PROTOCOLO PARA ANALIZIS DE MUESTRAS POR PCR QUE INCLUYE

ELECTROFOREZIS – PARA PECES SALMONIDOS.

Recolección de planificación del

muestra muestreo

Antes de proceder ala extracción del ADN se debe

Componentes tomar la muestra de tejido conservada en etanol.
• ADN
• Primers Estandarización de la muestra Extracción del ADN – fragmento
• Nucleotidos
trifostato. Técnica –PCR
• Ion de magnesio Etapa de Etapa final de
• Enzima Taq Desnaturalización Etapa de cebado polimerización
polimerasa
• Cebadores Incubación La temperatura de incubacion en el se incuba en el
• Mix bufer Tº 94 - 96cº termociclador de la muestra se termociclador durante
• Pcr tubos Desnaturalización en disminuye asta los 50-65 cº y se 30 s a 1 minuto. A 72
• Termociclador el termociclador incuba en ese periodo de tiempo de Cº que es la tº optima
• Micropipetas 30 s a 1 minuto, en estas para que actue la
condiciones los cebadores se unen enzima taq polimeraza
Componentes alos extremos de fragmento de ,que se extiende alos
• Microondas ADN amplificado, y solo se unen extremos de los
• Agarosa cuando el fragmento de ADN cebadores y sintetize
• dodecilsulfato especifico para esos primer estan asi nuevas cadenas de
sódico (SDS). presente en la muestra , se llama ADN copias el
• TEMED’- esta etapa de cebado. resultado se obtiene
tetrametil- una molecula de ADN
etilenodiamina) copia por cada
• persulfato molecula de adn
amónico Una ves que a finalizado la reacción de PCR original . El ciclo se
• Guantes recuperamos la muestra del termociclador y analizamos repite casi 30 -35 veces
• Micropipetas los resultados en electroforesis en gel de agarosa. dura casi 24 h .
• Cubeta con
fuente de poder Técnica electroforesis
• Tampon agar
• Tampon tbe Pesar la agarosa ,mesclando con el Preparación del gel concentrador se situa en la parte
• Bromuro de tampón tbe en un matras para ser superior y su función es concentrar las proteínas
llevado al microondas para ser antes de su separación colocando el peine para dar
etidio
calentado para que este transparente forma los posillos para cargar las muestras de esta
• Plataforma se deja enfriar por mientras se forma el sistema discontinuo esta formado con el gel
base para prepara el molde concentrador en la parte superior y el gel separador
montar los en la parte de abajo se citua el gel en los soportes
cristales donde se permite figarlo ala cubeta de electroforesis
• Peines Primero se prepara el gel separador las proporciones de los componentes cambian para
• Soporte para ,añadiendo agua destilada ,luego el generar un tamaño de polo mayor el ph se reduce a
tampón del gel separador con ph 8,8 6,8. se mezcla agua destilada, acrilamida /bis al 30%
montar cristales
,mescla de acrilamida /bis-acrilamida ,sds al 10 % ,tampón concentrador, persulfato de
cuando estén al 30% se añade el sds ,la amonio , temed , se situa en la parte superior luego
los geles polimerización del gel se inicia se coloca el peine que da una forma de posillos
• Caja de añadiendo persulfato amónico y por donde se cargaran las muestras Acontinuacion se
electroforesis ultimo reactivo de temed , llena el resto con la solución buffer .
con un catodo y completando la polimerización agitarse Cada muestra se coloca en los posillos formados por
anodo bien para su homogenización para ser el gel ,concluido la separación se tiñe el con un
• Agua añadido alos cristales que soportan la colorante bromuro etilio para visualizar los
• policradamida plataforma base . fragmentos se coloca en la maquina captadora de
• Bufer ph 8,8-6,8 imágenes por rayos de luz uv donde se observa la
• solucion sds al migración de las proteínas .
10%
• Captador de
imágenes