LABORATORIO N°01

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LOS HONGOS

I.- INTRODUCCIÓN

a) OBSERVACIÓN DE LOS HONGOS

Frecuentemente pueden observarse crecimiento de hongos sobre los alimentos y otros

materiales. Se examinan estos sustratos con un lente simple pueden distinguirse el
cuerpo vegetativo formado por una masa de filamentos ramificados e entrelazados
denominada Micelio. Cada filamento de micelio constituye una Hifa. En algunos
hongos, el protoplasma recorre las hifas en forma interrumpida, constituyendo hifas
Aceptadas o Cenocíticas. Las hifas de otros hongos tienen paredes transversales
llamadas septos con uno o varios poros que permiten el paso del protoplasma. A este
tipo de hifas se les denomina Sentadas. Los hongos se reproducen asexualmente a
través de esporas asexuales desarrolladas dentro de un esporangio, se denominan
Esporangios horas. Si las esporas se reproducen libremente en el extremo o hallado
de las hifas, se denominan Conidios horas.

Existen hongos unicelulares que no forman estructuras filamentosas, estos reciben el

nombre de levaduras y pueden distinguirse de las bacterias por su mayor tamaño y por
la presencia de un núcleo simple.

Ocasionalmente puede observarse el desarrollo de estructuras conspicuas

denominadas Cuerpos Fructíferos los cuales portan las esporas sexuales de
reproducción. Estas estructuras se utilizan como base de la clasificación natural de los
hongos. De esta manera se definen tres divisiones: Zygomicota, Ascomiceta y
Basidiomycota.

El micelio de los Zygomycota es aceptado excepto en las estructuras de reproducción.

Los miembros de esta división forman esporas asexuales de tipo esporangios horas.
Las esporas sexuales son la denominadas Zigosporas que desarrollan en ausencia de
un cuerpo fructífera.

Los hongos al igual que la mayoría de las bacterias son heterótrofos, ningún hongo es
capaz de crecer bien en ausencia de sustancias alimenticias orgánicas.
Ningún hongo posee pigmentos fotosintética antes y ninguno es capaz de utilizar el
dióxido de carbono. Sin embargo, en presencia de un suministro exterior de azucares
de otro alimento orgánico, muchos hongos exhiben una sorprendente capacidad de
síntesis y produce una gran variedad de sustancias orgánicas complejas.

La mayor parte de hongos son filamentosos. Los filamentos conocidos por hilos están
ordinariamente muy ramificados y forman colectivamente el talo vegetativo o Micelo.
En los hongos superiores las hifas pueden agregarse para formar estructuras sólidas
complejas que en algunas especies pueden alcanzar un tamaño muy considerado.

Los Ascomycotas tienen micelio septado. La reproducción asexual es muy variada

involucrando procesos de fisión, gemación, fragmentación, formación de
Clamidiosporas o formación de conidias, dependiendo de las especies y de las
condiciones ambientales.

La fisión y la gemación son comunes en levaduras mientras que la mayoría de

ascomicetos forman uno o varios grupos de esporas terminales llamadas Conidio que
desarrollan a partir de hifas ramificadas llamadas Conidióforos y Esterigmas.

Las esporas sexuales son llamadas Ascosporas desarrolladas dentro de sacos y

protegidos en cuerpos fructíferos denominados Ascos carpos. Estas estructuras
pueden ser de tres tipos: CLEISTOTECIO, PERITECIO Y APOTECIO. dependiendo
de las características de cada grupo de Ascomycota.

Los presentantes de los Basidiomycota incluyen especies filamentosas levaduiforme.

Entre las formas filamentosas y levaduriforme. Entre las formas filamentosas puede
encontrarse especies microscópicas y macroscópicas. Estas últimas forman cuerpos
fructíferos visibles que portan las Basidios y estas a las Basiodiosporas o esporas
sexuales. Los basidiomicetos se reproducen asexualmente a través de conidias, el
micelio es septado y mayormente constituido en porciones anastomosadas a manera
de pseudo-tejido, que forma los Cuerpos. Fructíferos.

b) HABITAD:

Los hongos ocupan una amplia variedad de ambientes. La mayoría ocupa los lugares
húmedos de la tierra, aunque algunos en particular las especies de Aspergillus,
Penicilina pueden resistir unas condiciones de mayor sequedad. Muchos hongos son
parientes activos de plantas, incluso de las más importantes plantas cultivadas y
algunas especies causan enfermedades en el hombre y en los animales domésticos.
C) REPRODUCCIÓN:

La reproducción en los hongos se realiza habitualmente por esporas. Los más

frecuentes son unas células aisladas incoloras, pero pueden poseer gruesas
membranas esculpidas pueden llamar apéndices o pueden estar rodeadas de una
cubierta gelatinosa. La mayor parte de los hongos producen más de una especie de
esporas, cuando las condiciones son favorables al crecimiento de estas.

La mayoría de los hongos son muy variables, tanto en condiciones naturales como en
el cultivo de laboratorio. Algunas veces la variación esta inducida por cambios en las
condiciones ambientales y el hongo regresa a la forma manual cuando revierten los
cambios ambientales.

También ocurren al tener una base genética de los cultivos de placas Petri se pueden
producir sectores que difiere del resto del cultivo con algunas características, como la
forma, el color, la velocidad de crecimiento y la intensidad de esporulación.

d) VARIACIÓN AMBIENTAL:

Los hongos son afectados por muchas influencias ambientales, como la naturaleza y
la concentración del suministro nutritivo, la humedad, la temperatura, la luz y la
concentración de hidrogeniones. Los cambios de estos factores pueden inducirnos
cambios tan grandes en la morfología, que hace difícil el reconocimiento del hongo.

e) VARIACIÓN GENÉTICA:

Los estudios recientes sobre las bases genéticas de la variación en los hongos han
demostrado que son válidos los mismos principios que para los organismos
superiores.

II.- OBJETIVOS:

 Observar el desarrollo de hongos miliares y levaduriformes y sustratos de

diferentes orígenes e identificación de los géneros más frecuentes.
 Aislar en medio de cultivo los diferentes géneros de hongos que frecuenta el
medio ambiente y determine sus características.
 Determinar las características del desarrollo vegetativo de los hongos a través
de un cultivo en cámara húmeda y mediante observaciones periódicas al
microscopio.
 MATERIALES Y METODOS:

 Material infectado
 Lamina porta y cubre objeto
 Solución colorante: azul de metileno
 Dispositivo para cultivo en cámara húmeda
 Asa de siembra con mango de kolle
 Tubos de ensayo con tapa estériles
 Placa petri Pyrex estériles
 Agua destilada estéril
 Gradilla de tubos
 Lunas de reloj, espátula y baguetas
 Vasos precipitados y Erlenmeyers
 Probetas y Pipetas estériles
 Goteros
 Varilla de Vidrio en *U*
 Gillette estéril
 Mechero Bunsen
 Incubadora
 Estufa
 Autoclave
 Balanza Analítica
 Microscopio
 Aceite de Inmersión.

REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

 Agua destilada
 Agua Peptonada
 Agar Saboraud
 Agar Nutritivo
 Agar Plate Count
PROCEDIMIENTOS:

OBSERVACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS.

a). - OBSERVACIÓN MACROSCOPICA.

 Observe cuidadosamente cada substrato infectado y determine el tipo de

colonia que desarrolla.
 Describa el aspecto externo de las colonias de hongos.

b). - OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA.

 Coloque una gota de azul de metileno en una porta objetos limpio y drenado.
 Con ayuda del asa de kolle en forma de gancho o de un estilete, extraiga una
pequeña cantidad del micelio de una muestra y colóquelo en la gota de
colorante.
 Coloque sobre la preparación la lámina cubre objeto.
 Observe al microscopio bajo el objetivo de 10-40 de aumento.
 Reconozca las estructuras más características del cuerpo vegetativo del
hongo.
 Con la ayuda de láminas referentes trate de identificar él o los géneros que
observe.

AISLAMIENTO DE HONGOS DEL MEDIO AMBIENTE.

 Elija un punto determinado del ambiente que quiera evaluar.

 Destape la placa Petri exponiendo el medio de cultivo al aire (se asume que las
esporas de hongo se encuentran suspendidas).
 El tiempo de exposición puede ser de 5 a 10 minutos, vuelva a tapar la placa,
identifíquela con su nombre, grupo y el lugar de muestreo.
 Trabaje de manera similar para cada placa y lugar.
 En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 ºC por 4 a 5 días.
 Transcurrido el tiempo, examine las placas y realiza una descripción detallada
de las mismas.
PREPARACIÓN DE MEDIOS:

a). -Preparación del Agar Nutritivo.: Pesar 2 gr. de agar nutritivo y disolverlo en 100
ml de agua destilada. Licuarlo y luego colocar 9 ml de este en 3 tubos y luego
esterilizar.

b). -Preparación de Agua Peptonada.: Pesar peptona al 0.1% para 120 ml de agua
destilada, es decir pesar 0.012 gr. de peptona. Luego colocar también 9 ml en 3 tubos
y luego llevar a esterilizar en la autoclave a temperatura de 121ºC por un espacio de
15minutos.

CONTEO EN PLACAS.

En teoría, la enumeración de bacterias y hongos en muchos tipos de especímenes se

basa en el supuesto de que cada microorganismo dará origen una colonia después de
la incubación en medios adecuados. Una cantidad medida del espécimen o de una
dilución de la misma mezcla en una placa petri esterilizada que contiene agar
derretido. Después de la incubación se cuenta el número de colonias que están
creciendo en el agar, para obtener el cálculo de la población bacteriana del espécimen
original. Aunque existen diversos factores que limitan contra este como un método
inexacto, la técnica es sencilla y rinde resultados bastante satisfactorios para el uso
rutinario.

 Observe la placa contra el fondo iluminado y cuente él número de colonias.

 Multiplique el número de colonias por la dilución de la muestra.
 Escoger la placa que contenga 30 – 300 colonias.

Para evitar una actitud física y sin embargo expresar los resultados numéricos
mediante un método conforme con la precisión de la técnica empleada número
registrado de bacteria por ml no debe incluir más de 2 cifras significativas. Por
ejemplo, un conteo de 142 se registra como 140 y un conteo de 155 como 160 y
mientras que un conteo de 35.

CULTIVO EN CAMARA HUMEDA.

Un dispositivo para cultivo en cámara húmeda es un sistema que consta de una placa
Petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio de “U “que soporta dos
laminas porta y cubre objetos. Asépticamente se selecciona una pequeña porción de
medio de cultivo estéril (Agar Saboraud), y se coloca sobre la lámina porta objetos.
Realizada la siembra del hongo en estudio, la preparación se cubre con la otra lamina
y el papel filtro humedece conservándola asepsia. La placa es incubada a temperatura
ambiente (20 – 25º C) por 4 a 5días.

PROCEDIMIENTO:
 1. Utilizando aguja de kolle o estilete, pique una colonia y extraiga una fracción
mínima de esporas o micelio.
2. En forma aséptica deposite esta fracción sobre la porción de agar dispuesta
en la porta objeto de la cámara húmeda.
3. Con la ayuda de una pinza estéril cubra cuidadosamente la preparación con la
lámina cubre objetos.
4. Humedezca el papel filtro de la placa con agua destilada estéril.
5. Incube la placa a temperatura ambiente (20 – 25 º C).
6. Examine diariamente al microscopio la lámina sembrada hasta verificar el
completo desarrollo del hongo. Retire cada vez la lámina de cultivo de la
cámara húmeda y una vez realizada la observación vuélvala a su lugar
cuidando de mantener la humedad constante, si es necesario añada más
agua al sistema.
7. Observa la germinación de las esporas, el crecimiento y ramificación del
micelio, la aparición de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras
de reproducción.
8. Con la ayuda de un manual de identificación de hongos determine el género
correspondiente.
9. Elabore en detalle los esquemas de cada etapa de desarrollo.

VI- RESULTADO Y DISCUSION

VII.- RECOMENDACIONES

VIII.-CONCLUSIONES

IX.- CUESTIONARIO:

1.Defina: Factores intrínsicos, Factores extrínsecos, microorganismos

endógenos, microorganismos exógenos.

2. ¿Qué consideraciones se deben tener para elegir la Temperatura de

incubación?

3.Explique los microorganismos como productores de almidón.

4. ¿Cuáles son los controles de calidad que se realizan durante la elaboración de

productos de confitería?

5. Explique sobre las levaduras