CULTIVO DE MICROORGANISMOS

I. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden ser:

1) Medios Líquidos

Se preparan todos los constituyentes en una disolución acuosa (agua

destilada). Una vez disueltos, se reparten en matraces o tubos de ensayo que
tapamos y esterilizamos con calor.

2) Medios Sólidos

Hacemos lo mismo que para los medios líquidos, pero, al disolver en agua
destilada, añadimos de 15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos
en placas petri cuando está a unos 60º. Cuando alcance los 50º, ya será sólido.

3) Medios Semisólidos

Su apariencia es de gel. Sólo llevan 5 g/l de agar.

II. CULTIVO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS ESTRICTOS

En placas petri sobre medios sólidos. La superficie del medio de cultivo está en
contacto con el oxígeno atmosférico, luego no hay ningún problema para
cultivar este tipo de microorganismos.

En medio líquido, el microorganismo crece en la disolución, donde la

concentración de oxígeno es menor, y disminuye en función del crecimiento del
microorganismo. Para evitar esa disminución de oxígeno, utilizamos dos
recursos:

 Agitación

 Adición de aire u O2 estéril mediante burbujeo

III. CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS ESTRICTOS

En medio líquido, añadimos al medio de cultivo agentes reductores que toman

el O2 disuelto en el agua y forman H2o. Estos agentes son cisteína o
tioglicolato, por ejemplo. Otra manera es bombeando CO2 o N2 libre de 02 al
medio, mediante burbujeo.
En medio sólido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas-Pak. Su
tamaño es similar al de un termo. En su interior se colocan las placas petri
invertidas. El recipiente se cierra con una tapa hermética. En la parte inferior
hay un catalizador de paladio. Para conseguir la anaerobiosis, introducimos
sobres de anaerobiosis, que contienen NaCO3 y borohidruro de sodio. Al
añadir agua al sobre, se libera H2 y CO2. El oxígeno presente se reduce a
agua. Para verificar la anaerobiosis hay un indicador, que consiste en una tira
de papel impregnada con azul de metileno. En condiciones aeróbicas, la tira es
azul, pero sino, es transparente. En la tapa hay un manómetro con el que
medimos la presión interna, ya que se están desprendiendo CO2 y H2.

MEDIOS DE CULTIVO

En función de su composición, distinguimos dos grupos de medios de cultivo:

 Medios sintéticos o definidos: Son aquellos que contienen cantidades

precisas de sustancias orgánicas e inorgánicas puras disueltas en agua
destilada.

 Medios complejos o indefinidos: Contienen sustancias altamente

nutritivas, pero de composición indefinida. Suelen llevar sustancias como
extractos de carne, peptona, extractos de levadura, bovril... La ventaja
de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de
crecimiento, por lo que podemos cultivar en él gran número de
microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que el
microorganismo está consumiendo. Ejemplos:

Caldo nutritivo: extracto de carne + peptona + agua

Agar nutritivo: extracto de carne + peptona + agua + agar.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Medios Enriquecidos

Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de

cultivo normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente
nutritivas como sangre, suero, extractos de tejidos animales... Estos medios
son los medios enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos son
microorganismos exigentes o fastidiosos. Ejemplo: agar-sangre.

Medios Selectivos

Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un

determinado tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal
violeta inhibe las gram +. Otra manera es modificar la fuente de carbono; si
sustituímos la glucosa por maltosa, seleccionamos aquellos microorganismos
capaces de digerirla.
Medios Diferenciales

Contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que

determinados microorganismos adquiere coloraciones específicas o reaccionan
de una manera determinada.

Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno)

que nos permiten diferenciar a las colonias que viven en el medio. Escherichia
coli forma colonias de color verde claro, mientras que enterobacter forma
colonias de color rosa salmón.

Medios Selectivos Y Diferenciales

Ejemplo: Agar Mclonkey tiene cristal violeta y sales biliares. Es un medio

específico para enterobacterias. Cristal violeta inhibe a las gram +. Las sales
biliares hace que sólo se desarrollen las gram - que puedan tolerar estas sales;
las enterobacterias. El indicador es el rojo neutro, que es rojo a pH ácido e
incoloro a pH básico. Como fuente de carbono se utilizan peptona y lactosa.

Se usa para detectar E. Coli y Salmonella. E. Coli es tolerante a la lactosa. Al

digerirla, libera ácidos, por lo que se crea un medio ácido y el indicador se pone
rojo. Salmonella no tolera la lactosa, por lo que no formará ácidos y formará
colonias incoloras.

CULTIVOS PUROS: MEDIOS DE OBTENCIÓN

Los microorganismos en estado natural crecen de forma heterogénea o mixta.

Cuando queremos estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo.

Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. El modo

de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen
de una sola célula (son clones). Hay diferentes métodos para obtenerlas:

1) Método De Siembra Por Agotamiento o En Estría

Necesitamos:

 Placa petri con medio de cultivo

 Muestra (sólida o líquida)

 Asa de siembra de platino

Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa.

Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensión
anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos
a extender parte de la segunda extensión en otra dirección. Esterilizamos y
repetimos la operación.
Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de
células. En la segunda, parte de la primera zona estará mejor extendida, y en la
tercera y en la 4ª mejor aún.

Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un

cultivo puro.

2) Método De Las Diluciones Sucesivas

Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras
inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas. Metodología:

Ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con
medio de cultivo. Con un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa,
e incubams a 37 ºC durante 24 horas.

En la primera dilución habrá un amasijo de colonias. En la siguiente habrá diez

veces menos número de colonias, y así sucesivamente hasta conseguir
colonias aisladas.

Este método nos permite calcular el número de microorganismos viables que

existen en la muestra que estamos analizando:

N=C · 1/D · 1/i donde:

N es el número de microorganismos presentes en la muestra

C es el número de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias)

D es la dilución

I es el inóculo

Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede

tratarse de una contaminación) y, si hay más, no están aisladas.

TÉCNICA DEL CULTIVO POR ENRIQUECIMIENTO

Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el

microorganismo que nos interesa aislar. Ejemplo: Nos interesa aislar bacterias
fotoautótrofas. Tomamos un matraz con agua y sales y lo incubamos a la luz,
de manera que crezcan las bacterias fotoautótrofas.

Ejemplo 2: Queremos aislar bacterias quimiolitótrofas del azufre; ponemos

azufre, CO2 como fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la
oscuridad para eliminar fotoautótrofos.

Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37º, mientras
que para incubar otra enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45º.
CONSERVACIÓN DE CULTIVOS PUROS

1) Almacenamiento A Temperaturas Bajas

Ponemos las bacterias con glicerol al 20 - 50% a -70º y podemos mantenerlas

así durante años, décadas...

2) Liofilización

Es un método más eficaz. En un vial de liofilización ponemos leche desnatada

y las bacterias, lo congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al
proceso de liofilización.

La liofilización es una evaporación por condensación. Se basa en el punto triple

del agua; podemos pasar de sólido a gas. El agua se evapora y queda un
polvillo formado por la leche y las bacterias. Cerramos el bote y podemos
almacenar el cultivo durante décadas.

COLECCIONES DE CULTIVO

En todos los países hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones

de cultivos puros o tipo. En España existe la C.E.C.T (Colección española de
cultivos tipo), que está en Valencia. La más grande del mundo es la americana,
A.T.C.C. (American type cultive collection).