Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12

A Richards et al

Estimación de sólidos de cacao sin grasa en chocolate y

productos de cacao - Encuesta mundial de concentraciones
típicas de teobromina y cafeína
Determinado por HPLC
Alan Richards ( 1) (2) y Brian Wailes ( 2)

1 Jefe de Servicios Científicos, Public Analyst Scientific Services Ltd, Wolverhampton WV6 8TQ.

2 Anteriormente en Durham Scientific Services, St Johns Road, Meadowfield, Co. Durham.

Resumen

Se describe un método para la medición de los alcaloides teobromina y cafeína en productos de cacao y chocolate. El método se sometió a una
prueba en anillo con 5 laboratorios de toda Europa. El método implicó una preparación mínima de la muestra y el análisis de los alcaloides fue por
HPLC-DAD. El método se utilizó para determinar los sólidos secos de cacao sin grasa en 191 muestras de licor de cacao de todo el mundo. El
contenido medio de teobromina y cafeína en las muestras de licor de cacao seco sin grasa analizadas por este método fue de 24.572 mg / kg y 3.165
mg / kg, respectivamente. Los detalles completos del proyecto se pueden obtener en el sitio web de UK Defra, código de proyecto FA 0202 "Medición
del contenido de teobromina en el cacao para determinar el contenido de sólidos de cacao en chocolate y productos de chocolate" .

Palabras clave

Teobromina, cafeína, cacao, chocolate, HPLC.

Introducción

Los productos de cacao y chocolate comprenden una industria de varios millones de libras en el Reino Unido y en toda Europa. En Europa se consume más
chocolate que en cualquier otro continente. La cantidad de cacao presente en los productos de chocolate generalmente se considera una guía de la calidad y se
ha intentado su cuantificación precisa durante más de 100 años.

El etiquetado y la composición de los productos de chocolate están controlados por el Reglamento de productos de cacao y chocolate (Inglaterra) de 2003. 1 que
implementan la Directiva de la CE 2000/36 / CE 2. Disposiciones idénticas para el etiquetado y la composición se incluyen en regulaciones paralelas en las
áreas descentralizadas del Reino Unido.Las regulaciones especifican una gama de descripciones reservadas para los productos de chocolate que tienen
requisitos mínimos para, Entre otros, niveles de sólidos de cacao presentes. Los alcaloides teobromina y cafeína están presentes de forma natural en el
cacao. Por lo tanto, el contenido de cacao seco sin grasa de los alimentos se ha estimado en los laboratorios de fabricación y aplicación 3 durante muchos
años mediante la determinación de estos alcaloides y la aplicación de un factor de conversión derivado del análisis de muestras de cacao genuino.

Con el tiempo, los métodos utilizados han cambiado y mejorado. La medición directa del contenido de alcaloides, teobromina y / o cafeína permite la
determinación del total de sólidos no grasos de cacao. En los últimos 50 años aproximadamente, se ha realizado poco trabajo sistemático para establecer
si el nivel de alcaloides ha cambiado como resultado de cambios botánicos y agrícolas, diferentes métodos de producción o factores ambientales, aunque
se reconoce que los cambios en los métodos de producción y el clima Los últimos 50 años probablemente han dado lugar a cambios significativos en los
niveles de alcaloides en el cacao. Para investigar qué cambios de importancia habían tenido lugar, la Agencia de Normas Alimentarias del Reino Unido
encargó un proyecto (proyecto FSA Q01122) 4 y los principales hallazgos reportados aquí. En esencia, se calculó un factor de conversión actualizado a
partir de 191 muestras de licor de cacao analizadas como parte de ese proyecto utilizando el método de prueba que se describe más adelante.

- 1-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

Todos los controles de calidad internos realizados durante la vida útil del proyecto fueron satisfactorios.

Definiciones

Chocolate: el producto obtenido a partir de productos de cacao y azúcares que contiene no menos del 35 por ciento de sólidos secos de cacao totales, incluyendo no
menos del 18 por ciento de manteca de cacao y no menos del 14 por ciento de sólidos secos de cacao no graso.

Granos de cacao: las semillas del árbol del cacao ( theobroma cacao) fermentado y seco

Licor de cacao (o masa): grano de cacao reducido a una pasta mediante un proceso mecánico sin perder nada de su contenido de grasa natural

Cocoa Nib: la parte del grano de cacao que queda después de tostar, romper y aventar los granos de cacao crudos.

Cacao en polvo o cacao: el producto obtenido por conversión en granos de cacao en polvo, limpios, pelados y tostados, y que contiene no
menos del 20 por ciento de manteca de cacao, calculado según el peso del extracto seco, y no más de 9 por ciento de agua

Chocolate con leche: el producto obtenido a partir de productos de cacao, azúcares y leche o productos lácteos que contienen:

• no menos del 20 por ciento del total de sólidos secos de cacao

• no menos del 20 por ciento de materia seca de leche obtenida por deshidratación total o parcial de leche entera, leche semidesnatada o desnatada,
nata o nata, mantequilla o grasa de leche parcial o totalmente deshidratada no menos del 2,5 por ciento de materia seca no grasa de cacao
•
• no menos del 5 por ciento de grasa láctea

• no menos del 25 por ciento de grasa total (manteca de cacao y grasa de leche)

Desarrollo de métodos y prueba de anillo

El primer objetivo fue optimizar el método de cromatografía líquida (CL) (Apéndice 1) para determinar teobromina y cafeína en productos de
cacao y chocolate, incluidos el chocolate para beber, el chocolate con leche, el chocolate natural y el chocolate. El método consiste en un
procedimiento simple y rápido para la extracción de alcaloides y análisis por HPLC con detección de matriz de diodos.

Seis muestras de licor de cacao fueron analizadas por teobromina y cafeína, o alcaloides totales por 5 laboratorios diferentes. Se pidió a todos los
participantes que analizaran cada muestra por duplicado y registraran la identidad de los analitos informados y las concentraciones, como mg / kg.
Los resultados se resumen en el Apéndice 2.

Encuesta de concentraciones de teobromina y cafeína

El método optimizado se aplicó luego a la determinación de las concentraciones de teobromina y cafeína, durante un período de dos años, de 191
muestras de licor de cacao, preparadas a partir de granos cultivados en todo el mundo. El período extendido de muestreo y análisis fue para tener en
cuenta las variaciones estacionales en las condiciones de cultivo y los posibles cambios naturales en los niveles de alcaloides. A partir de los datos
obtenidos es posible calcular un factor de conversión a partir de los niveles medios de teobromina y cafeína en el cacao, y compararlos con factores
previamente establecidos.

Los resultados mostraron que los niveles de teobromina presentes eran generalmente más bajos que los encontrados en trabajos de encuestas anteriores. Esto podría
deberse a una combinación de factores, como cambios en las variedades de cacao que se cultivan, p. Ej.

- 2-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

aumento del uso de variedades híbridas de cacao que son resistentes y de alto rendimiento, así como cambios en el clima y los métodos de cultivo.

Mientras que en el pasado los analistas probablemente medían los alcaloides totales con precisión, los tipos de muestras sometidas a prueba no se describían
claramente, es decir, las muestras se describían a menudo como "cacao" o "cacao en polvo". Esto significa que el contenido de alcaloides que se informa no puede
correlacionarse con los datos actuales. Los resultados actuales indican que el factor de conversión, calculado a partir del contenido de teobromina en las 191 muestras
de licor de cacao analizadas, es más alto que el factor utilizado actualmente por los laboratorios de control para calcular los sólidos secos de cacao sin grasa.

El contenido medio de teobromina de las muestras de licor de cacao analizadas fue de 27.737 mg / kg, lo que dio lugar a un factor de
conversión de 40,7. El factor de conversión multiplicado por el porcentaje de teobromina en la muestra da una indicación de sólidos secos de
cacao sin grasa en el alimento en cuestión. La desviación estándar de los resultados de 191 muestras fue de 3.470 mg / kg y el rango fue de
19803 - 39.168 mg / kg. Esta amplia variación indica que se debe tener una precaución considerable al informar sobre el contenido de cacao
de los alimentos cuando se desconoce la composición del licor de cacao utilizado en su preparación. Las organizaciones de aplicación
generalmente tendrán en cuenta la variación estadística de los resultados al informar sobre la composición obtenida del análisis de una
muestra.

Se realizó una comparación del contenido de sólidos de cacao calculado utilizando el nuevo factor de 40,7 y el factor actual de 35,9. Se encontró
que el factor actual dio resultados más bajos para los sólidos de cacao que con el factor recién calculado. El nuevo factor también arrojó resultados
más cercanos a la cantidad esperada que el factor de conversión actual, es decir, el cálculo de los niveles de cacao en las muestras controladas de
chocolate elaborado coincidieron en general mejor con las predicciones que utilizaron el nuevo factor que con el factor actual. Cuando se miden
alcaloides totales en lugar de teobromina sola, se propone un factor de 36,1.

La fabricación de chocolate se lleva a cabo mezclando ingredientes que incluyen licor de cacao, azúcar y aromas. En algunos casos se agrega cacao
en polvo, así como grasa de cacao adicional, sólidos lácteos o grasas vegetales. Para validar los resultados de las muestras de licor de cacao y
determinar la aptitud para el propósito de los nuevos factores calculados, se llevaron a cabo pruebas para medir los niveles de alcaloides y grasas en
veinte muestras tanto del licor de cacao como del chocolate terminado elaborado a partir de los licores. Los resultados del licor se utilizaron para
calcular la cantidad de cacao seco sin grasa presente en el chocolate. Estos resultados se compararon con las cantidades declaradas presentes. En
general, hubo un buen acuerdo entre las cantidades calculadas de licor de cacao presente y las cantidades declaradas reales.

Todos los controles de calidad internos realizados durante la vida útil del proyecto fueron satisfactorios

Se encontró que la humedad en las muestras de licor de cacao, medida mediante el análisis de Karl Fischer, era variable, por lo que se hicieron correcciones en los
niveles de alcaloides para tener en cuenta esto. También se midió el contenido de grasa de las mismas muestras de licor de cacao y se calcularon los niveles de
alcaloides en la parte seca sin grasa de las muestras.

Los detalles completos de la optimización del método, prueba del anillo, adquisición de muestras y datos analíticos obtenidos se dan en el Informe FSA . 3

Cálculo

La cantidad de cacao seco sin grasa en los productos de chocolate puede calcularse a partir del contenido de teobromina de la siguiente manera:

Cacao seco sin grasa (g / 100g) = teobromina (g / 100g) x 40,7

Cuando se miden los alcaloides totales, el contenido de cacao seco sin grasa puede calcularse a partir de:

Cacao seco sin grasa (g / 100g) = alcaloides totales (g / 100g) x 36,1

- 3-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

Los principales productores de cacao son actualmente los países de África. El plan de muestreo estuvo sesgado hacia muestras de cacao obtenidas de esta
fuente. Se encontró que el contenido de alcaloides de los licores de cacao varía en los diferentes continentes, de modo que cuando se conoce el país de origen
de la muestra, los factores alternativos específicos de la ubicación pueden ser más apropiados.

Agradecimientos

• ADM por el suministro de auténticas muestras de licor de cacao y participación en el ring trial. Alan Turner,
• consultor de la industria del chocolate, por brindar información histórica.
• Barry Callebaut por el suministro de auténticas muestras de licor de cacao, chocolate y participación en el ring trial.

• Cargil por el suministro de auténticas muestras de licor de cacao y participación en el ring trial. CIRAD por su asesoramiento sobre la

• interpretación de los resultados, especialmente en relación con los genotipos. Cocoa Research Association Ltd para obtener asesoramiento

• sobre detalles técnicos.

• Food Standards Agency (FSA) para la financiación de este proyecto, en particular Tanya Gurung. Departamento de Alimentación
• y Asuntos Rurales (Defra) por el permiso para publicar este trabajo.
• Michael Walker por su apoyo y comentarios constructivos sobre varias versiones de este documento.

El autor también quisiera agradecer a los revisores por sus comentarios, que fueron bienvenidos al publicar este artículo.

Referencias

1 Reglamento de 2003 sobre productos de cacao y chocolate (Inglaterra), SI 1659/2003

http://www.legislation.gov.uk/uksi/2003/1659/contents/made
2 Directiva 2000/36 / CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 23 de junio de 2000, relativa a los
productos de cacao y chocolate destinados al consumo humano
http: // eur-
lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2000:197:0019:0025:EN:PDF
3 Método de ejecución validado VEMS 0358 - Determinación de aditivos y aromatizantes en alimentos por
HPLC, publicación APA para uso interno
4 Proyecto FSA Q01122 Medición del contenido de teobromina en el cacao para determinar el contenido de sólidos de
cacao en chocolate y productos de chocolate. Este proyecto está publicado en el sitio web UK Defra, Código del
proyecto: FA0202

- 4-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

Apéndice 1

Medición de los alcaloides teobromina y

Cafeína en productos de cacao y chocolate

1. Alcance del método

1.1. Los alcaloides se extraen de productos de cacao y chocolate con ácido diluido. Después de la clarificación y filtración,
los alcaloides en la solución se determinan por HPLC. También se extraen una variedad de aditivos permitidos en los
productos de cacao y chocolate, que pueden interferir con el análisis de teobromina y cafeína, incluidos sacarina, ácido
benzoico, aspartamo, acesulfamo K, ácido sórbico, vainillina, etil vainillina y 3 parabenos.
los
La cromatografía se ha optimizado para separar cada uno de estos compuestos.

2. Salud y seguridad

2.1. NORMALMENTE SE DEBE USAR PROTECCIÓN PARA LOS OJOS EN TODO MOMENTO.

2.2. EL METANOL ES ALTAMENTE INFLAMABLE Y TÓXICO POR INHALACIÓN O SI SE INGIERE. MANTENER EL

CONTENEDOR BIEN CERRADO. EVITE EL CONTACTO CON LA PIEL. MANTENER ALEJADO DE FUENTES DE
IGNICIÓN. UTILICE ÚNICAMENTE EN UN ÁREA DESIGNADA SIN LLAMA.

2.3. EL ACETONITRILO ES ALTAMENTE INFLAMABLE Y TÓXICO POR INHALACIÓN, EN CONTACTO CON LA PIEL Y
POR INGESTIÓN. MANTENER ALEJADO DE FUENTES DE IGNICIÓN. QUITARSE INMEDIATAMENTE CUALQUIER
ROPA CONTAMINADA. SI SE SIENTE MAL, BUSQUE ASESORAMIENTO MÉDICO. UTILICE ÚNICAMENTE EN UN
ÁREA DESIGNADA SIN LLAMA.

2.4. LA CAFEÍNA ES TÓXICA SI SE INGIERE. EVITE EL CONTACTO CON LA PIEL Y LOS OJOS. SI SE SIENTE MAL,
BUSQUE ASESORAMIENTO MÉDICO.

3. Reactivos

Los reactivos de grado reactivo analítico son adecuados a menos que se indique lo contrario. El agua debe
estar desionizada, destilada o de calidad similar.

3.1. Ácido acético glacial

3.2. Fase móvil A: acetonitrilo, grado HPLC. Desgasificar y filtrar a través de un filtro de membrana de 0,45 µm (4.3)

3.3. Cafeína

3.4. Ácido clorhídrico, 11 mol / L

3.5. Metanol, grado HPLC

3.6. Hexacianoferrato de potasio (II) trihidrato

- 5-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

3.7. Ortofosfato de dihidrógeno de sodio

3.8. Hidróxido de sodio

3.9. Teobromina

3.10. Acetato de zinc dihidrato

3.11. Hidróxido de sodio - 0,1 mol / L - Pesar 4,0 g de hidróxido de sodio (3,8) y disolver en agua, dejar enfriar, diluir a 1 litro

3.12. Fase móvil B - tampón fosfato - Pesar con precisión 3,12 g de dihidrógeno ortofosfato sódico (3,7) y completar hasta 1
litro con agua en un matraz aforado. Ajustar a pH 5,0 con hidróxido de sodio 0,1 mol / L. Filtrar a través de un filtro de
0,45 µm (4.3)

3.13. Ácido clorhídrico - 0,5 mol / L - Añadir 44,5 ml de ácido clorhídrico (3.4) al agua y diluir a 1 litro en un matraz aforado.

3.14. Stock de cafeína estándar 1000 mg / L: pesa 0,5 g, con una precisión de 0,001 g de cafeína (3.3). Transferir
cuantitativamente a un matraz aforado de 500 ml con agua. Disolver en agua, diluir a volumen con agua y mezclar por
inversión 6 veces.

3.15. Stock de teobromina estándar 500 mg / L - Pesar 0,25 g, con una precisión de 0,001 g, de teobromina (3.9) en un vaso de precipitados
de 400 ml, disolver en agua hirviendo, enfriar y transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 500 ml con agua y mezclar por
inversión 6 veces.

3.16. Soluciones estándar de trabajo: utilice pipetas para medir 1,0, 2,5, 5,0 y 10,0 ml de estándar madre de cafeína y 2, 5, 10 y
20 ml de estándar madre de teobromina en matraces aforados de 100 ml, diluir a volumen con agua y mezclar por inversión
6 veces. Esto proporciona soluciones estándar de trabajo de concentraciones de 10, 25, 50 y 100 mg / L de cada alcaloide.
Las soluciones estándar de trabajo deben prepararse frescas el día de su uso.

3.17. Soluciones de control estándar de stock

EL MATERIAL ESTÁNDAR UTILIZADO PARA PREPARAR SOLUCIONES DE CONTROL ESTÁNDAR DEBE SER DE
UNA FUENTE COMERCIAL DIFERENTE A LAS UTILIZADAS PARA PREPARAR SOLUCIONES DE CALIBRACIÓN
ESTÁNDAR.

3.17.1. Cafeína 10.000 mg / L: pesa 0,5 g, con una precisión de 0,001 g de cafeína. Transferir cuantitativamente
a un matraz aforado de 50 ml con 20 ml de metanol y disolver. Diluir a volumen con agua y mezclar por
inversión 6 veces.

3.17.2. Teobromina 10,000 mg / L: pesa 0,5 g, con una precisión de 0,001 g de teobromina. Transferir
cuantitativamente a un matraz aforado de 50 ml con 20 ml de metanol y disolver. Diluir a volumen con agua y
mezclar por inversión 6 veces. La vida útil de estas soluciones es de 3 meses cuando se almacenan a 5 ° C.

3.18. Solución de control estándar de trabajo: con una pipeta, mida 2,5 ml de cada solución de control estándar madre en un
matraz aforado de 250 ml, diluya a volumen con agua y mezcle mediante inversión 6 veces. Esto da una solución de control
estándar de trabajo mezclada que contiene 100 mg / L de cada alcaloide. La solución de control estándar de trabajo debe
prepararse fresca el día de su uso.

- 6-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

3.19. Reactivos de limpieza 1 y 2

3.19.1. Disuelva 21,9 g, con una precisión de 0,1 g, de acetato de zinc dihidrato (3.10) en agua que contenga 3 g de ácido
acético (3.1) y complete hasta 100 ml con agua.

3.19.2. Disuelva 10,6 g, con una precisión de 0,1 g, hexacianoferrato de potasio (II) trihidrato (3,6) en agua y complete
hasta 100 ml con agua.

4. Aparato

Material y aparatos de vidrio de laboratorio normales

4.1. Balanza analítica de precisión adecuada según lo especificado

4.2. Filtros de jeringa desechables de 0,45 µm o kit de filtro de membrana de muestra de 0,45 µm (Millipore o equivalente)

4.3. Sistema de filtrado de disolvente con filtros de membrana de 0,45 µm

4.4. Baño ultrasónico

4.5. Sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) idealmente con detector de matriz de diodos y dispositivo de
integración que permite la medición de alturas y / o áreas de picos

4.6. Filtros de microfibra de vidrio, al menos 1,6 µm (Whatman GFA o equivalente)

4.7. Columna cromatográfica HPLC - Merck Lichrocart Purospher RP-18e, 5 µm, 250 x 4 mm, equipada con una columna de
protección Purospher RP-18e, 5 µm 4 x 4 mm. Se pueden utilizar columnas equivalentes siempre que den resoluciones
satisfactorias

4.7.1. Se encontró que las siguientes condiciones de HPLC eran adecuadas. Las condiciones se pueden modificar si es
necesario para lograr una resolución adecuada de cualquier aditivo y saborizante de interés.

Tiempo de gradiente (min) Fase móvil A (3,2) (%) Móvil Fase B (3,12) (%)

0 8.0 92,0
5,00 10.0 90,0
22,50 19,3 80,7
30,00 21,5 78,5
35,00 45,0 55,0
40,00 45,0 55,0
40.01 8.0 92,0
45,00 8.0 92,0

Tasa de flujo: 1.0 ml / min

Volumen de inyección: 5µL
Temperatura de la columna: 40 ° C
Longitudes de onda del detector: 205 nm para teobromina, sacarina, ácido benzoico, cafeína y aspartamo

231 nm para acesulfame K y sulfato de quinina 256 nm para

ácido sórbico y parabenos

- 7-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

Para ayudar a mantener la eficiencia de la columna, lávela con una mezcla de agua y acetonitrilo (aproximadamente 50:50) durante
aproximadamente 30 minutos antes de apagar el instrumento. El rendimiento de la columna se mantendrá mediante el uso de una columna de
protección.

5. Procedimiento

5.1. El chocolate y los productos de chocolate rallan, derriten o mezclan si es necesario.

5.1.1. Pese aproximadamente 1 g, con una precisión de 0,001 g, de chocolate amargo, 2-3 g de chocolate con leche o 3 g de pastel en un vaso de

precipitados de 100 ml.

5.1.2. Añada 25 ml de agua y 2 ml de ácido clorhídrico 0,5 mol / L (3.13) y mezcle mediante inversión 6 veces.

5.1.3. Llevar a ebullición en una placa calefactora y luego transferir el vaso a un baño de agua hirviendo durante 15 minutos.

5.1.4. Transferir la solución a un matraz aforado de 50 ml y dejar enfriar.

5.1.5. Añada 1 ml de cada reactivo aclarador (3.19), afore con agua y mezcle por inversión 6 veces.

5.1.6. Dejar reposar la solución durante unos 30 minutos y luego filtrar a través de un papel de filtro (4.6), rechazando los
primeros 5 ml y luego a través de un filtro de jeringa (4.3) para análisis por HPLC. La velocidad de filtración depende de la
cantidad de sólidos precipitados presentes. Las soluciones son estables durante al menos 24 horas.

5.2. Cromatografia

Configure el sistema HPLC (4.5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El instrumento debe estar equipado con una
columna adecuada (4.7). Las condiciones de funcionamiento deben ajustarse para lograr una separación suficiente de los
aditivos de interés para permitir la identificación. Las separaciones cromatográficas típicas se muestran en el Apéndice 3.

5.3. Inyecte un volumen adecuado, por ejemplo, 5 µl de la solución de prueba y realice la separación cromatográfica.

5.4. Determine las áreas de los picos (mediante integración electrónica) en las longitudes de onda adecuadas (consulte 4.7.1). Si no se dispone de un

detector de red de diodos, es posible que se requieran ejecuciones separadas en cada longitud de onda.

5.5. Elaboración de la curva de calibración.

5.5.1. Analice sucesivamente cada solución estándar de trabajo (3.16) de acuerdo con los pasos 5.3-
5.4.

5.5.2. Trace una curva de calibración de la concentración de analito frente al área del pico para cada analito de interés.

5.5.3. Cuando se preparan estándares de stock frescos, también se debe preparar una nueva curva de calibración.

- 8-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

5.6. Verificación de calibración.

5.6.1. Siempre que la curva de calibración sea lineal y las condiciones de HPLC permanezcan aparentemente inalteradas,
se puede usar una única solución estándar de trabajo de cada analito para verificar la curva de calibración.

5.6.2. Analice el estándar de trabajo 50 mg / L de acuerdo con los pasos 5.3 - 5.4. Realice una inyección duplicada
de la solución estándar de trabajo.

5.6.3. El estándar de verificación de calibración se considera satisfactorio si la concentración media está dentro de ± 5% del
valor esperado (es decir, 50 mg / L) cuando se extrapola del gráfico de calibración almacenado.

5.6.4. Si el estándar de verificación de calibración cumple con los requisitos, entonces el gráfico de calibración almacenado puede
usarse para calcular la concentración de analito. De lo contrario, se debe preparar un estándar de caldo fresco.

6. Cálculo

6.1. Si se utiliza una curva de calibración, determine la concentración (C) de cada analito en la solución de prueba directamente del
gráfico de calibración.

6.2. Si hay un detector de matriz de diodos disponible, la identidad de los picos de la muestra se puede confirmar si es necesario.

6.3. La concentración de cada analito en la muestra, expresada en mg / L o mg / kg, puede calcularse de acuerdo con la
siguiente fórmula:

Analito en la muestra (mg / L o mg / kg) =

dónde C= concentración en mg / L del componente analito del volumen final del gráfico, en ml
V= de solución de prueba
m= masa (o volumen), en g (o ml) de la porción de prueba tomada para análisis

7. Características de presentación

7.1. Límite de detección

Liquidos (directo) Alimentos sólidos *

Teobromina 0,5 mg / L 25 mg / kg
Cafeína 0,5 mg / L 10 mg / kg
* Suponiendo 1 g diluido a 50 ml de teobromina

7.2. Parcialidad

Recuperación (media) Desviación estándar de recuperación

Alimentos Bebidas Alimentos Bebidas

Teobromina 99,2% 2,8%
Cafeína 104,3% 3,3%
Teobromina enriquecida a un nivel de 50 mg / L en chocolate

- 9-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

7.3. Precisión

Diferencia absoluta Desviación Estándar

Alimentos Bebidas

31,6 mg / kg
Teobromina (10 muestras en el rango de 823 a
3117 mg / kg)
1,2 mg / L
Cafeína (14 muestras en el rango de 12 a
91 mg / L)

- 10-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

Apéndice 2

Datos de prueba de anillo

Origen Teobromina (g / 100g) Cafeína (g / 100g) Alcaloide total (g / 100g)

Laboratorio 1 Laboratorio 2 Laboratorio 3 Laboratorio 4 Laboratorio 5 Laboratorio 1 Laboratorio 2 Laboratorio 3 Laboratorio 4 Laboratorio 5 Laboratorio 1 Laboratorio 2 Laboratorio 3 1 Laboratorio 4 Laborat

A 1,18 1,17 - 1,22 1,20 0,26 0,27 - 0,24 0,26 1,45 1,44 1,54 1,46 1,46 1,527
Venezuela
B 1,18 1,26 - 1,26 1,20 0,26 0,29 - 0,25 0,26 1,44 1,55 1,57 1,51 1,46 1,536

A 1.04 1.07 - 1,10 1,03 0,15 0,16 - 0,14 0,15 1,19 1,23 1,30 1,24 1,18 1,241
Papúa Nueva Guinea
B 1.02 1.11 - 1,05 1,04 0,15 0,16 - 0,13 0,15 1,16 1,27 1,31 1,18 1,18 1,282

A 1,15 1,18 - 1,20 1,17 0,19 0,21 - 0,19 0,19 1,35 1,39 1,44 1,39 1,36 1,442
Ecuador
B 1,15 1,27 - 1,21 1,18 0,19 0,22 - 0,18 0,19 1,34 1,49 1,43 1,39 1,37 1,443

A 1,19 1,23 - 1,25 1,18 0,10 0,11 - 0,10 0,10 1,30 1,34 1,40 1,35 1,28 1,419
Santo Tomé
B 1,17 1,39 - 1,25 1,19 0,10 0,12 - 0,10 0,11 1,27 1,51 1,41 1,35 1,29 1,425

A 1,12 1,15 - 1,18 1,12 0,16 0,18 - 0,15 0,16 1,28 1,33 1,41 1,33 1,28 1,381
Madagascar
B 1,11 1,23 - 1,15 1,13 0,16 0,18 - 0,15 0,15 1,27 1,41 1,41 1,30 1,28 1,385

A 1,20 1,29 - 1,20 1,21 0,16 0,17 - 0,13 0,14 1,36 1,46 1,48 1,33 1,36 1,442
Tanzania
B 1,16 1,26 - 1,22 1,21 0,15 0,17 - 0,13 0,15 1,32 1,43 1,49 1,35 1,36 1,443

A 1,11 0,11 1,22

NIST 2384
B 1,10 0,11 1,21

Valores de referencia para NIST CRM 2384: teobromina 1,16% ± 0,11%, cafeína 0,11% ± 0,05%

Notas:
1. El laboratorio 3 solo midió los alcaloides totales mediante un método espectrofotométrico
2. Lab 5 utilizó HPLC para la determinación de teobromina y cafeína y midió los alcaloides totales mediante un método
espectrofotométrico

Análisis estadístico de los datos de prueba de anillo

Origen Theobr o la mía (g / 100 g) Cafeína (g / 100g) Total UNA lcaloide (gramo /100 gramos)

Max Min Cra Max Min Cra Max Min Cra

Venezuela 1,26 1,17 1,21 0,29 0,24 0,26 1,57 1,44 1,49

Papúa Nueva Guinea 1,11 1.02 1.06 0,16 0,13 0,15 1,31 1,16 1,23

Ecuador 1,27 1,15 1,19 0,22 0,18 0,20 1,49 1,34 1,40

Santo Tomé 1,39 1,17 1,25 0,12 0,10 0,11 1,51 1,27 1,36

Madagascar 1,23 1,11 1,16 0,18 0,15 0,16 1,41 1,27 1,34

Tanzania 1,29 1,16 1,22 0,17 0,13 0,15 1,49 1,32 1,39

- 11-
 Revista de la Asociación de Analistas Públicos (en línea) 2012 40 01-12
A Richards et al

Apéndice 3

Separación típica de alcaloides y aditivos alimentarios

utilizando HPLC-DAD

DAD1 A, Sig = 205,12 Ref = 450,100 (L: \ 2 \ DATA \ 0358 \ BW081103.D)

DAD1 B, Sig = 231,12 Ref = 450,100 (L: \ 2 \ DATA \ 0358 \ BW081103.D)

DAD1 C, Sig = 256,20 Ref = 450,100 (L: \ 2 \ DATA \ 0358 \ BW081103.D)

mAU

400
Acido sorbico
Sacarina

Aspartamo
Teofilina

Propyl Paraben
Etil Pararben
Cafeína

300
Ácido benzoico
Acesulfamo K

Teobromina

Paraben de metilo
200
Vanilina

Etil vainillina

Sulfato de quinina
100

5 10 15 20 25 30 35 40min

- 12-