
se encontró que muchos sueros de alto título eran incapaces de soportar la transformación. Este
hecho sugirió que están involucrados otros factores además de los anticuerpos R.
Se ha encontrado que los sueros de diversas especies animales, independientemente de sus
propiedades inmunitarias, contienen una enzima capaz de destruir el principio de
transformación en extractos potentes. La naturaleza de esta enzima y el sustrato específico
sobre el que actúa se mencionarán más adelante en este documento. Esta enzima se inactiva
calentando el suero a 60 ° -65 ° C, y los sueros calentados a temperaturas conocidas para destruir
la enzima a menudo se hacen efectivos en el sistema de transformación. Un análisis adicional ha
demostrado que ciertos sueros en los que los anticuerpos R están presentes y en los que la
enzima se ha inactivado pueden, sin embargo, no soportar la transformación. Este hecho sugiere
que aún otro factor en el suero es esencial. El contenido de este factor varía en diferentes
sueros, y actualmente su identidad es desconocida.
En la actualidad no existen criterios que puedan utilizarse como guía en la selección de sueros o
fluidos serosos adecuados, excepto en el caso de que realmente se pruebe su capacidad para
soportar la transformación. Afortunadamente, las propiedades requeridas son estables y
permanecen intactas durante largos períodos de tiempo; y se ha encontrado que los sueros que
se han almacenado en el refrigerador durante muchos meses han vuelto a probar que han
perdido poca o ninguna de su eficacia original para apoyar la transformación. El reconocimiento
de estos diversos factores en el suero y su papel en el sistema de reacción ha facilitado
enormemente la estandarización de las condiciones culturales requeridas para obtener
resultados consistentes y reproducibles.
3. La cepa R (R36A) .- La cepa R no encapsulada utilizada en el presente estudio se derivó de un
cultivo "S" virulento de neumococo tipo II.
Se recordará que, independientemente de la derivación de tipo, todas las variantes "R" de
Pneumococcus se caracterizan por la falta de formación de cápsula y la consiguiente pérdida de
especificidad de tipo y la capacidad de producir infección en el cuerpo del animal. La designación
de estas variantes como formas R se ha utilizado para referirse simplemente al hecho de que en
los medios artificiales la superficie de la colonia es "rugosa" en contraste con la superficie lisa y
brillante de las colonias de células S encapsuladas.
La cepa R mencionada anteriormente como R36A se derivó cultivando el cultivo S primario de
Pneumococcus Tipo II en caldo que contenía suero de conejo antipneumococo tipo II para 36
pases en serie y aislando la variante así inducida. La cepa R36A ha perdido todas las
características específicas y distintivas de los organismos S padres y consiste únicamente en
variantes R atenuadas y no encapsuladas. El cambio S <=> R es a menudo reversible siempre que
las células no estén demasiado "degradadas". La reversión de la forma R a su tipo específico
original puede lograrse con frecuencia mediante pasajes sucesivos de animales o mediante
subcultivo en serie repetido en suero anti-R. Sin embargo, cuando la reversión ocurre bajo estas
condiciones, el cultivo invariablemente vuelve a la forma encapsulada del mismo tipo específico
del que se deriva. La cepa R36A se ha vuelto relativamente fija en la fase R y nunca ha revertido
espontáneamente a la forma S de tipo II. Además, los intentos repetidos de hacer que revierte
bajo las condiciones que acabamos de mencionar no han tenido éxito en todos los casos.
La conversión reversible de S  R dentro de los límites de un solo tipo es bastante diferente de
la transformación de un tipo específico de Pneumococcus en otro tipo específico a través de la
forma R. Nunca se ha observado que la transformación de los tipos ocurra espontáneamente y
se ha inducido experimentalmente solo mediante las técnicas especiales descritas
anteriormente en este documento. En estas condiciones, la síntesis enzimática de un
polisacárido capsular química e inmunológicamente diferente está específicamente orientada y
determinada selectivamente por el tipo específico de células S utilizadas como fuente del agente
transformante.
En el curso del presente estudio, se observó que el cultivo de reserva de K36 en transferencias
en serie en caldo de sangre se somete a disociación espontánea dando lugar a una serie de otros
(R) variantes que pueden distinguirse una de otra por la forma de colonia. La importancia de
esto en el caso presente radica en el hecho de que de cuatro variantes diferentes aisladas del
cultivo R primario, solo una (R36A) es susceptible a la acción transformante de extractos
potentes, mientras que las otras no responden y son totalmente inactivas en este considerar. El
hecho de que existan diferencias en la respuesta de diferentes variantes R al mismo estímulo
específico enfatiza el cuidado que se debe ejercer en la selección de una variante R adecuada
para usar en experimentos de transformación.
La capacidad de esta variedad R (R36A) para responder a una variedad de diferentes agentes de
transformación se muestra por la disposición con la que se puede transformar a los Tipos I, III,
VI o XIV, así como a su tipo original (Tipo II ), a lo que, como se ha señalado, nunca ha revertido
espontáneamente.
Aunque la importancia del siguiente hecho se pondrá de manifiesto más adelante, debe
mencionarse aquí que las células neumocócicas poseen una enzima capaz de destruir la
actividad del principio transformante. De hecho, se ha encontrado que esta enzima está
presente y es muy activa en los autolisados de varias cepas diferentes. El hecho de que esta
enzima intracelular se libere durante la autolisis puede explicar, al menos en parte, la
observación de Dawson y Sia de que es esencial para lograr la transformación en el tubo de
ensayo para usar un pequeño inóculo de células R jóvenes y de crecimiento activo. La
irregularidad de los resultados y a menudo la incapacidad de inducir la transformación cuando
se usan inóculos grandes puede ser atribuido a la liberación de células autólogas de una cantidad
de esta enzima suficiente para destruir el principio de transformación en el sistema de reacción.
Para obtener resultados consistentes y reproducibles, se deben tener en cuenta dos hechos:
primero, que una cultura R puede experimentar una disociación espontánea y dar lugar a otras
variantes que han perdido la capacidad de responder al estímulo transformador; y en segundo
lugar, que las células neumocócicas contienen una enzima intracelular que cuando se libera
destruye la actividad del principio transformante. En consecuencia, es importante seleccionar
una cepa sensible y evitar, en la medida de lo posible, los cambios destructivos asociados con la
autólisis.
Método de titulación de la actividad de transformación: en el aislamiento y purificación del
principio activo a partir de extractos brutos de células neumocócicas, es deseable tener un
método para determinar cuantitativamente la actividad de transformación de diversas
fracciones.
El procedimiento experimental utilizado es el siguiente: la esterilización del material a analizar
para la actividad se lleva a cabo mediante el uso de alcohol ya que se ha descubierto que este
reactivo no tiene ningún efecto sobre la actividad. Se precipita un volumen de extracto medido
en un tubo de centrífuga estéril mediante la adición de 4 a 5 volúmenes de alcohol etílico
absoluto, y la mezcla se deja reposar 8 o más horas en el refrigerador para efectuar la
esterilización. El material precipitado con alcohol se centrifuga, el sobrenadante se descarta, y
el tubo que contiene el precipitado se deja drenar durante unos minutos en la posición invertida
para eliminar el exceso de alcohol. La boca del tubo se quema con cuidado y se inserta un tapón
de algodón estéril seco. El precipitado se redisuelve en el volumen original de solución salina. La
esterilización del material activo mediante esta técnica ha demostrado invariablemente ser
efectiva. Este procedimiento evita la pérdida de sustancia activa que puede ocurrir cuando la
solución se pasa a través de un filtro Berkefeld o se calienta a las altas temperaturas requeridas
para la esterilización.
Al caldo adsorbido en carbón descrito más arriba, se agrega el 10 por ciento del fluido ascítico o
láctico estéril que se ha calentado previamente a 60 ° C. durante 30 minutos, para destruir la
enzima que se sabe que inactiva el principio de transformación. El medio enriquecido se
distribuye en condiciones asépticas en 2,0 cc. cantidades en tubos estériles que miden 15 × 100
pistones. El extracto esterilizado se diluye en serie en solución salina neutralizada a pH 7,2-7,6
mediante la adición de NaOH 0,1 n o se puede diluir de manera similar en tampón de fosfato u
/ 40, pH 7,4. 0.2 cc. de cada dilución se agrega a al menos 3 o 4 tubos del medio de suero. Los
tubos se siembran luego con un cultivo de caldo de sangre de 5 a 8 horas de R36A. 0.05 cc. de
una dilución 10-4 de este cultivo se agrega a cada tubo, y los cultivos se incuban a 37 ° C. por 18
a 24 horas.
Las propiedades anti-R del suero en el medio hacen que las células R se aglutinen durante el
crecimiento, y grupos de células aglutinadas se depositan en el fondo del tubo dejando un
sobrenadante claro. Cuando ocurre la transformación, las células S encapsuladas, que no se ven
afectadas por estos anticuerpos, crecen difusamente a través del medio. Por otro lado, en
ausencia de transformación, el sobrenadante permanece claro y solo se produce el crecimiento
sedimentado de los organismos R. Esta diferencia en el carácter del crecimiento hace posible
que mediante la inspección solo se distingan tentativamente entre resultados positivos y
negativos.
Como rutina, todas las culturas(colonias) se colocan en placas en agar sangre para su
confirmación y posterior identificación bacteriológica. Dado que los extractos utilizados en el
presente estudio se derivaron del neumococo tipo III, la diferenciación entre las colonias del
organismo R original y las de las células S transformadas es especialmente llamativa, siendo
estas últimas colonias mucoides grandes, brillantes y típicas del neumococo tipo III . Figs. 1 y 2
ilustran estas diferencias en forma de colonia.
En la Tabla IV se da un protocolo típico de una titulación de la actividad de transformación de
una preparación altamente purificada.
Métodos preparativos

Fuente MateriaL - En la presente investigación, se utilizó una cepa de Pneumococcus tipo III
(A66) como cepa de laboratorio para obtener el principio activo. Cultivos en masa de estos
organismos se cultivan en lotes de 50 a 75 litros de caldo infusión de corazón de carne de vacuno.
Después de 16 a 18 horas de incubación a 37 ° C. los cielos bacterianos se recogen en una
centrífuga Sharpies esterilizable impulsada por vapor. La centrífuga está equipada con
serpentines de enfriamiento sumergidos en agua helada para que el líquido de cultivo se enfríe
completamente antes de que fluya hacia la máquina. Este procedimiento retarda la autólisis
durante el curso de la centrifugación. Las bacterias sedimentadas se retiran del cilindro colector
y se resuspenden en aproximadamente 150 cc. de solución salina enfriada (0,85 por ciento
NaC1), y se tiene cuidado de que todos los grumos estén completamente emulsionados. El
recipiente de vidrio que contiene la suspensión gruesa y cremosa de las células se sumerge en
un baño de agua, y la temperatura de la suspensión se eleva rápidamente a 65 ° C. Durante el
proceso de calentamiento, el material se agita constantemente y la temperatura se mantiene a
65 ° C. por 30 minutos. El calentamiento a esta temperatura inactiva la enzima intracelular
conocida por destruir el principio de transformación.
Extracción de células muertas por calor. Aunque se han usado varios procedimientos, solo se
describirá aquí el que se haya encontrado más satisfactorio. Las células calcinadas se lavan con
solución salina 3 veces. El principal valor del proceso de lavado es eliminar un gran exceso de
polisacárido capsular junto con gran parte de la proteína, el ácido ribonucleico y el polisacárido
somático "C". Las valoraciones cuantitativas de la actividad transformante han demostrado que
no se pierde más del 10 al 15 por ciento del material activo en el lavado, una pérdida que es
pequeña en comparación con la cantidad de sustancias inertes que se eliminan por este
procedimiento.
Después del lavado final, las células se extraen en 150 cc. de solución salina que contiene
desoxicolato de sodio en una concentración final del 0,5 por ciento agitando la mezcla
mecánicamente de 30 a 60 minutos. Las células se separan por centrifugación, y el proceso de
extracción se repite 2 o 3 veces. Los extractos de desoxicolato preparados de esta manera son
claros e incoloros. Estos extractos se combinan y precipitan mediante la adición de 3 a 4
volúmenes de alcohol etílico absoluto. El desoxicolato sódico soluble en alcohol permanece en
el sobrenadante y, por lo tanto, se elimina en esta etapa. El precipitado forma una masa fibrosa
que flota en la superficie del alcohol y puede eliminarse directamente levantándolo con una
espátula. El exceso de alcohol se drena del precipitado que luego se redisuelve en
aproximadamente 50 ce. de solución salina. La solución obtenida es usualmente viscosa,
opalescente y algo turbia.
Desproteinización y eliminación del polisacárido capsular. La solución se desproteiniza mediante
el método de cloroformo descrito por Sevag. El procedimiento se repite 2 o 3 veces hasta que la
solución se convierte en cariño. Después de este tratamiento preliminar, el material se
reprecipita en 3 a 4 volúmenes de alcohol. El precipitado obtenido se disuelve en un volumen
mayor de solución salina (150 cc) a la que se añaden de 3 a 5 nag. de una preparación purificada
de la enzima bacteriana capaz de hidrolizar el polisacárido capsular de Tipo III. La mezcla se
incuba a 37 ° C, y la destrucción del polisacárido capsular se determina mediante pruebas
serológicas con solución de anticuerpo de Tipo III preparada por disociación del precipitado
inmune de acuerdo con el método descrito por Lin y Wu. Las ventajas de utilizar la solución de
anticuerpos para este fin son que no reacciona con otras sustancias serológicamente activas en
el extracto y que detecta selectivamente la presencia de e polisacárido capsular en diluciones
tan altas como 1: 6.000.000. La degradación enzimática del polisacárido generalmente se
completa dentro de 4 a 6 horas, como se evidencia por la pérdida de reactividad serológica. El
digesto se precipita luego en 3 a 4 volúmenes de alcohol etílico, y el precipitado se redisuelve
en 50 cc. de solución salina. La desproteinización por el proceso de cloroformo se usa
nuevamente para eliminar la proteína enzimática añadida y las trazas restantes de la proteína
neumocócica. El procedimiento se repite hasta que no se ve más película de gel de proteína-
cloroformo en la interfaz.
Fraccionamiento del alcohol. Después de la desproteminación y la digestión enzimática del
polisacárido capsular, el material se fracciona repetidamente en alcohol etílico de la siguiente
manera. Se agrega alcohol etílico absoluto gota a gota a la solución con agitación constante. A
una concentración crítica que varía de 0,8 a 1,0 volumen de alcohol, el material activo se separa
en forma de hilos fibrosos que se enrollan alrededor de la varilla de agitación. Este precipitado
se elimina en la varilla y se lava en una mezcla al 50 por ciento de alcohol y solución salina.
Aunque la mayor parte del material activo se elimina por fraccionamiento a la concentración
crítica, una cantidad pequeña pero apreciable permanece en solución. Sin embargo, al aumentar
la concentración de alcohol a 3 volúmenes, la fracción residual se arroja junto con material inerte
en forma de un precipitado floculento. Este precipitado floculento se toma en un pequeño
volumen de solución salina (5 a 10 cc.) Y la solución se fracciona de nuevo mediante la adición
de 0,8 a 1,0 volumen de alcohol. Se obtiene material fibroso adicional que se combina con el
recuperado del solución original. El fraccionamiento alcohólico se repite de 4 a 5 veces. El
rendimiento de material fibroso obtenido por este método varía de 10 a 25 trapos. por 75 litros
de cultivo y representa la mayor parte del material activo presente en el extracto crudo original.
Efecto de la temperatura. Como procedimiento de rutina, todas las etapas de la purificación se
llevaron a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente lo contrario.
Debido a la ventaja teórica de trabajar a baja temperatura en la preparación de material
biológicamente activo, la purificación de un lote (preparación 44) se llevó a cabo en frío. En este
caso, todos los procedimientos anteriores, con la excepción de la exextracción de desoxicolato
y el tratamiento enzimático, se llevaron a cabo en una sala fría mantenida a 0-4 ° C.
Esta preparación demostró tener una actividad significativamente más alta que el material
preparado de manera similar a temperatura ambiente. La extracción con desoxicolato de las
células muertas por calor a baja temperatura es menos eficiente y produce cantidades más
pequeñas de la fracción activa. Se ha demostrado que las temperaturas más altas facilitan la
extracción del principio activo, aunque la actividad se conserva mejor a bajas temperaturas.

Análisis de material de transformación purificado

Propiedades generales. - Soluciones salinas que contienen 0,5 a 1,0 trapos. por co. de la
sustancia purificada son incoloros y claros en luz difusa. Sin embargo, en luz transmitida intensa
la solución no es del todo clara y cuando se agita presenta un brillo sedoso. Las soluciones en
estas concentraciones son altamente viscosas.
Material purificado disuelto en solución salina fisiológica y almacenado a 2-4 ° C. conserva su
actividad en título no disminuido durante al menos 3 meses. Sin embargo, cuando se disuelve
en agua destilada, disminuye rápidamente su actividad y se vuelve completamente inerte en
pocos días. Las soluciones salinas almacenadas en estado congelado en una caja de hielo con
CO2 (--70 ° C) conservan su potencia máxima durante varios meses. De forma similar, el material
precipitado de la solución salina mediante alcohol y almacenado bajo el sobrenadante
permanece activo durante un largo período de tiempo. El material parcialmente purificado
puede conservarse mediante secado desde el estado congelado en el aparato liófilo. Sin
embargo, cuando se usa el mismo procedimiento para la preservación de la sustancia altamente
purificada, se encuentra que el material sufre cambios que dan como resultado una disminución
en la solubilidad y pérdida de actividad.
La actividad del principio de transformación en extractos crudos aguanta el calentamiento de 30
a 60 minutos a 65 ° C. Las preparaciones altamente purificadas de material activo son menos
estables y se produce cierta pérdida de actividad a esta temperatura.
Todavía no se ha realizado un estudio cuantitativo del efecto del calentamiento del material
purificado a temperaturas más altas. Alloway, utilizando extractos crudos preparados a partir de
cebos neumocócicos Tipo III, descubrió que ocasionalmente la actividad aún podía demostrarse
después de 10 minutos de exposición en el baño de agua a temperaturas tan altas como 90 ° C.
Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo con soluciones ajustadas a
la reacción neutra, ya que se ha demostrado que las concentraciones de iones de hidrógeno en
el rango ácido dan como resultado una pérdida progresiva de actividad. La inactivación ocurre
rápidamente a pH 5 y por debajo.
Pruebas químicas cualitativas. -El material purificado en solución concentrada da biuret negativo
y pruebas de Millon. Estas pruebas se han realizado directamente en material seco con
resultados negativos. La reacción de difenilamina de Dische para el ácido desoxirribonucleico es
muy positiva. La prueba de orcinol (Bial) para el ácido ribonucleico es débilmente positiva. Sin
embargo, se ha encontrado que en concentraciones similares, las preparaciones puras de ácido
desoxirribonucleico de origen animal preparadas por diferentes métodos dan una reacción de
Blal de intensidad correspondiente.
Aunque no se han realizado pruebas específicas para la presencia de lípidos en el material
purificado, se ha encontrado que el material bruto puede extraerse repetidamente con alcohol
y éter a -12 ° C. sin pérdida de actividad. Además, como se observará en los procedimientos
preparatorios, la precipitación repetida de alcohol y el tratamiento con cloroformo no dan como
resultado una disminución de la actividad biológica.
Análisis químico elemental. Se analizaron cuatro preparaciones purificadas para determinar el
contenido de nitrógeno, fósforo, carbono e hidrógeno. Los resultados se presentan en la Tabla
I. Las relaciones nitrógeno-fósforo varían de 1.58 a 1.75 con un valor promedio de 1.67 que está
en acuerdo con el calculado sobre la base de la estructura teórica del desoxirribonucleato de
sodio (tetranucleótido).
Las cifras analíticas por sí mismas no establecen que la sustancia aislada sea una entidad química
pura. Sin embargo, sobre la base de la relación nitrógeno-fósforo, parecería que hay pocas
proteínas u otras sustancias que contengan nitrógeno o fósforo como impurezas, ya que si
estuvieran esta relación se vería considerablemente alterada.
Análisis Enzimático. - Varias enzimas crudas y cristalinas 2 han sido probadas por su capacidad
para destruir la actividad biológica de extractos bacterianos potentes. Extractos tamponados al
pH óptimo, a los que se les añadió tripsina cristalina y quimotripsina O combinaciones de ambos,
no sufrieron pérdida de actividad después del tratamiento con estas enzimas. La pepsina no
pudo analizarse porque los análisis químicos elementales fueron realizados por el Dr. A. Elek del
Instituto Rockefeller.

TRANSFORMACIÓN DE TIPOS NEUMOCÓFICOS

los extractos se inactivan rápidamente al bajo pH requerido para su uso. El tratamiento

prolongado con ribonucleasa cristalina en condiciones óptimas no produjo una disminución
demostrable de la actividad de transformación. El hecho de que la tripsina, la quimotripsina y la
ribonucleasa no tengan ningún efecto sobre el principio de transformación es una prueba más
de que esta sustancia no es ácido ribonucleico o una proteína susceptible a la acción de las
enzimas trípticas.
Además de las enzimas cristalinas, se probaron sueros y preparaciones de enzimas obtenidas de
los órganos de diversos animales para determinar su efecto sobre la actividad transformante.
Se encontró que algunos de estos eran capaces de destruir por completo la actividad biológica.
Las diversas preparaciones de enzimas probadas incluyeron fosfatasas altamente activas
obtenidas de hueso de conejo por el método de Martland y Robison y de riñón de cerdo como
se describe por H. y E. Albers. Además, se usó una preparación hecha a partir de la mucosa
intestinal de perros por Levene y Dillon y que contenía una polinucleotidasa para el ácido
nucleico del timo. Autolisatos neumocócicos y una preparación comercial de pancreatina
también se probaron. La actividad de la fosfatasa alcalina de estas preparaciones se determinó
por su acción sobre el β-glicerofosfato y el fosfato de fenilo, y la actividad esterasa por su
capacidad para dividir la tributirina. Dado que se encontró que el material transformante
altamente purificado aislado de extractos de neumococos contenía ácido desoxirribonucleico,
estas mismas enzimas se probaron para determinar su actividad despolimerasa en muestras
conocidas de ácido desoxirribonucleico aislado por Mirsky s de esperma de peces y tejidos de
mamíferos. Los resultados se resumen en la Tabla II en la que la actividad de fosfatasa, esterasa
y nucleodepolimerasa de estas enzimas se compara con su capacidad para destruir el principio
de transformación. El análisis de estos resultados muestra que, independientemente de la
presencia de fosfatasa o esterasa, solo aquellas preparaciones que contienen una enzima capaz
de despolimerizar auténticas se encontraron muestras de ácido desoxirribonucleico para
inactivar el principio de transformación.
Greenstein y J'enrette han demostrado que los extractos de tejidos, así como la leche y el suero
de varias especies de mamíferos, contienen un sistema enzimático que causa la
despolimerización del ácido desoxirribonucleico. A este sistema enzimático, Greenstein le dio
posteriormente el nombre de desoxirribonucleodepolimerasa.
Estos investigadores determinaron la actividad de la despolimerasa siguiendo la reducción de la
viscosidad de las soluciones de desoxirribonucleato de sodio. El nucleado y la enzima se
mezclaron en el viscosímetro y las mediciones de viscosidad se realizaron a intervalos durante
la incubación a 30 ° C. En el presente estudio, este método se utilizó en la medición de la
actividad de la despolimerasa, excepto que la incubación se llevó a cabo a 37 ° C. y, además de
la reducción de la viscosidad, la acción de la enzima se ensayó adicionalmente mediante la
disminución progresiva de la precipitabilidad ácida del nucleado durante la descomposición
enzimática.
El efecto del suero normal fresco de perro y conejo sobre la actividad de la sustancia
transformante se muestra en el siguiente experimento.
Los sueros obtenidos de un perro normal y un conejo normal se diluyeron con un volumen igual
de solución salina fisiológica. El suero diluido se dividió en tres porciones iguales. Una parte se
calentó a 65 ° C. durante 30 minutos, otro a 50 ° C. durante 30 minutos, y el tercero se usó sin
calefacción como control. Una preparación parcialmente purificada de material de
transformación que se había secado previamente en el aparato liofilizado se disolvió en solución
salina a una concentración de 3,7 kg. por cc. 1.0 cc. de esta solución se mezcló con 0,5 cc. de las
diversas muestras de sueros diluidos calentados y no calentados, y las mezclas a pH 7,4 se
incubaron a 37 ° C. por 2 horas. Después de que se permitió que el suero actuara sobre el
material transformante durante este período, todos los tubos se calentaron a 65 ° C. durante 30
minutos para detener la acción enzimática. Luego se realizaron diluciones en serie en solución
salina y se analizaron por triplicado para la actividad de transformación de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Método de titulación. Los resultados dados en la Tabla III ilustran
la inactivación térmica diferencial de las enzimas en suero de perro y conejo que destruyen el
principio de transformación.
A partir de los datos presentados en la Tabla III, es evidente que tanto el suero de perro como
el de conejo en estado no calentado son capaces de destruir completamente la actividad
transformante. Por otro lado, cuando las muestras de suero de perro que se han calentado a 60
° C. o a 65 ° C. durante 30 minutos se utilizan, no hay pérdida de la actividad de transformación.
Por lo tanto, en esta especie la enzima del suero responsable de la destrucción del principio de
transformación está completamente inactivada a 60 ° C. En contraste con estos resultados, la
exposición a 65 ° C. durante 30 minutos se requirió la destrucción completa de la enzima
correspondiente en suero de conejo.
Las mismas muestras de suero de perro y conejo usadas en el experimento anterior también se
probaron para su actividad de despolimerasa en una preparación de desoxirribonucleato sódico
aislado por Mirsky de esperma de sábalo.
 TRANSFORMACIÓN DE TIPOS NEUMOCÓFICOS

Una solución altamente viscosa del nucleado en agua destilada en una concentración de 1 rag.
por cc. se utilizó. 1.0 cc. cantidades de sueros calentados y no calentados diluidos en solución
salina como se muestra en el protocolo anterior se mezclaron en viscosímetros Ostwald con 4,0
cc.
Los resultados de este experimento se presentan gráficamente en el Cuadro 1. En el caso del
suero no calentado tanto de perros como de conejos, la viscosidad cayó a la del agua en 5 a 7
horas. El suero de perro calentado a 60 ° C durante 30 minutos no produjo una reducción
significativa de la viscosidad después de 22 horas. En la otra banda, calentando el suero de
conejo a 50 ° C. simplemente redujo la velocidad de acción de la despolimerasa, y después de
24 horas la viscosidad se llevó al mismo nivel que con el suero no calentado. El calentamiento a
65ºC, sin embargo, eliminó por completo la despolimerasa de suero de conejo.
Así, en el caso de los sueros de perros y de conejos, existe un paralelismo entre la temperatura
de inactivación de la despolimerasa y la de la enzima que destruye la actividad del principio de
transformación. El hecho de que esta diferencia en la temperatura de inactivación no sea
simplemente una propiedad general de todas las enzimas en los sueros es evidente a partir de
experimentos sobre la inactivación térmica de la tributirin esterasa en las muestras de suero. En
el último caso, los resultados son los contrarios a los observados con la despolimerasa ya que la
esterasa de suero de conejo se inactiva casi completamente a 60ºC, mientras que la del suero
de perro solo se ve ligeramente afectada por la exposición a esta temperatura.
De varias sustancias probadas por su capacidad para inhibir la acción de la enzima conocida por
destruir el principio de transformación, solo se ha encontrado que el fluoruro de sodio tiene un
efecto inhibidor significativo. Independientemente de si esta enzima se deriva de las células
neumocócicas, la mucosa intestinal del perro, la pancreatina o los sueros normales, su actividad
es inhibida por el fluoruro. De forma similar, se ha encontrado que el fluoruro en la misma
concentración también inhibe la despolimerización enzimática del ácido desoxirribonucleico.
El hecho de que la actividad transformante sea destruida solo por las preparaciones que
contienen depolimerasa para ácido desoxirribonucleico y el hecho adicional de que en ambas
instancias las enzimas involucradas son inactivadas a la misma temperatura e inhibidas por
fluoruro proporcionan evidencia adicional de la creencia de que el principio activo es un nucleico
ácido del tipo desoxirribosa.
Análisis serológico. En el curso del aislamiento químico del material activo, se descubrió que a
medida que se purificaban los extractos crudos, su actividad serológica en el antisuero de Tipo
III disminuía progresivamente sin una pérdida correspondiente en la actividad biológica. Las
soluciones de la sustancia altamente purificada dieron solo ligeras reacciones de trazas en las
pruebas de precipitina con suero de conejo antipneumococo de tipo III de alto título. 4 Es bien
sabido que la proteína neumocócica puede detectarse mediante métodos serológicos en
diluciones tan altas como 1: 50,000 y el polisacárido capsular así como el somático en diluciones
de al menos 1: 5,000,000.
A la vista de estos hechos, la pérdida de reactividad serológica indica que estos constituyentes
celulares se han eliminado casi por completo de las preparaciones finales.
El hecho de que la sustancia transformante en estado purificado muestre poca o ninguna
reactividad serológica contrasta notablemente con su especificidad biológica al inducir la
transformación neumocócica.
Estudios fisicoquímicos): se examinó una preparación purificada y activa de la sustancia
transformante (preparación 44) en la ultracentrigrafía analítica.
El material dio un límite único e inusualmente nítido que indica que la sustancia era homogénea
y que las moléculas eran de tamaño uniforme y muy asimétricas. Se encontró que la actividad
biológica se sedimentó a la misma velocidad que el límite observado ópticamente, lo que
demuestra que la actividad no podría deberse a la presencia de una entidad de tamaño muy
diferente. El peso molecular no se puede determinar con precisión hasta que se hayan realizado
mediciones de la constante de difusión y del volumen específico parcial. Sin embargo, Tennent
y Vilbrandt han determinado la constante de difusión de varias preparaciones de ácido nucleico
de timo, cuya velocidad de sedimentación está en total acuerdo con los valores observados en
el presente estudio.
Suponiendo que la asimetría de las moléculas es la misma en ambos casos, se estima que el peso
molecular de la preparación neumocócica es del orden de 500,000. El examen de la misma
preparación activa se llevó a cabo mediante electroforesis en el aparato Tiselius y reveló solo un
único componente electroforético de movilidad relativamente alta comparable al de un ácido
nucleico. La actividad de transformación se asoció con el componente de movimiento rápido
que proporciona el límite ópticamente visible. Por lo tanto, tanto en el campo eléctrico como en
el centrífugo, el comportamiento de la sustancia purificada es coherente con el concepto de que
la actividad biológica es una propiedad del ácido nucleico altamente polimerizado.
Las curvas de absorción ultravioleta mostraron máximos en la región de 2600 / ~ y mínimos en
la región de 2350 A . Estos hallazgos son característicos de los ácidos nucleicos.
Determinación de la Ley Biológica. - En su estado altamente purificado, se ha encontrado que
el material aislado puede inducir transformación en cantidades que varían de 0.02 a 0.003 / ug.
La preparación s 44, cuya purificación se llevó a cabo a baja temperatura y que tenía una relación
nitrógeno-fósforo de 1,58, exhibió una alta actividad de transformación. Valoración de la
actividad de esta preparación se da en la Tabla IV.

Una solución que contiene 0.5 rag. por cc. se diluyó en serie como se muestra en el protocolo
0,2 cc. de cada una de estas diluciones se añadió a tubos cuadruplicados que contenían 2,0 cc.
de caldo de suero estándar. Todos los tubos fueron inoculados con 0.05 ec. de una dilución de
10-4 de cultivo de caldo de sangre de 5 a 8 horas de R36A. La actividad de transformación se
determinó mediante el procedimiento descrito en Método de titulación.
Los datos presentados en la Tabla IV muestran que sobre la base del peso seco 0.003 u g. del
material activo provocó la transformación. Dado que el sistema de reacción contiene el 0.003
ug. tiene un volumen de 2.25 cc., esto representa una concentración final de la sustancia
purificada de 1 parte en 600,000,000.
DISCUSIÓN

El presente estudio trata de los resultados de un intento de determinar la naturaleza química de

la sustancia que induce la transformación específica de los tipos de neumococos. Se ha aislado
una fracción de ácido desoxirribonucleico a partir de neumoecología Tipo III que es capaz de
transformar variantes R no encapsuladas derivadas de Pneumococcus Tipo II en células Tipo III
completamente encapsuladas.
Thompson y Dubos aislaron del neumococo un ácido nucleico de tipo ribosa. Hasta donde los
autores saben, sin embargo, un ácido nucleico del tipo desoxirribosa no se ha recuperado hasta
ahora de los neumococos ni se ha inducido experimentalmente una transformación específica
in vitro por una sustancia definida químicamente.
Aunque las observaciones se limitan a un único ejemplo, adquieren una mayor significación a
partir del trabajo de investigadores anteriores que demostraron la interconversión de varios
tipos de neumococos y mostraron que la especificidad de los cambios inducidos está en cada
caso determinada por el tipo particular de células encapsuladas utilizadas para evocar la
reacción. Desde el punto de vista del fenómeno en general, por lo tanto, es de especial interés
que en el ejemplo estudiado, el material altamente purificado y libre de proteínas que consiste
en gran medida, si no exclusivamente, de ácido desoxirribonucleico es capaz de estimular
variantes R no encapsuladas de neumococo. Tipo II para producir un polisacárido capsular
idéntico en especificidad de tipo con el de las células a partir de las cuales se aisló la sustancia
inductora. Igualmente llamativo es el hecho de que la sustancia que evoca la reacción y la
sustancia capsular producida en respuesta a ella son químicamente distintas, cada una
perteneciente a una clase totalmente diferente de compuestos químicos.
La sustancia inductora, en base a sus propiedades químicas y físicas, parece ser una forma
altamente polimerizada y viscosa de desoxirribonucleato de sodio. Por otro lado, la sustancia
capsular de Tipo III, cuya síntesis es evocada por este agente transformante, consiste
principalmente en un polisacárido no nitrogenado constituido por unidades de ácido
glucurónico-glucurónico unidas en una unión glicosídica. La presencia de la cápsula recién
formada que contiene este polisacárido específico de tipo confiere a las células transformadas
todas las características diferenciadoras de Pneumococcus Tipo HI. Por lo tanto, es evidente que
la sustancia inductora y la sustancia producida a su vez son químicamente distintas y
biológicamente específicas en su acción y que ambas son necesarias para determinar la
especificidad de tipo de la célula de la que forman parte.
Los datos experimentales presentados en este documento sugieren fuertemente que los ácidos
nucleicos, al menos aquellos del tipo desoxirribosa, poseen diferentes especificidades como se
evidencia por la acción selectiva del principio transformante. De hecho, la posibilidad de la
existencia de diferencias específicas en el comportamiento biológico de los ácidos nucleicos se
ha sugerido previamente, pero nunca se ha demostrado experimentalmente debido en parte al
menos a la falta de métodos biológicos adecuados.
Las técnicas utilizadas en el estudio de la transformación parecen proporcionar un medio
sensible para probar la validez de esta hipótesis, y los resultados obtenidos hasta el momento
añaden evidencia de apoyo a favor de este punto de vista. Si finalmente se demuestra más allá
de toda duda razonable que la actividad transformadora del material descrito es en realidad una
propiedad inherente del ácido nucleico, todavía se debe tener en cuenta una base química para
la especificidad biológica de su acción. A primera vista, los métodos inmunológicos parecen
ofrecer el medio ideal para determinar la especificidad diferencial de este grupo de sustancias
biológicamente importantes. Aunque se han definido las unidades constituyentes y el patrón
general de la molécula de ácido nucleico, todavía se conoce relativamente poco sobre el posible
efecto que las diferencias sutiles en la configuración molecular pueden ejercer sobre la
especificidad biológica de estas sustancias. Sin embargo, dado que no se sabe que los ácidos
nucleicos libres o combinados con histonas o protaminas funcionen antigénicamente, no se
anticiparía que tales diferencias se revelarían mediante técnicas inmunológicas. En
consecuencia, tal vez no sea sorprendente que las preparaciones de ácido desoxirribonucleico
altamente purificadas y sin proteínas, aunque extremadamente activas en la inducción de la
transformación, mostraran solo ligeras reacciones de trazas en pruebas de precipitina con
potentes sueros de conejo antipneumococo Tipo III.
A partir de estas observaciones limitadas, sería imprudente sacar alguna conclusión sobre la
importancia inmunológica de los ácidos nucleicos hasta que se disponga de más información
sobre esta fase del problema. Recientes observaciones de Lackrnan y sus colaboradores han
demostrado que los ácidos nucleicos de tipo levadura y timo derivados de estreptococos
hemolíticos y de origen animal y vegetal precipitan con ciertos sueros antineumocócicos. Las
reacciones variaron con diferentes lotes de suero inmune y se produjeron con mayor frecuencia
en suero de caballo antineumocócico que en sueros correspondientes de conejos inmunes.
La irregularidad y las amplias reacciones cruzadas encontradas llevaron a estos investigadores a
expresar algunas dudas sobre el significado inmunológico de los resultados. A menos que se
puedan idear métodos inmunoquímicos especiales similares a los que se utilizaron con éxito
para demostrar la especificidad serológica de sustancias no antigénicas simples, parece que las
técnicas empleadas en el estudio de la transformación son las únicas disponibles en la actualidad
para probar posibles diferencias en el comportamiento de los ácidos nucleicos.
Hay que admitir que hay muchas fases del problema de la transformación que requieren mayor
estudio y muchas preguntas que siguen sin respuesta, en gran parte debido a las dificultades
técnicas. Por ejemplo, sería interesante conocer la relación entre la velocidad de reacción y la
concentración de la sustancia transformante; la proporción de células transformadas a las que
no se ven afectadas en el sistema de reacción. Sin embargo, desde un punto de vista
bacteriológico, las estimaciones numéricas basadas en los recuentos de colonias podrían ser más
engañosas que esclarecedoras debido a la agregación y sedimentación de los cebos R glutinados
por el antisuero en el medio. Los intentos de inducir transformación en suspensiones de celestes
en reposo mantenidos en condiciones que inhiben el crecimiento y la multiplicación hasta ahora
han resultado infructuosos, y parece probable que la transformación se produzca solo durante
la reproducción activa de las células. Importante a este respecto es el hecho de que los cielos R,
así como aquellos que han sufrido transformación, presumiblemente también todas las otras
variantes y tipos de neumococos, contienen una enzima intracelular que se libera durante la
autolisis y en estado libre es capaz de destruyendo completamente la actividad del agente
transformador. Por lo tanto, parece que durante la fase logarítmica de crecimiento cuando la
división celular es más activa y la autólisis menos aparente, las condiciones culturales son
óptimas para mantener el equilibrio entre la reactividad máxima de la célula R y la destrucción
mínima del agente transformante a través de la liberación de fermentos autolíticos.
En el estado actual del conocimiento, cualquier interpretación del mecanismo involucrado en la
transformación debe necesariamente ser puramente teórica. Los eventos bioquímicos que
subyacen al fenómeno sugieren que el principio de transformación interactúa con la célula R
dando lugar a una serie coordinada de reacciones enzimáticas que culminan en la síntesis del
antígeno capsular de Tipo III.
Los hallazgos experimentales han demostrado claramente que las alteraciones inducidas no son
cambios aleatorios, sino que son predecibles, correspondiendo siempre en especificidad de tipo
al de las células encapsuladas a partir de las cuales se aisló la sustancia transformante. Una vez
que ha ocurrido la transformación, las características recién adquiridas se transmiten a
continuación en serie a través de innumerables transferencias en medios artificiales sin ninguna
adición adicional del agente transformante.
Además, a partir de las propias células transformadas, una sustancia de actividad idéntica puede
recuperarse nuevamente en cantidades muy superiores a las originalmente añadidas para
inducir el cambio. Es evidente, por lo tanto, que no solo se reproduce el material capsular en
generaciones sucesivas, sino que el factor primario, que controla la aparición y especificidad del
desarrollo capsular, también se reduplica en las células hijas. Los cambios inducidos no son
modificaciones temporales sino alteraciones permanentes que persisten siempre que las
condiciones culturales sean favorables para el mantenimiento de la formación de cápsulas. Las
células transformadas pueden distinguirse fácilmente de las formas originales R no solo por
reacciones serológicas, sino por la presencia de una cápsula nueva y visible que es la unidad
inmunológica de especificidad de tipo y la estructura accesoria esencial para determinar la
capacidad infectiva del microorganismo en el cuerpo del animal.
Es particularmente significativo en el caso de los neumococos que las alteraciones inducidas
experimentalmente se correlacionan definitivamente con el desarrollo de una nueva estructura
morfológica y la consecuente adquisición de nuevas propiedades antigénicas e invasivas.
Igualmente, si no más significativo, es el hecho de que estos cambios son predecibles,
específicos de tipo y heredables.
Varias hipótesis se han avanzado en la explicación de la naturaleza de los cambios inducidos. En
su descripción original del fenómeno, Griffith sugirió que las bacterias muertas en el inóculo
pueden proporcionar alguna proteína específica que sirva como un "pabulum" y permite a la
forma R fabricar un carbohidrato capsular.
Más recientemente, el fenómeno ha sido interpretado desde un punto de vista genético. La
sustancia inductora se ha comparado con un gen, y el antígeno capsular que se produce en
respuesta a él se ha considerado como un producto génico. Al discutir el fenómeno de la
transformación, Dobzhansky ha afirmado que "si esta transformación se describe como una
mutación genética -y es difícil evitarla, por lo que la describimos- estamos tratando con casos
auténticos de inducción de mutaciones específicas mediante tratamientos específicos ...".
"Stanley ha sugerido otra interpretación del fenómeno que ha dibujado la analogía entre la
actividad del agente transformante
y el de un virus. Por otro lado, Murphy ha comparado los agentes causantes de los tumores
avícolas con el principio transformador de Pneumococcus.
Él ha sugerido que estos dos grupos de agentes se denominen "mutágenos transmisibles" para
diferenciarlos del grupo de virus. Cualquiera que sea la interpretación correcta, estas diferencias
en el punto de vista indican las implicaciones del fenómeno de transformación en relación con
problemas similares en los campos de la genética, la virología y la investigación del cáncer.
Por supuesto, es posible que la actividad biológica de la sustancia descrita no sea una propiedad
inherente del ácido nucleico, sino que se deba a cantidades diminutas de alguna otra sustancia
adsorbida a la misma o tan íntimamente asociada a ella como para escapar de la detección. Sin
embargo, si la sustancia biológicamente activa aislada en forma altamente purificada como la
sal de sodio del ácido desoxirribonucleico demuestra ser el principio transformante, como la
evidencia disponible sugiere fuertemente, entonces los ácidos nucleicos de este tipo deben
considerarse no solo como estructuralmente importantes, sino también como funcionalmente
activo para determinar las actividades bioquímicas y las características específicas de los cielos
neumocócicos. Suponiendo que el desoxirribonucleato sódico y el principio activo son una y la
misma sustancia, entonces la transformación descrita representa un cambio químicamente
inducido y específicamente dirigido por un compuesto químico conocido. Si se confirman los
resultados del presente estudio sobre la naturaleza química del principio de transformación, se
debe considerar que los ácidos nucleicos poseen especificidad biológica cuya base química aún
no está determinada.
RESUMEN
I. A partir de neumococos tipo III se ha aislado una fracción biológicamente activa en una forma
altamente artificial que en cantidades extremadamente pequeñas es capaz en condiciones
culturales apropiadas de inducir la transformación de variantes R no encapsuladas de
neumococo tipo II en células completamente encapsuladas del mismo tipo específico la de los
microorganismos muertos por calor de los que se recuperó el material inductor.
2. Se describen los métodos para el aislamiento y la purificación del material transformante
activo.
3. Los datos obtenidos por análisis químicos, enzimáticos y serológicos junto con los resultados
de estudios preliminares por electroforesis, ultracentrifugación y espectroscopia ultravioleta
indican que, dentro de los límites de los métodos, la fracción activa no contiene proteína
demostrable, lípidos no unidos, o polisacárido serológicamente reactivo y consiste
principalmente, si no exclusivamente, en una forma altamente polimerizada y viscosa de ácido
desoxirribonucleico.
4. Se presenta evidencia de que las alteraciones inducidas químicamente en la estructura y
función celular son predecibles, tipo-específicas y transmisibles en serie. Se revisan las diversas
hipótesis que se han avanzado sobre la naturaleza de estos cambios.

CONCLUSIÓN
La evidencia presentada respalda la creencia de que un ácido nucleico del tipo desoxirribosa es
la unidad fundamental del principio transformante de Pneumococcus Tipo III.